PLoS ONE: forhøyede nivåer av G-quadruplex formasjonen i menneskelige magen og leverkreft Vev

Abstract

Fire-strandet G-quadruplex DNA sekundære strukturer har nylig blitt visualisert i kjernen av menneskelige dyrkede celler. Her viser vi at BG4, en G-quadruplex-spesifikt antistoff, kan brukes til å farge DNA-G-quadruplex strukturer i pasientavledet vev ved hjelp av immunhistokjemi. Vi observere en signifikant forhøyet antall av G-quadruplex-positive kjerner i humane kreft i leveren og mage sammenlignet med bakgrunns ikke-neoplastisk vev. Våre resultater tyder på at G-quadruplex formasjon kan oppdages og målt i pasient avledet materiale og at forhøyet G-quadruplex formasjonen kan være et kjennetegn ved enkelte kreft

Citation. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) forhøyede nivåer av G-quadruplex formasjonen i menneskelige magen og leverkreft vev. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10,1371 /journal.pone.0102711

Redaktør: Mark Isalan, Imperial College London, Storbritannia

mottatt: 28. mai 2014; Godkjent: 23 juni 2014; Publisert: 17.07.2014

Copyright: © 2014 Biffi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering:. Forfatterne takker Cancer Research UK for program stipend (C9681 /A11961) og kjerne institusjonell støtte til Balasubramanian lab, og for en PhD student for GB (http://www.cancerresearchuk.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

ikke-kanonisk G-quadruplex DNA sekundære strukturer kan dannes fra guanin-rikt DNA-sekvenser av den type G _{3 + N L1 G 3 + N L2 G 3 + N L3 G 3+ (N = noen base og L = loop) og slike sekvensmotiver er utbredt i hele det menneskelige genom [1], [2]. G-quadruplexes er fire-strandet strukturer som utgjør stabler av Tetrads dannet gjennom Hoogsteen hydrogen-binding av fire guanines koordinert av en sentral monovalent kation [3]. Oligonukleotider kastet inn i en G-quadruplex struktur in vitro
ha en høy termodynamisk stabilitet under nær-fysiologiske forhold, i samsvar med deres dannelse i celler [4]. Den forutsagte Plasseringen av G-quadruplex sekvensmotiver i regulatoriske regioner av genomet, slik som promotorer og telomerer, antyder at G-quadruplex strukturer kan ha viktige roller i genomet funksjon [5] - [7]. En rekke av helikaser som løser G-quadruplexes er blitt identifisert, og er antatt å bidra til normale genomfunksjoner, for eksempel replikasjon, transkripsjon og opprettholdelse av genomstabilitet [8]. Visualisering av DNA-G-quadruplex strukturer i humane celler har støttet eksistensen av G-quadruplexes i genomet [9]. I disse forsøk ble en meget selektiv G-quadruplex-spesifikt antistoff (BG4) generert av fagfremvisning, og som anvendes for å visualisere diskrete områder med G-quadruplex strukturer i kjernen av humane vev-kultur-cellelinjer. Dette antistoffet har gitt en mulighet til å undersøke den cellulære rollen til G-quadruplexes og også deres potensielle engasjement i sykdommen.}

G-quadruplex strukturer er blitt foreslått å være assosiert med cellulære funksjoner som replikasjon og transkripsjon. For eksempel kan G-quadruplex stabilisering av et lite molekyl undertrykke transkripsjon av visse onkogener og /eller indusere DNA-skade ved telomerer og onkogener fører til replikering defekter og celledød [10] - [17]. G-quadruplex strukturer kan også være knyttet til genom instabilitet og G-quadruplex sekvensmotiver har blitt funnet proksimale til DNA-stoppunkter og områder av somatisk kopiantall endringer sett i flere krefttyper [18], [19]. Helikaser som løser G-quadruplexes er også funnet lokalisert på steder av genom ustabilitet [20] - [22], og sykdommer som Bloom og Werner s syndromer, som viser økte nivåer av genom ustabilitet og en predisposisjon for kreft, er medvirkende mutasjoner i G -quadruplex-løse heli [23].

Gitt den potensielle forholdet mellom G-quadruplex strukturer og menneskelig sykdom, det er et viktig mål å ta opp om G-quadruplexes kan oppdages innen menneskelig vev. Vi undersøkte derfor påvisning av DNA-G-quadruplexes i pasient avledet vev, og om det er forskjeller i G-quadruplex nivåer mellom ikke-neoplastiske og kreft vev. Ved å ansette G-quadruplex-spesifikt antistoff, BG4, i immunhistokjemi med formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev microarray seksjoner, vi har oppdaget omfattende DNA G-quadruplex formasjonen i kjernen av menneskelig vev. Kvantifisering av BG4-positive cellekjerner avdekket mer omfattende dannelsen av G-quadruplex strukturer i mage og lever kreft sammenlignet med tilsvarende bakgrunn ikke-neoplastiske vev. Disse resultatene tyder på at behandling av G-quadruplex strukturer er mis-regulert i noen menneskelige kreftformer.

Resultater og Diskusjon

Vi dro ut for å demonstrere tilstedeværelse av G-quadruplexes i kjernen av menneskelige vev og å undersøke om noen forskjeller er lett synlig i pasient-avledet cancervev. Vår tilnærming var basert på påvisning av atom G-quadruplexes ved immunhistokjemi (IHC) med G-quadruplex-spesifikt antistoff, BG4, på ikke-neoplastiske og kreft microarray (TMA). Spesifisitet og selektivitet av BG4 for G-quadruplex strukturer og anvendelse av BG4 i immunfluorescens (IF) mikroskopi på humane celler er tidligere blitt beskrevet [9]. For å bestemme egnetheten av BG4 for IHC, vi først testet denne antistoff i et modellsystem ved hjelp av deler fra FFPE- celle pellets av MDA-MB-231 brystkreftceller som tidligere ble observert å vise atom G-quadruplex foci av IF mikros [9] . Som epitop gjenfinning, enten varme-mediert (i citrat-baserte pH 6,0 eller Tris /EDTA-baserte pH 9,0 buffer) eller enzymatisk (med proteinase K), er ofte nødvendig for å eksponere antigene seter før antistoffbinding, sammenlignet vi disse tre standard epitop gjenfinning pre-behandlinger. Etter BG4 inkubasjon ble farging utført ved inkubasjon med en sekundær anti-FLAG antistoff som gjenkjenner en FLAG tag epitop tilstede i BG4 antistoff, etterfulgt av Leica pepperrotperoksidase polymerbasert deteksjon ved hjelp av Bond IHC farging plattform. Etter denne protokollen, ble intens nukleær farging observert med BG4 bare etter epitop henting (figur 1B og S1). Ingen farging ble observert i fravær av forbehandling (figur 1A) og kontroller utføres i fravær av BG4 viste at epitopen henting med citrat-basert buffer ga mindre bakgrunn enn det med Tris /EDTA (figur 1C og S1), mens pre -rensing med proteinase K ført til ikke-spesifikk nukleær farging selv i fravær av BG4 (figur S1). Dessuten, etter epitop henting med citrat eller Tris /EDTA-buffer, DNase I-behandling før BG4 farging førte til en sterk reduksjon i BG4 atomsignalintensitet (figur 1D og S1), noe som ytterligere bekrefter påvisning av DNA-G-quadruplexes. Den kjernefysiske BG4 signal sees i IHC er i samsvar med den tidligere påvisning av BG4 foki i kjernen av vevkulturceller [9].

Etter å ha etablert et IHC protokoll for BG4, vi først bekreftet ved biopsi som ikke-neoplastiske humane vevsprøver kan farges ved hjelp BG4. Vanligvis observerte vi varierte BG4 fargemønstre på tvers av mange vev tyder på forskjeller i dannelsen av G-quadruplexes mellom vev og også mellom celler i det samme vev (figur S2). Disse resultatene indikerer at den totale dannelsen av DNA-G-quadruplexes i komplekse humant vev kan vurderes ved hjelp BG4 i IHC, for derved å forlenge den visualiseringen av G-quadruplex konstruksjoner utover IF mikroskopi i vevskulturceller. I en foreløpig undersøkelse av BG4 flekker på kreftvevet sammenlignet med bakgrunnen ikke-neoplastisk vev, forskjeller i BG4 fargeintensitet eller fordeling først på for det meste gir noe svar (data ikke vist), og i mange tilfeller strenge mengdebestemmelse var ikke mulig på grunn av betydelige forskjeller i morfologi og tilstedeværelsen av flere celletyper i ondartet versus ikke-neoplastisk vev. I motsetning til dette, for lever og mage, foreslo vår foreløpige undersøkelser at disse vev var lett målbart på grunn av et mer ensartet utseende innenfor og mellom ikke-neoplastiske og kreftvev. Vi brukte derfor Aperio Imagescope Nuclear (v9) bildeanalyse programvare for å kvantifisere andelen BG4-positive kjerner stede i TMA. En egen bildeanalyse klassifiserer ble utviklet for hver vevstype å nøyaktig identifisere og skille rørende objekter, med maligne og ikke-neoplastiske prøver scoret ved hjelp av de samme parametrene for nøyaktig sammenligning. Påfallende, i ni tilfeller som vi hadde likt leverkreft TMA kjerner med tilsvarende matchet bakgrunnen ikke-neoplastisk vev tatt fra samme pasient, observerte vi et langt større antall BG4-positive kjerner i kreft (gjennomsnitt 60,3 ± 5,4%) versus ikke-neoplastisk (gjennomsnitt 18,3 ± 2.12%) vev kjerner (figur 2). Når individuelle kreft fenotyper ble undersøkt, fant vi at både hepatocellulært karsinom (HCC) og intrahepatisk kolangiokarsinom (ICC) viste signifikant større atom BG4 farging sammenlignet med ikke-neoplastisk vev (figur 2A-D og G). Selv om HCC og ICC har forskjellige cellulære opprinnelse, utvikling fra hepatocytter eller gallegang cholangiocytes henholdsvis, som begge viste en større antallet og intensiteten til BG4-positive kjerner i forhold til den ikke-neoplastisk levervev. Videre er det i metastaser (isolert fra stor-celle lungekarsinom udifferensierte sites) en økning i BG4-positiv farging ble også registrert (Figur 2E-G). Vi har observert klare forskjeller mellom ikke-neoplastisk vev og tumor for en rekke forskjellige pasienttilfeller. Faktisk en bredere omfattende analyse av kreft og bakgrunns ikke-neoplastiske TMA kjerner inkludert enestående tilfeller viste igjen en økning i BG4-positive kjerner over HCC, ICC og metastaserende (figur 3A). Når alle tilfeller ble betraktet sammen, er et ~2.4 gangers økning i antall BG4-positive kjerner sett i leveren kreft sammenlignet med ikke-neoplastisk vev. (P < 0,001, figur 3B)

I likhet med den økning av G-quadruplex forekomst i leverkreft vev, en større enn 3-ganger økning i antall BG4-positive kjerner ble observert i mage adenokarsinom og signet ring karsinom sammenlignet med bakgrunnen ikke-neoplastisk vev tatt fra det samme individet (figur 4). En videre omfattende analyse av magekreft og ikke-neoplastiske vev innbefattende enestående tilfeller bekreftet økningen i antall BG4-positive kjerner sett i magekreft, sammenlignet med ikke-neoplastisk vev (figur 5). Faktisk, i enkelte magekreft undertyper, adenokarsinomer (som stammer fra kjertel epitel), signet ring cellekreft (adenokarsinomer preget av mucin deponering) og gastrointestinal stromal tumor (GIST, KIT-uttrykke sarkomer av mesenchymale opprinnelse), alle viste større antall BG4-positive kjerner i forhold til ikke-neoplastisk vev mage (figur 5A). Når alle tilfellene ble vurdert sammen, ~3.1 ganger flere BG4-positive kjerner ble funnet i kreft versus ikke-neoplastiske vev (Figur 5B, P < 0,001). Det er bemerkelsesverdig at flere magekreft sub-typer som har forskjellige årsaker og progresjon, er alle preget av økning i BG4 farging. Disse resultatene er derfor svært tankevekkende av en generell sammenheng mellom økt forekomst av G-quadruplex strukturer og magekreft utvikling.

I leveren og magen TMA, noen kreft vev kjerner viste liten eller ingen målbare BG4 flekker, kanskje reflekterer et problem i epitop stabilitet under kirurgisk biopsi samling eller alternativt peker til en reell variasjon i G-quadruplex formasjonen i disse spesielle vev. Det er likevel verdt å merke seg at i noe tilfelle var noen ikke-neoplastisk lever eller mage vev omfattende BG4-positive. Denne sistnevnte observasjon bekrefter videre at økningen i antall BG4-positive celler sett i kreft TMA kjernene reflekterer en sann forskjell i G-quadruplex nærvær mellom de ikke-neoplastiske og maligne tilstander. Analyse av G-quadruplex farging i andre kreftformer kan derfor være mulig og vår foreløpig analyse av pankreas vev tyder på at, mens BG4 farging i ikke-neoplastiske bukspyttkjertel er utbredt, er det en ~1.6-gangers økning av BG4 nukleær farging i adenokarsinom vev ( P <. 0.01, Figur S3)

Totalt våre resultater viser at G-quadruplexes kan visualiseres ved IHC i ikke-neoplastiske og kreft menneskelig vev utvide våre tidligere funn som avslørte tilstedeværelsen av G-quadruplex strukturer i kjerner av kulturcellelinjer [9]. Det er bemerkelsesverdig at vi har observert en økning i antall G-quadruplex-positive celler for enkelte kreftvevet sammenlignet med ikke-neoplastiske tilfeller. Dataene som vi presenterer i seg selv ikke forklare hvorfor flere G-quadruplexes er tydelig i tilfeller av mage og lever kreft. Men det er flere linjer av bevis i litteraturen som tyder på en mulig sammenheng eller utløsende kobling mellom G-quadruplexes og mekanismer som bidrar til kreftutvikling eller progresjon. For eksempel, G-quadruplex strukturer, hvis ikke er løst i løpet av DNA replikasjon, kan representere skjøre nettsteder som fremmer genom ustabilitet, som er et velkjent kjennetegn på kreft [24]. Faktisk er G-quadruplex sekvensmotiver funnet ved DNA brytningspunkter som fører til trans innenfor BCL2 genet i lymfomer og innenfor HOX11 genet i T-celle leukemi [25], [26]. Computational analyser har også foreslått mulige sammenslutninger av G-quadruplexes og stoppunkt regioner i ulike kreft [19].

Vi hypotese at en økning i genomisk G-quadruplexes i kreft kan oppstå fra mutasjoner i enzymer som behandler G-quadruplexes og /eller genomisk ustabilitet hos G-quadruplex nettsteder. For eksempel Fanconi anemi, Bloom og Werner sin syndromer, alle skjerm genom instabilitet med en predisposisjon for kreft [27] - [29] og skyldes mutasjoner i DNA helicase enzymer som har G-quadruplex-løse aktivitet [30] - [32] . Nye genom-wide studier har også pekt på anerkjennelse av G-quadruplex sekvenser av flere løse heli som ATRX, PIF1 og XPB /D [20] - [22]. Videre PIF1 har blitt foreslått å undertrykke genomisk ustabilitet i G-quadruplexes [22], mens ATRX tap er assosiert med kromosom ustabilitet i bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster [33], og XPD mutasjoner forstyrre nucleotide excision DNA-reparasjon som fører til kreft-utsatt sykdommer slike som Xeroderma pigmentosum [34].

det ser ut til at leveren og mage kreft er svært heterogen og er ikke preget av en felles genetisk signatur eller et sterkt representert kjører mutasjon som kan bare forklare den observerte økningen i G-quadruplex strukturer . Mens mange leverkreftformer er assosiert med hepatitt B- eller C-infeksjon, den patologiske informasjonen oppnådd med TMA indikerer at det ikke er noen sammenheng med BG4 farging. Som en del av fremtidig arbeid, vil det være av verdi å analysere ikke-neoplastiske og maligne tumorprøver for de tilfeller hvor hel-genom sekvensering er blitt anvendt for å belyse den genetiske bakgrunn av tumor /ikke-neoplastiske parene, for å etablere forholdet mellom genotype og G-quadruplex formasjonen i kreft.

i konklusjonen, rapporterer vi bruk av G-quadruplex-spesifikt antistoff, BG4, i IHC flekker forsøk på menneske ikke-neoplastiske og kreft vev. Denne studien har gjort oss i stand til å identifisere en betydelig høyere forekomst av DNA G-quadruplex strukturer i kjernen av mage og lever kreftceller sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastiske vev. Vi hypotese at disse forskjellene kan være avhengig av endringer i cellulære prosesser som regulerer genom stabilitet eller endringer i kromatin staten ved G-quadruplex steder i kreftvev. Våre resultater støtter muligheten for at kreftceller kan gi et vindu av selektivitet som ville gjøre dem mer følsomme enn ikke-neoplastiske celler mot et lite molekyl G-quadruplex-målrettingsstrategien.

Materialer og metoder

Fiksering, embedding, seksjonering og farging av celle pellets ble utført av histopatologi kjernetjenesten ved Cancer Research UK Cambridge Institute. Immunhistokjemi (IHC) ble utført ved bruk av standard metoder på en automatisert Leica Bond plattform med mindre variasjoner. I korthet vevene ble fiksert i 24 timer ved romtemperatur (RT) i 10% nøytral buffret formalin og bearbeidet ved hjelp av et Leica ASP300 vev prosessor med de-hydratisering gjennom en gradert etanolserie, å fjerne i xylen og infiltrering med smeltet parafinvoks. Innebygging ble utført på en Leica EG1160 Inkludering stasjon og snitt ble kuttet på 3 um med en mikrotom, fløt på et vannbad innstilt på ~45-50 ° C til glatt og flat, før oppsamling på et objektglass og tørking ved 60 ° C i 1 time. De-voksing og re-hydrering ble utført ved hjelp av en automatisert Leica ST5020 Multistainer. MDA-MB-231 human bryst adenokarsinomceller ble oppnådd fra ATCC LGC Standards. For MDA-MB-231-cellepellets ble epitop gjenfinning utført ved 100 ° C i 20 min med Bond epitop gjenfinning Oppløsning 1 (citrat-basert buffer pH 6,0) eller Bond epitop henting løsning 2 (Tris /EDTA-basert buffer pH 9,0) eller ved 37 ° C i 10 minutter med enzym-Bond forbehandling kit (100 ug /ml proteinase K i Tris-bufret saltvann, overflateaktivt middel og 0,35% roClin 950) for å finne den beste tilstand. Kommersielt tilgjengelige menneskelige microarray med riktig etisk godkjenning i opprinnelseslandet ble kjøpt fra Insight Bio UK (for amerikanske Biomaks Inc. arrays) og BioCat, Tyskland eller Stretton Scientific, UK (for Accumax, Isu Abxis arrays). Epitop gjenfinning ble utført ved 100 ° C i 20 min med citratbuffer. BG4 farging ble utført ved romtemperatur på en automatisert Leica Bond instrument med et kanin polymer kit (Leica) etter en 15 minutters inkubering med BG4 og en 8 minutters inkubasjon med et anti-FLAG kanin polyklonalt antistoff (Cell Signaling Technology). Platene ble deretter motfarget i 5 minutter med 0,02% hematoksylin for å visualisere cellekjerner. De-hydrering og clearing ble gjort på en automatisert Leica ST5020 Multistainer og montering ble utført på en automatisert glass coverslipper Leica CV5030. Lysbilder ble skannet med en Aperio XT120 lysbilde scanning system (Leica) og bilder analysert ved hjelp av Aperio Imagescope Nuclear v9 programvare. Statistiske analyser og P-verdier ble beregnet ved hjelp av t-test. Frekvens-distribusjonsgrafer ble plottet ved hjelp GraphPad Prism (GraphPad Software).

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
BG4 flekker på MDA-MB-231 celler parafininnstøpte pellets. A. Menneske MDA-MB-231 brystkreftcelle pellets ble fikset, parafin-embedded og behandlet for IHC ved bruk av G-quadruplex-spesifikt antistoff BG4. Sterk BG4 flekker (brun) er tydelig i cellekjernene følgende epitop henting med Tris /EDTA-basert buffer pH 9,0. Målestokken tilsvarer 20 um. Kjerner er kontra med hematoksylin (blå). B. Sterkt BG4 farging (brun) er tydelig i cellekjernene følgende epitop gjenfinning med proteinase K. C. Ingen nukleær farging observert i fravær av BG4 antistoffet etter Tris /EDTA-epitop henting. D. Ingen nukleær farging ble observert etter DNase-behandling før BG4 farging etter epitop gjenfinning med EDTA. E. Høye nivåer av ikke-spesifikk farging i fravær av BG4 etter epitop henting med proteinase K.
doi: 10,1371 /journal.pone.0102711.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Ikke-neoplastiske menneskelig vev vise variabel BG4 farging. Ikke-neoplastiske vev ble farget av IHC ved bruk av G-quadruplex-spesifikt antistoff BG4. A. BG4 farging (brun) i nyrebark viser et utvalg av nukleær farging intensiteter i glomeruli og tilhørende strukturer. Cellekjerner ble motfarget med hematoksylin (blå). Målestokken svarer til 50 um B. Svakt positiv BG4 farging er sett i oppsamlings tubulære kjernene i nyremarg. C. Skin viser et utvalg av BG4 intensiteter i epidermis med positive og negative kjerner spredt utover, mens dermis er for det meste positivt. D. De fleste kjerner i tykktarmen er BG4-positive. E. I livmor kroppen, er stratifisert plateepitel i stor grad BG4-negative, mens positiv farging sees mer overfladisk. F. Gjennom bryst duktale lobules, både korg og luminal cellene vise generell sterk BG4 farging med bare sporadiske negative celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0102711.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Forhøyet nærvær av G-quadruplex strukturer i menneskelige bukspyttkjertelen kreft vev. Ikke-neoplastiske og kreft i bukspyttkjertelen vev ble farget av IHC ved bruk av G-quadruplex-spesifikt antistoff BG4, og antall BG4-positive kjerner ble scoret ved hjelp av Aperio Imagescope programvare. A. kjerner av ikke-neoplastisk vev bukspyttkjertel viser moderat BG4 farging (brun) med flere ufargede kjerner også til stede. Cellekjerner ble motfarget med hematoksylin (blå). Målestokken tilsvarer 50 um. B. BG4 farging i pankreas adenokarsinom vev er mer omfattende med større intensitet. C. Generell kvantifisering av antallet BG4-positive kjerner på tvers av alle ikke-neoplastiske og kreft i bukspyttkjertelen vev. Feilfelt representerer standardavvik * P < 0,01, n = 6 og 12 for ikke-neoplastiske og kreft kjerner, henholdsvis
doi:. 10,1371 /journal.pone.0102711.s003 plakater (TIF)

• PLoS ONE: Alltid Gamble på tom mage: Hunger er assosiert med Fordelaktig Beslutning Making
• PLoS ONE: Uventet Headless og hale fisk i magen innhold Shortfin Mako Isurus oxyrinchus