PLOS ONE: des niveaux élevés de formation G-quadruplex dans l'estomac humain et cancer du foie Tissues

Résumé

G-quadruplex structures secondaires ADN Quatre brin ont été récemment visualisés dans les noyaux des cellules humaines en culture. Ici, nous montrons que BG4, un anticorps spécifique G-quadruplex, peut être utilisé pour colorer l'ADN structures G-quadruplex dans les tissus provenant de patients utilisant immunohistochimie. Nous observons un nombre significativement plus élevé de noyaux G-quadruplex-positifs dans les cancers humains du foie et l'estomac par rapport au fond du tissu non néoplasique. Nos résultats suggèrent que la formation G-quadruplex peut être détectée et mesurée en matière dérivé du patient et que la formation G-quadruplex élevée peut être une caractéristique de certains cancers

Citation:. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) Les niveaux élevés de formation G-quadruplex dans l'estomac humain et cancer du foie Tissues. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10.1371 /journal.pone.0102711

Editeur: Mark Isalan, Imperial College London, Royaume-Uni

Reçu: 28 mai 2014; Accepté le 23 Juin 2014; Publié le 17 Juillet, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Biffi et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

Financement:. Les auteurs remercient Cancer Research UK pour la délivrance du programme (C9681 /A11961) et le financement institutionnel de base au laboratoire Balasubramanian, et pour une bourse de doctorat pour GB (http://www.cancerresearchuk.org). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction structures secondaires
ADN G-quadruplex

non-canonique peuvent être formés à partir de séquences d'ADN riches en guanine du type G _{3 + N L1 G 3 + N L2 G 3 + N L3 G 3+ (N = importe quelle base et l = boucle) et les motifs de séquence sont répandues dans tout le génome humain [1], [2]. G-quadruplex sont des structures qui comprennent des piles de tétrades formés à travers Hoogsteen liaison hydrogène de quatre guanines coordonnés par un cation monovalent central [3] quatre-bloqués. Oligonucleotides plié en une structure G-quadruplex in vitro
ont une stabilité thermodynamique élevée dans des conditions quasi-physiologique, conformément à leur formation dans les cellules [4]. La localisation prédite de motifs de séquences G-quadruplex dans les régions régulatrices du génome, tels que des promoteurs et des télomères, suggère que les structures G-quadruplexes peut avoir un rôle important dans le fonctionnement du génome [5] - [7]. Un certain nombre d'hélicases qui sont résolus G-quadruplex ont été identifiés et sont émis l'hypothèse de contribuer à des fonctions génomiques normales, telles que la replication, la transcription et le maintien de la stabilité du génome [8]. La visualisation de l'ADN structures G-quadruplex dans les cellules humaines a soutenu l'existence de G-quadruplex dans le génome [9]. Dans ces expériences, un anticorps G-quadruplex spécifique hautement sélectif (BG4) a été généré par phage display et utilisé pour visualiser des foyers discrets de structures G-quadruplexes dans les noyaux des lignées de cellules de culture de tissu humain. Cet anticorps a fourni une opportunité pour sonder le rôle cellulaire de G-quadruplex et aussi leur implication potentielle dans la maladie.}

structures G-quadruplex ont été proposés pour être associés à des fonctions cellulaires telles que la replication et la transcription. Par exemple, la stabilisation des G-quadruplexes par une petite molécule peut réprimer la transcription de certains oncogènes et /ou provoquer des lésions de l'ADN dans les télomères et des oncogenes conduisant à des défauts de réplication et de la mort cellulaire [10] - [17]. structures G-quadruplex peuvent également être liés à l'instabilité du génome et des motifs de séquence G-quadruplex ont été trouvés proximal à breakpoints d'ADN et les sites de nombre de copies somatique changements observés dans plusieurs cancers [18], [19]. Helicases qui résolvent G-quadruplex sont également trouvés localisés sur les sites de l'instabilité du génome [20] - mutations [22], et des maladies telles que Bloom et les syndromes de Werner, qui montrent des niveaux accrus d'instabilité du génome et une prédisposition au cancer, ont contribué à G hélicases -quadruplex-résoudre [23].

Compte tenu de la relation potentielle entre les structures G-quadruplex et la maladie humaine, il est un objectif important de se demander si G-quadruplex peuvent être détectés dans les tissus humains. Nous avons donc étudié la détection de l'ADN du G-quadruplex dans les tissus provenant de patients et s'il y a des différences dans les niveaux G-quadruplex entre les tissus non-néoplasiques et le cancer. En utilisant l'anticorps spécifique G-quadruplex, BG4, en immunohistochimie avec (FFPE) sections microarray de tissu paraffine fixés au formol, nous avons détecté répandue ADN formation G-quadruplex dans les noyaux des tissus humains. Quantification des noyaux cellulaires BG4 positifs a révélé la formation plus poussée des structures G-quadruplex dans les cancers de l'estomac et du foie par rapport à l'arrière-plan correspondant tissus non néoplasiques. Ces résultats suggèrent que le traitement des structures G-quadruplex est mal réglementées dans certains cancers humains.

Résultats et discussion

Nous avons cherché à démontrer la présence de G-quadruplex dans les noyaux des humains les tissus et à examiner si les différences sont facilement visibles dans les tissus cancéreux provenant de patients. Notre approche est basée sur la détection de G-quadruplex nucléaires par immunohistochimie (IHC) avec l'anticorps spécifique G-quadruplex, BG4, sur microréseaux de tissus non-néoplasiques et cancer (AGT). La spécificité et la sélectivité du BG4 pour les structures G-quadruplex et l'application de BG4 en immunofluorescence (IF), la microscopie sur des cellules humaines ont été décrites précédemment [9]. Pour déterminer la pertinence de BG4 pour IHC, nous avons d'abord testé cet anticorps dans un système de modèle à l'aide des sections de FFPE culots de cellules de-231 MDA-MB cellules du cancer du sein qui ont été observés auparavant pour afficher G-quadruplex nucléaire foyers par IF microscopie [9] . Comme la récupération de l'épitope, soit la chaleur à médiation (en base de citrate pH 6,0 ou Tris /à base d'EDTA pH 9,0 tampons) ou enzymatique (avec protéinase K), il est souvent nécessaire d'exposer des sites antigéniques avant liaison de l'anticorps, nous avons comparé ces trois épitope norme pré-traitements de récupération. BG4 après l'incubation, la coloration a été réalisée par incubation avec un anticorps secondaire anti-FLAG, qui reconnaît un marqueur épitopique présent dans l'anticorps FLAG BG4, suivie d'une détection à base de polymère peroxydase de raifort Leica en utilisant la plate-forme de coloration IHC Bond. Suite à ce protocole, une coloration nucléaire intense a été observée avec BG4 seulement après récupération des épitopes (figure 1B et S1). Aucune coloration n'a été observée en l'absence de prétraitement (figure 1A) et les contrôles effectués en l'absence de BG4 a montré que épitope avec un tampon à base de citrate a moins de fond que celle avec du Tris /EDTA (figure 1C et S1), tandis que les pré -traitement avec de la proteinase K a conduit à une coloration nucléaire non spécifique, même en l'absence de BG4 (figure S1). En outre, après l'extraction d'épitope avec du citrate ou de tampon Tris /EDTA, le traitement à la DNase I avant la coloration BG4 a conduit à une forte réduction BG4 nucléaire intensité du signal (figure 1D et S1), ce qui confirme en outre la détection de l'ADN du G-quadruplex. Le signal de BG4 nucléaire vu dans IHC est compatible avec la détection précédente de BG4 foyers dans les noyaux des cellules de culture de tissus [9].

Après avoir établi un protocole IHC pour BG4, nous avons d'abord confirmé que biopsié humaine non néoplasique des échantillons de tissus peuvent être colorées en utilisant BG4. En général, on a observé des motifs BG4 de coloration variées dans de nombreux tissus qui suggère des différences dans la formation de G-quadruplex entre les tissus et également entre des cellules dans le même tissu (figure S2). Ces résultats indiquent que la formation globale de l'ADN G-quadruplexes dans les tissus humains complexes peut être évaluée à l'aide BG4 dans l'IHC, prolongeant ainsi la visualisation des structures G-quadruplex au-delà SI microscopie dans des cellules de culture tissulaire. Dans une enquête provisoire de BG4 taches sur les tissus cancéreux par rapport avec le fond de tissu non néoplasique, les différences d'intensité ou de la distribution BG4 coloration apparaissaient souvent peu concluants (données non présentées), et dans de nombreux cas, la quantification rigoureuse n'a pas été possible en raison de différences significatives dans la morphologie et la présence de plusieurs types de cellules malignes par rapport à un tissu non néoplasique. En revanche, pour le foie et l'estomac, notre examen provisoire a suggéré que ces tissus ont été facilement quantifiables en raison d'une apparence plus uniforme à l'intérieur et entre des tissus non-néoplasiques et le cancer. Nous avons donc utilisé la Aperio ImageScope nucléaire (v9) le logiciel d'analyse d'images pour quantifier le pourcentage de noyaux de BG4 positifs présents dans le CGD. Une analyse d'image classificateur distinct a été développé pour chaque type de tissu pour identifier avec précision et toucher les objets séparés, avec les échantillons malignes et non néoplasiques marqué avec les mêmes paramètres pour la comparaison précise. Il est frappant, dans neuf cas pour lesquels nous avons eu un cancer du foie en double noyaux TMA avec l'arrière-plan adapté tissu non néoplasique correspondante provenant du même patient, nous avons observé un plus grand nombre de noyaux BG4-positifs dans le cancer (moyenne 60,3 ± 5,4%) par rapport à non néoplasique (moyenne 18,3 ± 2,12%) noyaux de tissus (figure 2). Lors de phénotypes cancéreux individuels ont été examinés, on a trouvé que les deux hépatocarcinome (HCC), et le cholangiocarcinome intrahépatique (ICC) a montré significativement plus élevée de coloration nucléaire BG4 par rapport à un tissu non néoplasique (figure 2A-D et G). Bien que HCC et ICC ont des origines cellulaires différentes, se développant à partir des hépatocytes ou cholangiocytes biliaires respectivement, les deux ont montré un plus grand nombre et l'intensité des noyaux BG4 positifs par rapport au tissu hépatique non néoplasique. En outre, dans les métastases (isolé à partir de indifférenciées sites de carcinome du poumon à grandes cellules) une augmentation de la coloration de BG4 positive a également été notée (Figure 2E-G). Nous avons observé de nettes différences entre les tissus non-néoplasiques et de la tumeur pour un certain nombre de cas différents patients. En effet, une analyse plus vaste du cancer et de fond non néoplasiques noyaux TMA y compris des cas inégalées à nouveau montré une augmentation dans les noyaux BG4 positifs à travers HCC, ICC et le carcinome métastatique (Figure 3A). Lorsque tous les cas ont été considérés ensemble, une augmentation de ~2.4 fois le nombre de noyaux BG4-positifs a été observée dans le cancer du foie par rapport à un tissu non néoplasique. (P < 0,001, figure 3B)

Similaire à la augmentation de l'incidence du G-quadruplex dans le tissu du cancer du foie, une augmentation de plus de 3 fois le nombre de noyaux BG4-positifs a été observée dans l'adénocarcinome de l'estomac et le carcinome à cellules de chevalière comparativement à fond non néoplasique tissus prélevés sur le même individu (Figure 4). Une analyse plus vaste du cancer de l'estomac et des tissus non néoplasiques, y compris des cas inégalés a réaffirmé l'augmentation du nombre de noyaux BG4 positifs observés dans le cancer de l'estomac par rapport aux tissus non-néoplasiques (Figure 5). En effet, dans le cancer de l'estomac individuel sous-types, adénocarcinomes (originaires de épithéliums glandulaires), carcinomes anneau sigillaire (adénocarcinomes caractérisés par la mucine dépôt) et les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST, KIT exprimant sarcomes d'origine mésenchymateuses), tous ont montré plus grand nombre de les noyaux BG4 positif par rapport au tissu de l'estomac non néoplasique (figure 5A). Lorsque tous les cas ont été examinés ensemble, ~3.1 fois plus de noyaux de BG4 positifs ont été trouvés dans le cancer par rapport à des tissus non néoplasiques (figure 5B, P < 0,001). Il est à noter que plusieurs sous-types de tumeurs de l'estomac, qui ont des étiologies et la progression, sont tous caractérisés par une augmentation de BG4 coloration. Ces résultats sont donc très évocateur d'un lien général entre une présence accrue des structures G-quadruplex et le développement du cancer de l'estomac.

Dans le foie et l'estomac AGT, certains noyaux de tissus cancéreux ont montré peu ou pas de coloration de BG4 quantifiable, peut-être reflétant un problème dans la stabilité de l'épitope lors de la collecte de biopsie chirurgicale ou encore montrant une variabilité réelle dans la formation G-quadruplex dans ces tissus particuliers. Il est cependant à noter que, dans aucun cas, tous les tissus du foie ou de l'estomac non néoplasique largement BG4 positif. Cette dernière observation confirme en outre que l'augmentation du nombre de cellules BG4 positives observées dans les noyaux cancer TMA reflète une vraie différence dans la présence G-quadruplex entre les états non néoplasiques et malignes. Analyse des G-quadruplex coloration dans d'autres cancers peut donc être possible et notre analyse préliminaire des tissus du pancréas suggère que, tandis que BG4 coloration dans le pancréas non néoplasique est très répandue, il y a une augmentation de ~1.6 fois de BG4 coloration nucléaire dans les tissus d'adénocarcinome ( P <. 0,01, Figure S3)

dans l'ensemble, nos résultats démontrent que G-quadruplex peuvent être visualisés par IHC dans les tissus non-néoplasiques et le cancer humain étendent nos constatations antérieures qui ont révélé la présence de structures G-quadruplex dans les noyaux des lignées cellulaires de culture [9]. Il est à noter que nous avons observé une augmentation du nombre de cellules G-quadruplex positif pour certains tissus cancéreux par rapport aux cas de non-néoplasiques. Les données que nous présentons ne le font pas en eux-mêmes expliquer pourquoi plus G-quadruplex sont apparents dans les cas de cancers de l'estomac et du foie. Cependant, il existe plusieurs sources de données dans la littérature qui suggèrent une association potentielle ou un lien de causalité entre G-quadruplex et les mécanismes qui contribuent au développement du cancer ou de la progression. Par exemple, les structures G-quadruplex, sinon résolu lors de la réplication de l'ADN, peuvent représenter des sites fragiles qui favorisent l'instabilité du génome, ce qui est une caractéristique bien connue du cancer [24]. En effet, des motifs de séquence G-quadruplex se trouvent à l'ADN Breakpoints qui conduisent à des translocations dans le gène BCL2 dans les lymphomes et dans le gène HOX11 dans les leucémies des cellules T [25], [26]. analyses computationnelles ont également suggéré des associations possibles de G-quadruplex et les régions des points d'arrêt dans divers cancers [19].

Nous émettons l'hypothèse que l'augmentation de la génomique G-quadruplex dans le cancer peut provenir de mutations dans les enzymes qui transforment G-quadruplex et /ou l'instabilité génomique dans les sites G-quadruplex. Par exemple, l'anémie de Fanconi, Bloom et de Werner syndromes, tout instabilité du génome d'affichage avec une prédisposition au cancer [27] - [29] et résultent de mutations dans les enzymes ADN hélicase qui ont des G-quadruplex-résolution de l'activité [30] - [32] . études pangénomiques récentes ont également mis en évidence la reconnaissance de séquences G-quadruplex par hélicases résolution supplémentaires tels que ATRX, PIF1 et XPB /D [20] - [22]. En outre, PIF1 a été proposé de supprimer l'instabilité génomique chez G-quadruplex [22], tandis que la perte ATRX est associée à une instabilité chromosomique dans des tumeurs endocrines du pancréas [33] et des mutations XPD perturber par excision de nucléotides réparation de l'ADN qui conduit à des maladies cancéreuses sujettes à de telles comme Xeroderma pigmentosum [34].

Il semble que les cancers du foie et de l'estomac sont très hétérogènes et ne sont pas caractérisées par une signature génétique commune ou une mutation de conduite hautement représenté qui peut simplement expliquer l'augmentation observée dans les structures G-quadruplex . Alors que de nombreux cancers du foie sont associés à l'infection par l'hépatite B ou C, l'information pathologique obtenu avec l'AGT indique qu'il n'y a pas de corrélation avec BG4 coloration. Dans le cadre des travaux futurs, il sera utile d'analyser des échantillons de tumeurs non-néoplasiques et malignes pour les cas où le séquençage du génome entier a été employé pour élucider le fond génétique de la tumeur /paires non néoplasiques, afin d'établir la relation entre le génotype et la formation G-quadruplex dans le cancer.

en conclusion, nous signalons l'utilisation de l'anticorps spécifique G-quadruplex, BG4, en IHC expériences de coloration des tissus non-néoplasiques et cancéreuses humaines. Cette étude nous a permis d'identifier une présence significativement plus élevée de l'ADN structures G-quadruplex dans les noyaux des cellules de l'estomac et le cancer du foie par rapport aux tissus non néoplasiques correspondants. Nous émettons l'hypothèse que ces différences pourraient dépendre des altérations des processus cellulaires qui régulent la stabilité ou les modifications du génome dans l'état de la chromatine au niveau des sites G-quadruplex dans les tissus cancéreux. Nos résultats confirment la possibilité que les cellules cancéreuses peuvent fournir une fenêtre de sélectivité qui les rendrait plus sensibles que les cellules non-néoplasiques vers un G-quadruplex-stratégie de ciblage de petites molécules.

Matériel et méthodes

Fixation, plongement, sectionner et la coloration des culots cellulaires ont été effectuées par le service de base de l'histopathologie au Research UK Cambridge Institute Cancer. Immunohistochimie (IHC) a été réalisée en utilisant des procédés standard sur une plate-forme Leica Bond automatisé avec des variations mineures. En bref, les tissus ont été fixés pendant 24 h à température ambiante (RT) dans 10% du formol tamponné neutre et traitées à l'aide d'un processeur de tissus Leica ASP300 avec de l'hydratation à travers une série d'éthanol gradué, de compensation dans le xylène et l'infiltration avec de la cire de paraffine fondue. Incorporation a été effectuée sur une station de Embedding Leica EG1160 et sections ont été coupées à 3 pm avec un microtome, flottaient sur un bain-marie réglé à ~45-50 ° C jusqu'à consistance lisse et plat, avant la collecte sur une lame de microscope et séchage à 60 ° C pendant 1 h. De-fartage et re-hydratation ont été effectuées en utilisant un Leica ST5020 Multistainer automatisé. MDA-MB-231 cellules d'adénocarcinome du sein humain ont été obtenues auprès de l'ATCC LGC Standards. Pour culots de cellules MDA-MB-231, la récupération de l'épitope a été réalisée à 100 ° C pendant 20 min avec des épitopes de Bond Solution 1 (à base de citrate tampon à pH 6,0) ou Bond solution de récupération de l'épitope 2 (Tris /base EDTA-tampon à pH 9,0) ou à 37 ° C pendant 10 minutes avec le kit Bond enzyme pré-traitement (100 pg /ml de proteinase K dans du Tris-solution saline tamponnée, tensioactif et 0,35% ProClin 950) pour trouver la meilleure condition. microréseaux de tissus humains disponibles dans le commerce avec l'approbation éthique appropriée dans le pays d'origine ont été achetés chez Perspicacité Bio UK (pour US Biomax Inc. tableaux) et BioCat, Allemagne ou Stretton scientifique, Royaume-Uni (pour Accumax, tableaux Isu Abxis). Epitope a été réalisée à 100 ° C pendant 20 min avec un tampon de citrate. BG4 coloration a été réalisée à température ambiante sur un appareil Leica Bond automatisé avec un kit de polymère de lapin (Leica) après une incubation de 15 min avec BG4 et une incubation pendant 8 min avec un anticorps polyclonal de lapin anti-FLAG (Cell Signaling Technology). Lames ont ensuite été contre-colorées pendant 5 minutes avec 0,02% de l'hématoxyline pour visualiser les noyaux cellulaires. De-hydratation et de compensation ont été effectuées sur un Multistainer Leica ST5020 automatisé, et le montage a été effectué sur un verre automatisé colleuse Leica CV5030. Les lames ont été scannée avec un système de balayage de diapositives Aperio XT120 (Leica) et des images analysées à l'aide du logiciel v9 Aperio ImageScope nucléaire. Les analyses statistiques et les valeurs P ont été calculées en utilisant le test t de Student. Fréquence des graphiques de distribution ont été tracées en utilisant GraphPad Prism (GraphPad Software).

Informations complémentaires
Figure S1.
BG4 coloration sur MDA-MB-231 culots cellulaires paraffine. A. Human MDA-MB-231 culots de cellules de cancer du sein ont été fixés, enrobés de paraffine et traitées pour IHC en utilisant l'anticorps BG4 spécifique G-quadruplex. coloration BG4 Strong (brun) est apparente dans les noyaux des cellules après le prélèvement de l'épitope avec Tris /EDTA base-tampon à pH 9,0. La barre d'échelle correspond à 20 um. Nuclei sont contre l'hématoxyline (bleu). B. coloration BG4 Strong (brun) est apparente dans les noyaux des cellules après le prélèvement de l'épitope avec protéinase K. C. Aucune coloration nucléaire est observée en l'absence de l'anticorps BG4 après récupération des épitopes Tris /EDTA. D. Aucune coloration nucléaire est considérée traitement DNase suivante avant BG4 coloration après récupération des épitopes avec EDTA. niveaux élevés de E. coloration non spécifique en l'absence de BG4 après récupération des épitopes avec protéinase K.
doi: 10.1371 /journal.pone.0102711.s001
(TIF)
Figure S2. tissus humains
non néoplasiques montrent variables BG4 coloration. tissus non néoplasiques ont été colorées par IHC en utilisant l'anticorps BG4 spécifique G-quadruplex. A. BG4 coloration (brun) dans le cortex rénal montre une gamme d'intensités de coloration nucléaire dans les glomérules et les structures associées. Les noyaux cellulaires ont été contre l'hématoxyline (bleu). La barre d'échelle correspond à 50 um B. Faiblement coloration BG4 positive est vu dans les noyaux tubules collecte de la moelle rénale. C. peau montre une gamme d'intensités BG4 dans l'épiderme avec des noyaux positifs et négatifs dispersés à travers, tandis que le derme est essentiellement positive. D. La plupart des noyaux dans le côlon sont BG4-positive. E. Dans le corps de l'utérus, l'épithélium malpighien est largement BG4 négatif alors coloration positive est considérée plus superficiellement. F. Tout au long des lobules canalaires du sein, les cellules myoépithéliales et luminales montrent une forte coloration générale de BG4 avec des cellules négatives occasionnelles
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002
(TIF)
Figure S3. présence
Elevated des structures G-quadruplex dans les tissus du cancer du pancréas humain. tissus pancréatiques non néoplasiques et le cancer ont été colorées par IHC en utilisant l'anticorps BG4 spécifique G-quadruplex, et le nombre de noyaux BG4-positifs a été marqué en utilisant le logiciel Aperio ImageScope. A. Les noyaux de non-néoplasiques du pancréas montrent tissulaire modérée coloration BG4 (brun) avec de nombreux noyaux non colorés également présents. Les noyaux cellulaires ont été contre l'hématoxyline (bleu). La barre d'échelle correspond à 50 um. B. BG4 coloration dans le tissu adénocarcinome pancréatique est plus étendue avec plus d'intensité. quantification C. globale du nombre de noyaux BG4 positif dans tous les tissus cancéreux non néoplasiques et pancréatiques. Les barres d'erreur représentent la s.e.m. * P < 0,01, n = 6 et 12 pour des noyaux non-néoplasiques et le cancer, respectivement
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s003
(TIF)

• PLOS ONE: Toujours Gamble sur un estomac vide: La faim est associée à la prise de décision Avantageux
• PLOS ONE: Headless Unexpected et Tailless poisson dans le contenu de l'estomac du requin-taupe bleu Isurus oxyrinchus