PLoS ONE: verhoogde niveaus van G-Quadruplex Formation in menselijke maag en leverkanker Tissues

Abstract

Vier-stranded G-quadruplex DNA secundaire structuren zijn onlangs gevisualiseerd in de kernen van humane gekweekte cellen. Hier laten we zien dat BG4, een G-quadruplex-specifiek antilichaam, kan worden gebruikt om DNA-G quadruplex structuren vlek intramurale afgeleide weefsels middels immunohistochemie. We nemen een significant verhoogd aantal G-quadruplex-positieve kernen in menselijke kankers van de lever en de maag ten opzichte van de achtergrond van niet-neoplastisch weefsel. Onze resultaten suggereren dat G-quadruplex formatie kan worden gedetecteerd en gemeten in de patiënt afgeleide materiaal en dat verhoogde G-quadruplex formatie kan een kenmerk van sommige vormen van kanker te zijn

Visum:. Biffi G, Tannahill D, Miller J, Howat WJ, Balasubramanian S (2014) verhoogde niveaus van G-Quadruplex Formation in menselijke maag en leverkanker Doekjes. PLoS ONE 9 (7): e102711. doi: 10.1371 /journal.pone.0102711

Uitgever: Mark Isalan, Imperial College in Londen, Verenigd Koninkrijk

Ontvangen: 28 mei 2014; Aanvaard: 23 juni 2014; Gepubliceerd: 17 juli 2014

Copyright: © 2014 Biffi et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. De auteurs danken Cancer Research UK voor programma-subsidie ​​(C9681 /A11961) en de kern institutionele financiering aan de Balasubramanian lab, en voor een PhD studententijd voor GB (http://www.cancerresearchuk.org). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Niet-canonieke G-quadruplex DNA secundaire structuren kunnen worden gevormd uit guanine-rijke DNA-sequenties van het type G _{3 + N L1 G 3 + N L2 G 3 + N L3 G 3+ (N = elke base en L = lus) en dergelijke sequentiemotieven heersen gehele menselijke genoom [1], [2]. G-quadruplexen zijn vier gestrand structuren die stapels vierklanken gevormd door middel van Hoogsteen waterstofbinding van vier guaninen gecoördineerd door een centrale monovalent kation [3] omvatten. Oligonucleotiden gevouwen tot een G-quadruplex structuur In vitro
hebben een hoge thermodynamische stabiliteit onder bijna-fysiologische omstandigheden, in overeenstemming met hun vorming in cellen [4]. De voorspelde locatie van G-quadruplex sequentie motieven in regulerende gebieden van het genoom, zoals promoters en telomeren, stelt G-quadruplex structuren een belangrijke rol in het genoom functie kan hebben [5] - [7]. Een aantal helicasen die G-quadruplexen lossen geïdentificeerd en worden verondersteld bij te dragen aan normale genoom functies, zoals replicatie, transcriptie en de handhaving van de stabiliteit genoom [8]. De visualisatie van DNA G-quadruplex structuren in humane cellen is de aanwezigheid van G-quadruplexen ondersteund in het genoom [9]. In deze experimenten werd een zeer selectieve G-quadruplex-specifiek antilichaam (BG4) werd gegenereerd door faagdisplay en toegepast voor afzonderlijke foci van G-quadruplex structuren te visualiseren in de kernen van humane weefselkweek cellijnen. Dit antilichaam is een mogelijkheid om de cellulaire functie van G-quadruplexen alsook hun mogelijke betrokkenheid bij de ziekte sonde ontvangen.}

G-quadruplex structuren zijn voorgesteld geassocieerd met cellulaire functies zoals replicatie en transcriptie. Zo kan G-quadruplex stabilisatie door een klein molecuul onderdrukken transcriptie van bepaalde oncogenen en /of DNA-beschadiging induceren bij telomeren en oncogenen leidt tot defecten en celdood [10] replicatie - [17]. G-quadruplex structuren kunnen ook worden gekoppeld aan instabiliteit genoom en G-quadruplex sequentiemotieven gevonden proximaal DNA breekpunten en plaatsen van somatische duplicaties gezien op verschillende kankers [18], [19]. Helicases dat G-quadruplexen op te lossen zijn ook te vinden gelokaliseerd op plaatsen van het genoom instabiliteit [20] - [22], en ziekten zoals Bloom's en Werner's syndromen, die verhoogde niveaus van het genoom instabiliteit en een aanleg voor kanker te tonen, hebben bijgedragen mutaties in G -quadruplex-oplossing helicases [23].

Gezien de mogelijke relatie tussen G-quadruplex structuren en menselijke ziekte, is een belangrijk doel aan te pakken of G-quadruplexen in menselijke weefsels kunnen worden gedetecteerd. Wij onderzochten daarom de detectie van DNA-G quadruplexen in patiënten afkomstige weefsels en of er verschillen in G-quadruplex niveaus tussen niet-neoplastische weefsels en kanker. Door toepassing van de G-quadruplex-specifiek antilichaam, BG4 in immunohistochemie met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel microarray secties, we hebben wijdverspreide DNA G-quadruplex formatie in de nuclei van menselijke weefsels gedetecteerd. Kwantificering van BG4-positieve celkernen geopenbaard uitgebreider vorming van G-quadruplex structuren maag- en leverkanker vergeleken met de overeenkomstige achtergrond niet-neoplastische weefsels. Deze resultaten suggereren dat behandeling van G-quadruplex structuren verkeerd gereguleerd in sommige menselijke kankers.

Resultaten en discussie

We stellen om de aanwezigheid van G-quadruplexen in de nuclei van menselijke aantonen weefsels en om te onderzoeken of er verschillen zijn duidelijk zichtbaar in de patiënt afgeleide kanker weefsels. Onze benadering was gebaseerd op de detectie van nucleaire G-quadruplexen door immunohistochemie (IHC) met de G-quadruplex-specifiek antilichaam, BG4 op non-neoplastische en kankerweefsel microarrays (TMA). De specificiteit en selectiviteit van BG4 voor G-quadruplex structuren en de toepassing van BG4 in immunofluorescentie (IF) microscopie op menselijke cellen zijn eerder beschreven [9]. De geschiktheid van BG4 IHC bepalen we eerst dit antilichaam getest in een modelsysteem uit delen uit FFPE celpellets van MDA-MB-231-borstkankercellen die eerder waargenomen nucleaire G-quadruplex foci weergeven door IF microscopie [9] . Zoals epitoopversterking, ofwel warmte-gemedieerde (in-citraat op basis van een pH van 6,0 of Tris /EDTA gebaseerde pH 9,0 buffers) of enzymatische (met proteinase K), is vaak nodig om antigene plaatsen bloot te stellen voordat antilichaambinding, vergeleken we deze drie standaard epitoop retrieval voorbehandelingen. Na BG4 incubatie werd kleuring uitgevoerd door incubatie met een secundair anti-FLAG antilichaam, dat een FLAG tag-epitoop aanwezig is in de BG4 antilichaam, gevolgd door Leica mierikswortelperoxidase-polymeer gebaseerde detectie met behulp van de Bond IHC kleuring platform herkent. Naar aanleiding van dit protocol werd intense nucleaire kleuring waargenomen met BG4 pas na herstel van de epitoop (Figuur 1B en S1). Geen kleuring werd waargenomen in de afwezigheid van de voorbehandeling (figuur 1A) en controles in afwezigheid van BG4 gebleken dat de epitoop met citraat gebaseerde buffer gaf minder achtergrond dan die met Tris /EDTA (figuur 1C en S1), terwijl pre Behandeling met proteinase K tot niet-specifieke nucleaire kleuring zelfs bij afwezigheid van BG4 (figuur S1). Bovendien, na epitoop met citraat of Tris /EDTA buffer, DNase I behandeling vóór BG4 kleuring leidde tot een sterke vermindering van BG4 nucleaire signaalintensiteit (Figuur 1D en S1), de detectie van DNA-G quadruplexen verdere bevestiging. De nucleaire BG4 signaal waargenomen bij IHC is consistent met de eerdere detectie van BG4 foci in de kernen van weefselkweek cellen [9].

Een gemeenschappelijk Europees IHC protocol voor BG4 we eerst bevestigd dat biopsie non-neoplastische humane weefselmonsters kunnen worden gekleurd met behulp van BG4. Algemeen zagen we verschillende BG4 kleurpatronen in vele weefsels suggereren verschillen in de vorming van G-quadruplexen tussen weefsels en tussen cellen in hetzelfde weefsel (Figuur S2). Deze resultaten geven aan dat de totale vorming van DNA-G quadruplexen complexe menselijke weefsels kunnen worden bepaald onder toepassing BG4 IHC, waardoor de visualisatie van G-quadruplex structuren zich voorbij IF microscopie in weefselkweek cellen. In voorlopig onderzoek van BG4 vlekken op kanker weefsels in vergelijking met de achtergrond van niet-neoplastisch weefsel, verschillen in BG4 kleurintensiteit of distributie zijn er vooral overtuigend (gegevens niet getoond), en in veel gevallen strikte kwantificering was niet mogelijk vanwege aanzienlijke verschillen in morfologie en aanwezigheid van meerdere celtypen in maligne versus niet-neoplastisch weefsel. Daarentegen voor lever en maag, onze voorlopig onderzoek suggereerde dat deze weefsels waren direct meetbaar door een uniforme uitstraling binnen en tussen niet-neoplastische weefsels en kanker. Daarom gebruikt de Aperio Imagescope Nuclear (v9) beeldanalysesoftware het percentage BG4-positieve nuclei in de TMA kwantificeren. Een afzonderlijke classificator beeldanalyse werd ontwikkeld voor elk weefseltype nauwkeurig vast en gescheiden raken voorwerpen, met maligne en niet-neoplastische monsters scoorden met dezelfde parameters voor een nauwkeurige vergelijking. Opvallend in negen gevallen waarvoor we duplicaat leverkanker TMA kernen met bijbehorende gematched achtergrond niet-neoplastisch weefsel afkomstig van dezelfde patiënt, zagen we een veel groter aantal BG4-positieve nuclei in kanker (gemiddeld 60,3 ± 5,4%) versus non-neoplastische (gemiddeld 18,3 ± 2,12%) weefselkernen (figuur 2). Wanneer individuele kanker fenotypen onderzocht, bleek dat zowel hepatocellulair carcinoom (HCC) en intrahepatische cholangiocarcinoom (ICC) vertoonden significant grotere BG4 nucleaire kleuring in vergelijking met niet-neoplastisch weefsel (Figuur 2A-D en G). Hoewel HCC en ICC verschillende cellulaire oorsprong, respectievelijk ontwikkeling van hepatocyten of galkanaal cholangiocyten, in beide gevallen werd een groter aantal en intensiteit van BG4-positieve kernen ten opzichte van de niet-neoplastische leverweefsel. Verder in metastasen (geïsoleerd uit grootcellig ongedifferentieerd longcarcinoom sites) een toename BG4-positieve kleuring werd ook opgemerkt (figuur 2E-G). We observeerden duidelijke verschillen tussen niet-neoplastische tumorweefsel en voor een aantal verschillende patiënten cases. Inderdaad, een bredere analyse van kanker en de achtergrond niet-neoplastische TMA kernen waaronder ongeëvenaarde gevallen toonde opnieuw een stijging van de BG4-positieve kernen over HCC, ICC en gemetastaseerd carcinoom (figuur 3A). Wanneer alle gevallen tezamen werden beschouwd, werd een ~2.4-voudige toename van het aantal BG4-positieve kernen gezien in leverkanker vergelijking met niet-neoplastisch weefsel. (P < 0,001, figuur 3B)

vergelijkbaar met de toename van G-quadruplex incidentie leverkanker weefsel, meer dan 3-voudige toename van het aantal BG4-positieve kernen werd waargenomen in de maag adenocarcinoom en zegelring celcarcinoom vergeleken met achtergrond niet-neoplastisch weefsel uit hetzelfde individu (Figuur 4). Een ruimere analyse van maagkanker en niet-neoplastische weefsels waaronder ongeëvenaarde gevallen bevestigde de toename van het aantal BG4-positieve kernen waargenomen bij maagkanker in vergelijking met niet-neoplastisch weefsel (Figuur 5). Sterker nog, in de individuele maagkanker sub-types, adenocarcinomen (afkomstig van glandulaire epitheel), zegelring cell carcinoma (adenocarcinomen gekenmerkt door mucine depositie) en gastro-intestinale stromale tumoren (GIST, KIT expressie sarcomen van mesenchymale oorsprong), vertoonden allemaal groter aantal BG4-positieve nuclei in vergelijking met niet-neoplastisch weefsel maag (figuur 5A). Wanneer alle gevallen samen werden beschouwd, ~3.1-voudig meer BG4-positieve kernen werden gevonden in kanker versus niet-neoplastische weefsels (figuur 5B, P < 0,001). Opvallend is dat verscheidene maag tumor subtypes, die verschillende etiologieën en progressie, alle worden gekenmerkt door toename BG4 kleuring. Deze resultaten zijn dus sterk suggestief voor een algemene verband tussen een verhoogde aanwezigheid van G-quadruplex structuur en ontwikkeling maagkanker.

In de lever en maag TMA, wat kankerweefsel kernen toonde weinig of geen meetbare BG4 kleuring, misschien als gevolg van een probleem in epitoop stabiliteit tijdens chirurgische biopsie collectie of als alternatief te wijzen op een echte variabiliteit in G-quadruplex formatie in deze specifieke weefsels. Toch is het opmerkelijk dat in geen enkel geval was een niet-neoplastische lever of maag weefsel uitgebreid BG4-positief. Deze laatste waarneming bevestigt verder dat de toename van het aantal BG4-positieve cellen waargenomen in de kanker TMA kernen een waarheidsgetrouw verschil in aanwezigheid G-quadruplex tussen de niet-neoplastische en kwaadaardige toestanden. Analyse van G-quadruplex kleuring andere kankers dan ook mogelijk zijn en onze voorlopige analyse van alvleesklier weefsel suggereert dat, hoewel BG4 kleuring in non-neoplastische pancreas wijdverspreid is, is er een ~1.6-voudige toename van BG4 nucleaire kleuring in adenocarcinoom weefsels ( P <. 0,01, figuur S3)

Kortom, onze resultaten tonen dat G-quadruplexen kan worden gevisualiseerd door IHC in niet-neoplastische en kanker menselijke weefsels breiden onze eerdere bevindingen dat de aanwezigheid van G-quadruplex structuren geopenbaard de kernen van de cultuur cellijnen [9]. Het is opmerkelijk dat we een toename waar het aantal G-quadruplex-positieve cellen voor sommige kankerweefsels vergelijking met niet-neoplastische zaken. De gegevens die wij presenteren op zichzelf niet verklaren waarom meer G-quadruplexen zijn duidelijk zichtbaar in het geval van maag en lever kanker. Echter, er zijn verschillende lijnen van bewijs in de literatuur dat een mogelijke associatie of causale verband tussen G-quadruplexen en mechanismen die bijdragen aan kankerontwikkeling of progressie suggereert. Bijvoorbeeld G-quadruplex structuren, wanneer er gedurende DNA replicatie opgelost, fragiele sites die genoom instabiliteit, wat een bekende merker voor kanker [24] bevorderen vertegenwoordigen. Inderdaad, G-quadruplex sequentie motieven gevonden in DNA breekpunten die leiden tot translocaties in het BCL2 gen in lymfomen en binnen de HOX11 gen in T-cel leukemie [25], [26]. Computational analyses hebben gesuggereerd mogelijke associaties van G-quadruplexen en breekpunt gebieden bij verschillende kankersoorten [19].

Onze hypothese is dat een toename van genomisch G-quadruplexen bij kanker kunnen ontstaan ​​door mutaties in enzymen die G-quadruplexen verwerken en /of genomische instabiliteit bij G-quadruplex sites. Bijvoorbeeld, Fanconi-anemie, Bloom en Werner syndromen, alle scherm genoom instabiliteit met een aanleg voor kanker [27] - [29] en het gevolg zijn van mutaties in DNA helicase enzymen die G--quadruplex oplossen activiteit [30] - [32] . Recente genoom-brede studies hebben ook gewezen op de erkenning van G-quadruplex sequenties door extra oplossen helicases zoals ATRX, PIF1 en XPB /D [20] - [22]. Bovendien is PIF1 is gesuggereerd dat genomische instabiliteit te onderdrukken bij G-quadruplexen [22], terwijl ATRX verlies wordt geassocieerd met chromosomale instabiliteit in de pancreas neuro-endocriene tumoren [33], en XPD mutaties verstoren nucleotide excisie DNA herstel dat leidt tot zulke kanker gevoelige ziekten xeroderma pigmentosum [34].

het blijkt dat lever en maag kankers zijn zeer heterogeen en worden niet gekenmerkt door een gemeenschappelijke genetische handtekening of sterk vertegenwoordigd rijden mutatie die eenvoudig de waargenomen toename in G-quadruplex structuren kunnen verklaren . Hoewel veel leverkankers geassocieerd met hepatitis B of C infectie, de pathologische verkregen met de TMA aangeeft dat er geen correlatie met BG4 kleuring. Als onderdeel van de toekomstige werkzaamheden, zal het waardevol zijn voor niet-neoplastische en kwaadaardige tumor samples gevallen waarin hele genoom sequencing werd toegepast om de genetische achtergrond van de tumor /niet-neoplastische paren helderen analyseren, teneinde de relatie tussen genotype en G-quadruplex formatie in kanker.

Tenslotte melden we het gebruik van de G-quadruplex-specifiek antilichaam, BG4 in IHC experimenten van menselijke niet-neoplastische weefsels en kanker. Dit onderzoek heeft ons in staat om een ​​significant hogere aanwezigheid van DNA-G quadruplex structuren in de kernen van maag- en leverkanker cellen vergeleken met de overeenkomstige niet-neoplastische weefsels te identificeren. Onze hypothese is dat deze verschillen afhankelijk van veranderingen van cellulaire processen die stabiliteit van het genoom of veranderingen in het chromatine toestand bij G-quadruplex sites in kankerweefsel regelen kunnen zijn. Onze resultaten ondersteunen de mogelijkheid dat kankercellen een raam van selectiviteit dat ze gevoeliger zijn dan niet-neoplastische cellen in de richting van een klein molecuul-G-quadruplex targeting strategie zou kunnen voorzien.

Materialen en methoden

fixatie, inbedding, snijden en kleuring van celpellets werden uitgevoerd door de histopathologie kern van de dienstverlening aan het Cancer Research UK Cambridge Institute. Immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd onder toepassing van standaardwerkwijzen op geautomatiseerde Leica Bond platform met kleine wijzigingen. In het kort werden weefsels gefixeerd gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (RT) in 10% neutraal gebufferde formaline en verwerkt met behulp van een Leica ASP300 weefselprocessor met de-hydratie door een ethanolreeks, clearing in xyleen en infiltratie met gesmolten paraffinewas. Insluiten werd uitgevoerd op een Leica EG1160 Embedding station en secties werden bij 3 um gesneden met een microtoom dreef op een waterbad ~45-50 ° C tot glad en vlak voordat collectie op een microscoopglaasje en drogen bij 60 ° C gedurende 1 uur. De-waxen en rehydratie werden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd Leica ST5020 Multistainer. MDA-MB-231 menselijke borst adenocarcinoom cellen werden verkregen van ATCC LGC Standards. MDA-MB-231 celpellets werd epitoop uitgevoerd bij 100 ° C gedurende 20 min met Bond epitoop Oplossing 1 (-citraat gebaseerde buffer pH 6,0) of Bond epitoop oplossing 2 (Tris /EDTA gebaseerde buffer pH 9,0) of bij 37 ° C gedurende 10 min met Bond enzym voorbehandeling (100 ug /ml proteïnase K in Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,35% surfactant en ProClin 950) om de beste conditie te vinden. In de handel verkrijgbare menselijk weefsel microarrays met de nodige ethische goedkeuring in het land van herkomst werd gekocht bij Insight Bio UK (voor de VS Biomax Inc. arrays) en BioCat, Duitsland of Stretton Scientific, het Verenigd Koninkrijk (voor Accumax, Isu Abxis arrays). Epitoop werd uitgevoerd bij 100 ° C gedurende 20 minuten met citraatbuffer. BG4 kleuring werd uitgevoerd bij kamertemperatuur op een geautomatiseerd Leica Bond instrument met een konijn polymeer kit (Leica) na een 15 min incubatie met BG4 en 8 min incubatie met een anti-FLAG konijnen polyklonaal antilichaam (Cell Signaling Technology). Objectglaasjes werden vervolgens tegengekleurd gedurende 5 min met 0,02% hematoxyline om de celkernen zichtbaar. De-hydratatie en clearing werden uitgevoerd op een geautomatiseerde Leica ST5020 Multistainer en montage werd uitgevoerd op een geautomatiseerde Glasafdekker Leica CV5030. Dia's werden gescand met een Aperio XT120 slide scansysteem (Leica) en afbeeldingen geanalyseerd met behulp van de Aperio Imagescope Nuclear v9 software. Statistische analyses en P-waarden werden berekend met behulp van t-test van de student. Frequentie-distributie grafieken werden uitgezet met behulp van GraphPad Prism (GraphPad Software).

Ondersteunende informatie
Figuur S1.
BG4 vlekken op paraffine MDA-MB-231 celpellets. A. Menselijke MDA-MB-231 borstkankercellijnen pellets werden gefixeerd, ingebed in paraffine en verwerkt voor IHC met de G-quadruplex antilichaam BG4. Sterke BG4 kleuring (bruin) blijkt in celkernen na herstel van de epitoop met Tris /EDTA-based buffer pH 9,0. Schaalbalk komt overeen met 20 urn. Kernen tegengekleurd met haematoxyline (blauw). B. BG4 sterke kleuring (bruin) blijkt in celkernen volgende epitoop met proteinase K. C. Geen nucleaire kleuring waargenomen in afwezigheid van het antilichaam na BG4 Tris /EDTA epitoop. D. Geen nucleaire kleuring wordt gezien na DNase behandeling voorafgaand aan BG4 kleuring na het herstel van de epitoop met EDTA. E. De hoge niveaus van niet-specifieke kleuring in de afwezigheid van BG4 na het herstel van de epitoop met proteinase K.
doi: 10.1371 /journal.pone.0102711.s001
(TIF)
Figuur S2.
Non-neoplastische menselijke weefsels tonen variabele BG4 kleuring. Niet-neoplastische weefsels werden gekleurd door IHC met de G-quadruplex antilichaam BG4. A. BG4 kleuring (bruin) in de nier cortex toont een reeks van nucleaire kleuring intensiteiten in glomeruli en bijbehorende structuren. Celkernen werden tegengekleurd met hematoxyline (blauw). Schaalbalk komt overeen met 50 urn B. zwak positief BG4 kleuring wordt gezien in de tubuli van de nier kernen merg. C. Skin toont een scala aan BG4 intensiteiten in de opperhuid met positieve en negatieve kernen overal verspreid, terwijl de dermis overwegend positief is. D. De meeste kernen in de dikke darm zijn BG4-positief. E. In de baarmoeder lichaam, het meerlagig plaveiselepitheel is grotendeels BG4-negatief, terwijl positieve kleuring meer oppervlakkig wordt gezien. F. Gedurende de borst ductaal melkklieren, zowel myo en luminale cellen vertonen algemene sterke BG4 kleuring met slechts af en toe negatieve cellen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s002
(TIF)
Figuur S3.
Verhoogde aanwezigheid van G-quadruplex structuren in de menselijke pancreas kanker weefsels. Non-neoplastische en pancreas kanker weefsels werden gekleurd door IHC met de G-quadruplex-specifiek antilichaam BG4 en het aantal BG4-positieve kernen werd gescoord met behulp Aperio Imagescope software. A. De kernen van niet-neoplastische pancreas weefsel vertonen matige BG4 kleuring (bruin) met veel ongekleurde kernen ook aanwezig. Celkernen werden tegengekleurd met hematoxyline (blauw). Schaalbalk komt overeen met 50 urn. B. BG4 kleuring in pancreas adenocarcinoom weefsel is uitgebreider met een grotere intensiteit. C. Algemene kwantificering van het aantal BG4-positieve nuclei in alle niet-neoplastische en pancreaskanker weefsels. Foutbalken vertegenwoordigen de s.e.m. * P < 0,01, n = 6 en 12 voor niet-neoplastische en kanker kernen respectievelijk
doi:. 10.1371 /journal.pone.0102711.s003
(TIF)

• PLoS ONE: Altijd Gamble op een lege maag: Honger wordt geassocieerd met Voordelige besluit Making
• PLoS ONE: Onverwachte Headless en Tailless Vissen in de maaginhoud van makreelhaai Isurus oxyrinchus