Expresie RON tyrozínkinázy receptora a jeho spojenie s karcinómu žalúdka v porovnaní s normálnou žalúdočnej tissues

expresiu receptora tyrozín kinázy RON a jeho vzťahu s karcinómu žalúdka v porovnaní s normálnou žalúdočné tkaniva
Abstract
pozadí
Recepteur d'origine Nantais (RON) je receptor tyrozín kinázy, ktorý je aktivovaný, makrofágy stimulujúci proteín (MSP) rastového faktoru odvodeného od séra, a je vyjadrená v mnohých malígnych nádorov. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, expresné proteín profilu RON a jeho vzťah ku klinicko-charakteristiky karcinómu žalúdka a prognózu.
Metódy
karcinóm žalúdka tkanivo z 98 pacientov, spolu s 29 exemplármi paraneoplastický tkaniva a 10 vzorky normálne žalúdočnej sliznice, boli skúmané pomocou imunohistochémia (IHC). Western blot analýza 19 vzoriek karcinómu žalúdka tkaniva a zodpovedajúce paraneoplastický tkaniva, 8 vzoriek normálne žalúdočnej sliznice, a 2 vzorky normálnych vzoriek lymfatických uzlín tiež detekovaná expresia varianty spojovacie RON, RONΔ165. Všetky vzorky získanej boli sprevádzané pacienta follow-up dát, ktorá sa pohybovala od 3 do 89 mesiacov (stredná doba: 22 mesiacov).
Výsledky
podiel kladných vyjadrení RON sa významne líšia medzi karcinómu tkaniva žalúdočné [56,1%, ( 55/98)], a paraneoplastický tkanivá [25,6% (8/29)] (p = 0,007). Na rozdiel od toho RON výraz bol neprítomný v normálnych vzoriek žalúdočnej sliznice. RON výraz pozitívne koreluje s invazívnym hĺbky nádoru (p = 0,019), lymfatické uzliny perigastric metastáz (p = 0,019), a stav TNM (p = 0,001). Avšak, RON expresie bola nezávislá na raste nádoru vzoru v súlade s kritériami Bormann (p = 0,209), histopatologické stupňa (p = 0,196), a výskyt vzdialených metastáz (p = 0,400). RON výraz nebol v spojení s mierou prežitia pacienta (p = 0,195). RONΔ165 bol silne vyjadrená v čerstvom rakovina žalúdka tkaniva, čo zodpovedá paraneoplastický tkaniva a perigastric lymfatické uzliny s metastatickým karcinómom. Na rozdiel od toho expresie RONΔ165 nebola pozorovaná v normálnej žalúdočnej sliznici a vzoriek normálneho tkaniva lymfatických uzlín.
Záver
RON expresie je významná v žalúdočnej tkanive karcinómu a zodpovedajúce paraneoplastický tkaniva, ale nie je exprimovaný v normálnej žalúdočnej sliznici. Podobne bolo pozorované expresie RONΔ165 v žalúdočnej tkanive karcinómu a v prítomnosti metastáz v lymfatických uzlín tkanivách. Predpokladáme, že RON a jej variant zostrihu hrajú dôležitú úlohu pri výskyte, progresie a metastáz karcinómu žalúdka, a preto môžu predstavovať užitočný ukazovateľ pre hodnotenie biologickej aktivity karcinómu žalúdka.
Pozadie
chorobnosti v žalúdku karcinómu sa zvyšuje každý rok, pričom sa znižuje vek začiatku. V Číne, karcinóm žalúdka je najvyššia zhubný nádor v oboch kategóriách chorobnosti a úmrtnosti [1]. Recepteur d'origine Nantais (RON) je receptor tyrozín kinázy (RTK), ktoré patria do rodiny protoonkogenu o THZ. Nedávne štúdie na RON modeli knockout myší ukazuje, že úplné prerušenie génu RON je embryonálny smrteľná [2], čo ukazuje, že je dôležité v RON embryonálneho vývoja. RON sa aktivuje, makrofágov stimulujúci proteín (MSP), rastový faktor odvodený séra, a štúdie ukázali, že RON je exprimovaný v mnohých malígnych nádorov a hrá úlohu pri ich vzniku a progresii.
Zhou et al. [3] zistili, že RON je silne vyjadrená v Kolorektálny karcinómy, a oni identifikované tri zostrihu varianty RON (RONΔ160, RONΔ165 a RONΔ155). Expresie RON a jeho variantov bola spojená s progresiou kolorektálneho karcinómu. Iné štúdie ukázali, že expresia RON a jeho sestřihové varianty môžu vyzrážať hrubého čreva epitelu tvorbu kolónií buniek a zvyšuje ich životaschopnosť. Pri vyjadrení RON a jeho varianty zostrihu bolo zamerané siRNA u kmeňov rektálne nádorových buniek, proliferácie a metatasis boli výrazne inhibované, súbežné so zvýšením apoptózy. Na základe týchto údajov, RON a jeho varianty zostrihu sa hypotéza, že hrajú dôležitú úlohu vo výskyte, progresie a metastáz karcinómu rekta [4]. Rovnako tak štúdie RON prejavu v oboch prsníka a rakoviny močového mechúra tkanív ukázala zvýšenie hladiny RON prejavu a korelácia s histologického stupňa [5, 6].
Pokiaľ je nám známe, rola RON u karcinómu žalúdka bola študovaná podľa COLLES et al [7]. V tejto štúdii bola varianta zostrihu RON, RONΔ165, bola zistená u kmeňa žalúdočné karcinóm, KATO-III. RONΔ165 bolo preukázané, že zvyšujú invázii buniek karcinómu žalúdka, čo ukazuje na úlohu pre variant zostrihu RON v malígnej transformácii buniek žalúdočných na karcinóm. V tejto štúdii sme skúmať expresiu RON v žalúdočnej tkanive karcinómu 98 pacientov metódou Envision imunohistochémia (IHC). Skúmať expresiu RONΔ165, bola vykonaná Western blotting čerstvé tkaniva karcinómu žalúdka. Pacienti zapísaní v našej štúdii boli sledované medzi 3 a 89 mesiacov po operácii vyšetrovať združenia RON prejavu, vrátane jeho variant zostrihu, ku klinicko-charakteristiky karcinómu žalúdka a prognóze. Vzhľadom na zložitú patogenéze karcinómu žalúdka, terapeutická účinnosť nebola ukázala byť veľmi účinná. Tak, že je dôležité, aby skúmať patogenézy karcinómu žalúdka nájsť nových terapeutických cieľov.
Metódy
vzoriek od pacientov
parafínové vložené vzorky tkanív z 98 pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok na patologicky potvrdila, rakovina žalúdka v pridružená nemocnica prvej z College of Medicine of Zhejiang University v rokoch 1998 a 2003 boli získané. Žalúdočné vzorky boli použité so súhlasom pacienta a dovolenia etických komisií nemocníc. Sedemdesiat mužov a 28 žien, vo vekovom rozmedzí 21 až 76 rokov (priemerný vek 58 rokov) boli zaradení do tejto štúdie. Diagnóza pacientov bolo 78 prípadov karcinómu sinus ventriculi, 16 prípadov karcinómu žalúdka kardia a 4 prípady celkovej karcinómu žalúdka. Pooperačné patologickej správy diagnostikovaná 2 dobre diferencovaných adenokarcinómov, 21 stredne diferencovaný adenokarcinóm, 69 zle diferencované adenokarcinómy 1 pečatný prsteň-karcinóm, 2 mucinózní adenokarcinóm, a tri ťažká dysplázia s cancerization. Podľa UICCTNM (1998), histologický stupeň vzoriek bola stanovená, aby zahŕňal 26 štádiu I prípadoch 14 etapu II prípadoch 30 štádium III prípadov a 28 štádium IV prípadov. Následná sadzba pre našich pacientov bolo 92%, pričom 8 pacientov nie sú k dispozícii na dokončenie nadväzujúcich. Doba sledovania bola medzi 3 a 89 mesiacov (medián 22 mesiacov) po chirurgickom zákroku. Desať vzoriek normálne žalúdočnej sliznice boli skúmané ako kontroly. Devätnásť vzoriek čerstvého karcinóm žalúdka tkaniva, paraneoplastický tkaniva, a pozitívne perigastric lymfatických uzlín tkaniva boli zhromaždené pre Western blot analýzu. Desať vzoriek normálne žalúdočnej sliznice boli tiež zahrnuté ako kontrola.
Imunohistochémia
parafínové vzorky boli narezané do 4 um hrubé plátky, ktoré boli zbavené parafínu, hydratovaný a inkubované po dobu 20 minút v 0,3% H 2O 2 k inhibíciu endogénnej peroxidázy. Pre získanie antigénu, boli vzorky inkubované s 0,1 M citrátového pufru (pH 6,0) a zmes sa zahrieva v tlakovom hrnci po dobu 8 min. Po opláchnutí v TBS bola sklíčka inkubujú s 3% normálnej somárov sérum (NDS) v TBS po dobu 20 minút, aby sa zabránilo nešpecifickej väzbe na prvý protilátky. Anti-králičie monoklonálna protilátka RON Ron β (C-20), (Santa Cruz Biotechnologies, USA) bol použitý na 1: 400. Envision kit (Dako) bol použitý podľa návodu výrobcu, a viazané protilátky bola detekovaná pomocou DAB. Vzorky boli tiež spoločne zafarbené hematoxylínom. Vzorky boli pozorované pod svetelným mikroskopom a PBS iba na farbenie vzorka bol použitý ako kontrola pozadia.
Hodnotiace kritériá detekcie RON imunohistochemicky
posúdenie stupňa farbenie bola stanovená pomocou zaslepeného hodnotiaci postup skúsený patológovia. High-power pole (400 x), použitím štandardných svetelnej mikroskopie boli rozdelené do desiatich sekcií, ktoré boli náhodne bránky. Nádorové bunky sa buffy častíc v intracytoplasm boli hodnotené ako pozitívne, a bolo zaznamenané percento pozitívnych nádorových buniek a intenzita farbenia pre každú vzorku. Nádorové bunky, ktoré neboli škvrna na RON vyjadrenia boli hodnotené ako negatívne, bunky, ktoré slabo farbených boli hodnotené ako 1, mierne farbenie bola hodnotená s 2 a silne moriace vzorky boli hodnotené ako 3. Z pozitívnych nádorových buniek detegovanou, < 5% boli negatívne, medzi 5 a 24% boli hodnotené ako 1, 25 až 49% boli hodnotené s 2 a > 50% boli hodnotené pomocou 3. kumulatívne skóre nádorových buniek identifikovaných vo vzorke podľa konečný výsledok vzorky je. na konečný výsledok na základe, nádorové tkanivo sa stanovila, že je negatívny (skóre 0-2), alebo pozitívne (skóre 3-6) pre RON expresiu.
proteín-chémiou
päťdesiat mikrogramov celkového proteínu pre každú vzorka sa oddelí elektroforézou na 10% polyakrylamidovom gélu a prenesené na PVDF membránu (Millipore). Detekcia RON proteínu bola vykonaná s použitím anti-RON králičie monoklonálne protilátky Ron beta (C-20) (Santa Cruz Biotechnológia, USA) (1: 400). Nadviazanie protilátok bola vizualizované s použitím anti-králičie protilátky konjugovanej s chrenovou peroxidázou a Enhanced chemiluminiscenčného kitu (ECL) (Biological Industries, Inc. Izrael). β-aktínu bol použitý ako kontrola nanášania.
Štatistická analýza
SPSS 13.0 štatistický softvér bol použitý na identifikáciu štatistickú významnosť našich dát pomocou štvornásobne tabuľky alebo R × C tabuľke χ 2 testu. Krivky prežitia boli vyhodnotené metódou Kaplan-Meier Prihlásiť prežitie boli testované za použitia Log-rank testu.
Výsledky
RON prejavu v žalúdočnej tkanive a tkanive paraneoplastický
RON proteín bol pozorovaný v cytolymph, ale nie v jadierka, z buniek karcinómu žalúdka a typicky sa objavil ako buffy granulo-farbenie (obr. 1). bol zaznamenaný percentuálny podiel pozitívnych nádorových buniek a intenzita farbenia pre každú vzorku. Pre hodnotené vzorky 98 pacientov, RON expresia bola pozorovaná u 56,1% z karcinómu žalúdka tkanív (55/98), ale nie vo vzorkách normálne žalúdočnej sliznice. V karcinómu žalúdka paraneoplastický tkaniva, ktorá bola odobraná z žalúdočnej sliznice vrstvy 0,5 cm od vzoriek karcinóm žalúdka, RON proteínu bola pozorovaná u 25,6% vzoriek (8/29). Tieto údaje predstavujú významnú štatisticky významné rozdiely v expresii proteínu RON medzi karcinóm žalúdka tkanivo a jej pridružené paraneoplastický tkaniva (χ 2 = 7,290, p = 0,007). Obrázok 1 Detekcia RON expresie immunhistochemistry. A, H) Detekcia RON v zle diferencovaného adenokarcinóme žalúdka vzorky. 200 × a 400 × zväčšenie. B, E) Zväčšené zobrazenie detekcia Ron vzorky zle diferencovaného adenokarcinóme žalúdka. 400 × a 200 × zväčšenie. C) Detekcia RON vo vzorke karcinómu Signet-krúžkom buniek. 400 × zväčšenie. D) Detekcia RON vo vzorke stredne diferencovaného adenokarcinóme žalúdka. 400 × zväčšenie. F) Detekcia RON vo vzorke stredne diferencovaného adenokarcinóme žalúdka. 200 × zväčšenie. G) Detekcia RON vo vzorke karcinómu Signet-krúžkom buniek. nebol nájdený 400 × zväčšenie
expresiu RON proteínov vo vzťahu k patológii karcinómu žalúdka
prejavu RON proteínov, ktoré majú byť spojené s pohlavím, vekom alebo choré regiónu (p Hotel > 0,05) .. Avšak, v tkanivách karcinómu žalúdka, tým hlbšie karcinómu buniek preniknuté, tým silnejšie RON proteín bol exprimovaný (p = 0,019
). Bolo tiež zistené, expresia RON proteín pozitívne koreluje s perigastric lymfatických uzlín a klinickej patológie fáza sa štatistickej významnosti (p = 0,019,
p
= 0,001) (tabuľka 1). V kontraste, tam neboli žiadne významné štatistické rozdiely v expresii RON pri patológiu triedenie, typ Borrmann alebo prítomnosť metastáz. Avšak, bolo pozorované, že RON výraz bol silnejší v skupine Borrmann III /IV (63,6%) ako v skupine Borrmann I /II (53,8%), silnejšia vo vzdialenej metastázy skupiny (68,2%) ako v non-vzdialený metastázy skupiny (52,6%), a silnejší v histologicky nižšej diferencovanej skupiny (52,4%) ako u stredne a vysoko diferencovanej histológia skupiny (39,1%). Neboli zistené žiadne významné štatisticky významné rozdiely u týchto porovnaniach (p = 0,209; p = 0,400; p = 0,196), v uvedenom poradí (tabuľka 1) .Table 1 Vzťah RON prejavu patológie parametre

RON
RON
Χ2
p
(+) (%)
( -)
invazívnej hĺbka
Čoskoro rakovina žalúdka
5 (29,4)
12
infiltroval k svalovej vrstvy
15 (51,7)
14
7,795
p = 0,019
infiltrovali na serózna membráne
35 (67,3)
17
TNM
Stage
14 (35,0)
26
12,245
p = 0,001
Stage
41 (70,7)
17
metastáz do lymfatických uzlín
N0
11 (37,9)
18
N1-3
44 (63,8)
25
5,535
p = 0,019
Borrmann Grade
I /II skupina
14 (53,8)
12
III /IV skupina
35 (63,6 )
20
0,708
p = 0,400
Ostatné
6
11
histológia Grade
Mierne & vysoko diferencované
9 (39,1)
14
1,577
p = 0,209
Menej rozlíšené *
39 (54,2)
33
Ostatné **
0 Sims 3
vzdialenej metastázy
M0
40 (52,6)
36
1,675
p = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Zahŕňa zle diferencovaný adenokarcinóm, karcinóm Signet-ring bunka, mucinózní adenokarcinóm; ** Ťažká dysplázia s cancerization.
RON expresné a miery prežitia
U 90 pacientov zaradených do tejto štúdie, ktoré boli nasledovali po prevádzkovo nebol nájdený žiadny významný štatistický rozdiel v miere prežitia medzi pacientmi s RON-pozitívnym karcinómom žalúdka vzorky oproti RON-negatívnych vzoriek karcinómu žalúdka (obr. 2). Obrázok 2 Survival krivka pre RON + oproti RON-pacientov.
Detekcia RONΔ165 variant zostrihu
19 vzoriek čerstvého karcinóm žalúdka tkanív zhromaždí, spolu so zodpovedajúcimi paraneoplastických tkaniva, a patologicky potvrdená perigastric lymfatické uzliny s metastatickým karcinómom, varianty zostrihu RON, RONΔ165, bol vyjadrený. Na rozdiel od toho žiadna expresia RON proteínu bola pozorovaná v normálnej žalúdočnej sliznice alebo normálne tkaniva, lymfatických uzlín (viď obr. 3, 4). Obrázok 3 Analýza Western blot of RON expresie v karcinómu žalúdka tkanivo, paraneoplastický tkaniva a perigastric lymfatických uzlín. Duplicitné vzorky karcinómu žalúdka tkaniva (T), paraneoplastický tkanive (P), a metastatické lymfatických uzlín (L) tkanivá boli analyzované na expresiu RONΔ 165 (165 kDa). Normálny žalúdočnej sliznice (N) a normálne lymfatické uzliny (NL), tkanivové vzorky boli porovnané. β-aktínu (44 kDa) bol použitý ako kontrola nanášania.
Obrázok 4 Western blot analýzu RON expresie v karcinómu žalúdka tkaniva, paraneoplastický tkanív a normálne žalúdočnú sliznicu. Duplicitné vzorky karcinómu žalúdka tkaniva (T) a paraneoplastický tkanive (P) boli analyzované na expresiu RONΔ165 (165 kDa), a v porovnaní s normálnymi žalúdočnej sliznice (N) vzoriek tkanív. Marker (M) a pozitívna kontrola (PC) (160 kDa) boli hotela.
Diskusia
súčasnej štúdii ukazujeme, ako IHC a Western blot, že RON výraz nie je detegovateľný v normálnej žalúdočnej sliznici. Tieto pozorovania sú v súlade s výsledkami z Okin et al [8]. Avšak, farbenie RON v rakovinových tkanív a zodpovedajúcich paraneoplastickými tkanivách IHC vykazovala podstatné expresiu RON v porovnaní s normálnymi vzorkami žalúdočnej sliznice. Analýza Western blot za predpokladu, ďalšie konkrétne informácie týkajúce RON vyjadrenie s detekciou RONΔ165 v karcinómu žalúdka tkanivách, čo zodpovedá paraneoplastických tkanív a lymfatických uzlín s karcinómom metastáz. Tieto dáta ukazujú, že expresia plnej dĺžky RON, rovnako ako variantu RON, sú vyjadrené v procese malígne transformácii epitelových buniek žalúdka. Na základe týchto údajov a prácu v iných štúdií o úlohe RON v nádorových fenotypov, sme hypotézu, že RON môže pôsobiť ako onkogén podporovať výskyt, progresie, invázia a metastázovaniu rakoviny žalúdka.
Predchádzajúce štúdie ukázali, že expresia RON koreluje s inváziu nádorových buniek. Maggiora et al [9], uvádzajú, že RON bola vyjadrená v 55% karcinómu vaječníkov tkanív. Okrem toho, ak je bunková línia rakoviny vaječníkov, ktorá silne exprimuje RON je vyvolaná MSP, nádorový rast a inváziu je významne zvýšená. Na základe týchto dát bolo predpokladal, že RON hrá úlohu v progresii rakoviny vaječníkov. Podobne, Chan et al [10] ukázala, že expresia RON podporoval rast a malígne transformáciu kožných papilómov a Cheng et al [6] ukázal, že silná expresia RON v bunkových líniách karcinómu močového mechúra v korelácii so zvýšenou proliferáciu a inhibíciu apoptózy. Druhá štúdia tiež ukázala, že expresia RON v karcinómu žalúdka pozitívne koreluje s invazívnym hĺbkou žalúdočné nádorových buniek a metastáz lymfatických uzlín, a hladina expresie významne zvyšuje s vyššími klinických patologických stavov, rakoviny žalúdka. Z tohto dôvodu, silná expresia RON v žalúdočných rakovinových tkanív môže slúžiť ako marker pre indikáciu konverziu normálnych buniek na malígny fenotyp, ktorý spojené so zvýšenou inváziu nádorových buniek a metastáz by byť spojená so zlou prognózou pre dlhodobé prežitie. Blízkosť žalúdočné rakovina tkaniva na epitelové dysplázia výsledkov žalúdka v citlivosti epiteliálne dysplázia žalúdka do prekancerózne lézie. Preto tým, že podávanie správ expresiu RON v paraneoplastický tkaniva, ktorá bola odobratá ~ 0,5 cm od vzoriek žalúdočnej karcinóm, poskytujeme údaje na podporu našu hypotézu, že RON zohráva dôležitú úlohu pri podpore karcinómu žalúdka a môže slúžiť ako marker premena tkanív malígneho fenotypu.
V predchádzajúcich štúdií zameraných na vzťah medzi RON expresie a prežívania ceny, Lee et al [11] zistili, že MET a RON boli nezávislé prognostické faktory dlhodobého recidívy rakoviny prsníka, a že vzorky pozitívne na THP a RON výraz mala výrazne nižšia 10-ročnou nákazy prežitie. Rovnako tak Cheng et al [6] vykázala nižšiu mieru prežitia u rakoviny močového mechúra pozitívne ako pre THP a RON. Na rozdiel od toho sme zistili, že miera prežitia pacientov pozitívnych na expresiu RON nebol nižší ako miera prežitia pre RON-negatívne skupine pacientov. Je možné, že miera prežitia pacientov s rakovinou žalúdka môže byť ovplyvnená mnohými faktormi, a naše následné údaje nestačila poskytnúť ďalšiu možnosť nahliadnuť do ktorej by mohli byť faktory dôležité.
Záver
základe výsledkov tohto štúdie ukazujú, že RON je vyjadrená v karcinómu žalúdka, ale nie v normálnej žalúdočnej sliznici. Okrem toho, výraz miera RON u karcinómu žalúdka pozitívne koreluje s invazívnym hĺbkou, klinické patologické fázu a rozsahu lymfatických uzlín. Predpokladáme, že RON hrá dôležitú úlohu pri vzniku, progresii, inváziu a metastázy karcinómu žalúdka, a preto by mohol byť dôležitý ukazovateľ pri hodnotení biologickej správania karcinómu žalúdka. Výsledky našej štúdie poskytujú základ, z ktorého sa ďalej identifikovať Mechanistické podrobnosti o úlohe Ron rakoviny žalúdka za účelom identifikácie RON ako terapeutický cieľ u rakoviny žalúdka.
Deklarácia
Poďakovanie
práce bola financovaná z vedeckého výskumu Grant v oblasti zdravia úradu provincie Zhejiang (č 491010-W10380) (No. 2006B039) a prírodné Science Foundation v provincii Zhejiang, Čína (č Y2080168).
Autori ďalej len "pôvodné predložený súbory obrazy
Nižšie sú uvedené odkazy na pôvodných predložených súborov autorov pre obrazy. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 12885_2008_1291_MOESM2_ESM.jpeg autorského 12885_2008_1291_MOESM1_ESM.jpeg autorov pôvodného súboru na obrázku 2 12885_2008_1291_MOESM3_ESM.jpeg autorského pôvodného súboru pre Obrázok 3 12885_2008_1291_MOESM4_ESM.jpeg autorského pôvodného súboru na Obrázok 4 protichodnými záujmami
autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Laparoskopickej nastaviteľný pruhovaný Roux-en-Y žalúdočnej bypass ako primárny postup pre super-super-obezitou (body mass index telesnej > 60 kg /m2)
• Zvýšené riziko adenokarcinóme žalúdka po liečbe primárnej žalúdočnej difúzna velkobuněčný B-lymfóm