L'expression de la RON récepteur tyrosine kinase et son association avec le carcinome gastrique par rapport aux tissus gastriques normaux

L'expression de la kinase du récepteur tyrosine RON et son association avec le cancer de l'estomac par rapport à des tissus normaux gastriques
Résumé de l'arrière-plan
Recepteur d'origine Nantais (RON) est une tyrosine-kinase du récepteur qui est activé par un dérivé du sérum, macrophage protéine stimulant (MSP) et le facteur de croissance est exprimé dans de nombreuses tumeurs malignes. Le but de la présente étude était de révéler le profil d'expression protéique de RON et sa relation avec les caractéristiques clinico de carcinome gastrique et le pronostic.
Méthodes
tissu de carcinome gastrique à partir de 98 patients, avec 29 échantillons de tissu paranéoplasique et 10 les échantillons de muqueuse gastrique normale, ont été examinés par immunohistochimie (IHC). Analyse par Western blot de 19 échantillons de tissu de carcinome gastrique et du tissu correspondant paranéoplasique, 8 échantillons de muqueuse gastrique normale, et 2 spécimens d'échantillons de ganglions lymphatiques normaux aussi détecté l'expression d'un variant d'épissage de RON, RONΔ165. Tous les échantillons obtenus ont été accompagnés de données sur les patients de suivi qui varie de 3 à 89 mois (durée médiane: 22 mois). Résultats de
Le taux d'expression positive RON différaient significativement entre les tissus de carcinome gastrique [56,1%, ( 55/98)] et les tissus paranéoplasiques [25,6% (29/08)] (p = 0,007). En revanche, l'expression RON était absent dans les échantillons de muqueuse gastrique normale. expression RON corrélée positivement avec la profondeur invasive de la tumeur (p = 0,019), la lymphe périgastrique nœuds métastases (p = 0,019), et le stade TNM (p = 0,001). Cependant, l'expression RON était indépendante de modèle de croissance de la tumeur selon des critères Bormann (p = 0,209), de grade histopathologique (p = 0,196), et l'incidence des métastases à distance (p = 0,400). expression RON n'a pas été lié au taux de survie d'un patient (p = 0,195). RONΔ165 a été fortement exprimé dans le tissu de carcinome gastrique frais, tissus paranéoplasique, et les ganglions lymphatiques périgastriques atteints d'un carcinome métastatique correspondant. En revanche, l'expression de RONΔ165 n'a pas été observé dans la muqueuse gastrique normale et des échantillons de tissus de ganglions lymphatiques normaux.
Conclusion
expression RON est importante dans le tissu du carcinome gastrique et du tissu correspondant paranéoplasique, mais ne sont pas exprimés dans la muqueuse gastrique normale. L'expression de RONΔ165 similaire, on observe dans le tissu du carcinome gastrique et dans les métastases présentes dans les tissus des ganglions lymphatiques. Nous présumons que RON et sa variante d'épissure jouent un rôle important dans la survenue, la progression et les métastases du cancer de l'estomac, et donc peut représenter un marqueur utile pour évaluer l'activité biologique du cancer de l'estomac.
Contexte
Morbidité de l'estomac carcinome augmente chaque année, alors que l'âge d'apparition est en baisse. En Chine, le carcinome gastrique est la tumeur maligne top dans les deux catégories de morbidité et de mortalité [1]. Recepteur d'origine nantais (RON) est un récepteur tyrosine kinase (RTK) qui appartient à la famille des proto-oncogène MET. Des études récentes sur un modèle de souris KO RON montre que la rupture complète du gène RON est embryonnaire létale [2], ce qui démontre que RON est essentiel dans le développement embryonnaire. RON est activé par une, protéine de stimulation des macrophages (MSP), le facteur de croissance dérivé du sérum, et des études ont montré que le RON est exprimé dans de nombreuses tumeurs malignes et joue un rôle dans leur apparition et la progression.
Zhou et al. [3] a constaté que RON est fortement exprimé dans les carcinomes colorectaux, et ils ont identifié trois variants d'épissage de RON (RONΔ160, RONΔ165 et RONΔ155). L'expression de RON et ses variantes a été associée à la progression du carcinome colorectal. D'autres études ont montré que l'expression de RON et ses variants d'épissage peut précipiter épithéliale du côlon formation de colonies de cellules et d'augmenter leur viabilité. Lorsque l'expression de RON et ses variants d'épissage ont été ciblés par des ARNsi dans des souches de cellules tumorales du rectum, de la prolifération et metatasis ont été significativement inhibés, concomitante à une augmentation de l'apoptose. Sur la base de ces données, IOR et ses variants d'épissage sont émis l'hypothèse d'un rôle important dans la survenue, la progression et les métastases du cancer du rectum [4]. De même, les études d'expression RON dans les deux tissus de cancer du sein et de la vessie a montré des niveaux accrus d'expression RON et une corrélation avec le grade histologique [5, 6].
À notre connaissance, le rôle de RON dans le cancer gastrique n'a été étudié par Collesi et al [7]. Dans cette étude, le variant d'épissage de RON, RONΔ165, a été détectée dans la souche de cellules de carcinome gastrique KATO-III. RONΔ165 a été montré pour améliorer l'invasion des cellules du cancer de l'estomac, ce qui indique un rôle pour le variant d'épissage de RON dans la transformation maligne des cellules gastriques à un carcinome. Dans cette étude, nous examinons l'expression de RON dans le tissu de carcinome gastrique de 98 patients en utilisant la méthode Envision immunohistochimie (IHC). Pour examiner l'expression de RONΔ165, Western blot de tissu de carcinome gastrique frais a été effectué. Les patients inclus dans notre étude ont été suivis entre 3 et 89 mois post-opératoire pour enquêter sur l'association d'expression RON, y compris son variant d'épissage, les caractéristiques clinico de carcinome gastrique et le pronostic. En raison de la pathogénèse du carcinome gastrique complexe, l'efficacité thérapeutique n'a pas avérée très efficace. Ainsi, il est important d'étudier la pathogenèse du carcinome gastrique pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
Méthodes
paraffine des échantillons de tissus de patients des échantillons à partir de 98 patients qui ont subi une intervention chirurgicale pour pathologiquement confirmée carcinome gastrique dans le premier hôpital affilié du Collège de médecine de l'Université de Zhejiang entre 1998 et 2003 ont été obtenus. échantillons gastriques ont été utilisés avec le consentement des patients et l'autorisation des comités d'éthique des hôpitaux. Soixante-dix hommes et 28 femmes, âgés de 21 à 76 ans (âge médian 58 ans), ont été inclus dans cette étude. le diagnostic des patients inclus 78 cas de carcinome du sinus ventriculi, 16 cas de carcinome cardia, et 4 cas de cancer de l'estomac au total. Post-chirurgie rapports pathologiques diagnostiqués 2 adénocarcinomes bien différenciés, 21 adénocarcinomes modérément différenciées, 69 adénocarcinomes peu différenciés, 1 chevalière carcinome, 2 adénocarcinomes mucineux, et 3 dysplasie sévère avec cancérisation. Selon UICCTNM (1998), le grade histologique des échantillons a été déterminée à inclure 26 stade des cas I, 14 stade des cas II, 30 stades III cas, et 28 cas de stade IV. Le taux de suivi de nos patients était de 92%, avec 8 patients non disponible pour compléter le suivi. La période de suivi était entre 3 et 89 mois (durée médiane de 22 mois) après la chirurgie. Dix échantillons de muqueuse gastrique normale ont été examinés en tant que témoins. Dix-neuf échantillons de tissu frais gastrique de carcinome, le tissu paranéoplasique, et le tissu des ganglions lymphatiques périgastrique positif ont été collectés pour l'analyse Western blot. Dix échantillons de muqueuse gastrique normale ont également été inclus comme témoins.
Immunohistochimie
échantillons de paraffine ont été sectionnés en tranches de 4 um d'épaisseur qui ont été déparaffinées, hydratées et mis en incubation pendant 20 min dans 0,3% de H 2 O 2 pour inhiber l'activité de peroxydase endogène. Pour la récupération des antigènes, les échantillons ont été mises en incubation avec 0,1 M de tampon citrate (pH 6,0) et chauffé dans une cocotte-minute pendant 8 minutes. Après un rinçage dans du TBS, les lames ont été mises en incubation avec 3% de sérum d'âne normale (PDN) dans du TBS pendant 20 minutes pour éviter la liaison non spécifique du premier anticorps. Anti-RON anticorps monoclonal de lapin Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, USA) a été utilisé à 1: 400. Le kit Envision (DAKO) a été utilisé selon les instructions du fabricant, et l'anticorps lié a été détecté en utilisant DAB. Des échantillons ont également été co-colorées à l'hématoxyline. Les échantillons ont été observés au microscope optique et un PBS seule échantillon coloration a été utilisé comme un contrôle de fond. Les critères d'évaluation pour la détection
RON par immunohistochimie
L'évaluation de la qualité de la coloration a été déterminée en utilisant une procédure d'évaluation en aveugle par expérimenté pathologistes. champs de haute puissance (400 ×) en utilisant la microscopie de lumière standard ont été divisés en dix sections qui ont été marqués au hasard. Les cellules tumorales avec des particules dans le buffy intracytoplasm ont été notés comme positifs, et le pourcentage de cellules tumorales positives et intensité de la coloration pour chaque échantillon a été enregistrée. Les cellules tumorales qui ne tachent pour l'expression RON ont été marqués comme négatif, les cellules qui faiblement colorées ont été marqués comme 1, coloration modérée a été marqué avec un 2, et des échantillons de coloration fortement ont été marqués comme 3. Des cellules tumorales positives détectées, < 5% étaient négatifs, entre 5 et 24% ont été marqués comme 1, 25-49% ont été marqués avec un 2, et > 50% ont été marqués avec un 3. Le score cumulatif des cellules tumorales identifiées dans un échantillon déterminé score final d'un échantillon. Basé sur le score final, le tissu tumoral a été déterminé à être négatif (score de 0-2), ou positif (score de 3-6) pour l'expression RON.
Protein immunoblotting
Cinquante microgrammes de protéine totale pour chaque l'échantillon a été séparé par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10% et transféré sur une membrane de PVDF (Millipore). Détection de la protéine RON a été réalisée en utilisant un anticorps anti-RON anticorps monoclonal de lapin Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, États-Unis) (1: 400). La liaison d'anticorps a été visualisée en utilisant un anticorps anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort et un kit de chimioluminescence amélioré (ECL) (Biological Industries, Inc. Israël). β-actine a été utilisée comme témoin de chargement.
analyse statistique
SPSS 13.0 logiciel statistique a été utilisé pour identifier la signification statistique de nos données à l'aide de tables quadruple ou R × table C χ test 2. Les courbes de survie ont été évalués selon la méthode de Kaplan-Meier et la comparaison des taux de survie ont été testés à l'aide d'un test Log-rank
. Résultats
expression RON dans le tissu gastrique et tissus paranéoplasique
protéines RON a été observée dans le cytolymph, mais pas dans le nucléole, des cellules de carcinome gastrique et typiquement est apparu comme une leucocytaire granulo-coloration (Fig. 1). Le pourcentage de cellules tumorales positives et l'intensité de la coloration pour chaque échantillon a été enregistrée. Pour les 98 échantillons de patients évalués, l'expression a été observée dans RON 56,1% des tissus du carcinome gastrique (55/98), mais pas dans les échantillons de muqueuse gastrique normale. Dans un carcinome gastrique paranéoplasique tissu qui a été recueilli à partir de la couche muqueuse gastrique 0,5 cm des échantillons de carcinome gastrique, une protéine RON a été observée chez 25,6% des échantillons (29.8). Ces données représentent une différence statistique significative dans RON expression de la protéine entre le tissu de carcinome gastrique et son tissu paranéoplasique associé (χ 2 = 7.290, p = 0,007). Figure 1: Détection de l'expression par immunohistochimie RON. A, H) Détection de RON dans un échantillon d'adénocarcinome gastrique peu différencié. 200 × et 400 × grossissement. B, E) vue agrandie de la détection RON dans un échantillon de l'adénocarcinome gastrique peu différencié. 400 × 200 et un grossissement. C) La détection de RON dans un échantillon de carcinome chevalière. 400 × grossissement. D) La détection de RON dans un échantillon d'adénocarcinome gastrique modérément différencié. 400 × grossissement. F) La détection de RON dans un échantillon d'adénocarcinome gastrique modérément différencié. 200 × grossissement. G) La détection de RON dans un échantillon de carcinome chevalière. . 400 × grossissement
RON expression de la protéine par rapport à la pathologie du cancer gastrique
RON expression de la protéine n'a pas été trouvé d'être associé avec le sexe, l'âge, ou de la région malade (p
> 0,05). Cependant, dans les tissus de carcinome gastrique, le plus profond une cellule de carcinome infiltré, la protéine plus fortement RON a été exprimé (p = 0,019
). RON expression de la protéine a également été constaté une corrélation positive avec périgastrique métastase ganglionnaire et le stade de la pathologie clinique avec une signification statistique (p = 0,019
, p
= 0,001) (tableau 1). En revanche, il n'y avait pas de différences statistiquement significatives dans l'expression RON avec la classification de la pathologie, le type Borrmann, ou la présence de métastases. Cependant, il a été observé que l'expression RON a été plus forte dans le groupe Borrmann III /IV (63,6%) que dans le groupe Borrmann I /II (53,8%), la plus forte dans le groupe de métastases à distance (68,2%) que dans le non-lointain groupe de métastases (52,6%), et plus forte dans le groupe histologiquement inférieure différenciée (52,4%) que dans le groupe d'histologie modérément et hautement différenciés (39,1%). Il n'y avait pas de différences statistiques significatives pour ces comparaisons (p = 0,209; p = 0,400; p = 0,196), respectivement (tableau 1) .Table 1 Relation d'expression RON à la pathologie paramètres

RON
RON
Χ2
p
(+) (%)
( cancer gastrique précoce de) Profondeur
invasive
5 (29.4)
12
iNFILTRÉ à la couche musculaire
15 (51,7)
14
7.795
p - = 0,019
iNFILTRÉ à membrane séreuse
35 (67,3)
Stage 17
TNM Stade
14 (35,0) 26

12.245
p = 0,001
Stage
41 (70,7) 17

métastases à N0 de Adénopathies
11 (37,9) 18

N1-3
44 (63,8)
25
5.535
p = 0,019
Borrmann année
groupe I /II
14 (53,8) 12

III /IV
groupe 35 (63,6 )
20
0,708
p = 0,400
autres
6
11
histologie année
Modérément &
hautement différenciée 9 (39,1)
14
1.577
p = 0,209
moins différenciés *
39 (54,2) 33

Autres **
0 3
Distant Métastase
M0
40 (52,6) 36

1.675
p = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Inclut adénocarcinome mal différencié, le carcinome à cellules chevalière, adénocarcinome mucineux; ** Dysplasie sévère avec cancérisation.
RON expression et de survie
Pour les 90 patients inclus dans cette étude qui ont été suivis post-opérationnel, aucune différence statistiquement significative dans les taux de survie a été observée entre les patients atteints de carcinome gastrique RON positif échantillons par rapport à des échantillons RON-négatifs carcinome gastrique (Fig. 2). Figure 2 Courbe de survie pour RON + contre RON-patients.
détection du variant d'épissage RONΔ165
Dans les 19 échantillons de tissus de carcinome gastrique recueilli frais, ainsi que des tissus paranéoplasiques correspondant et pathologiquement confirmé ganglions lymphatiques périgastriques d'un carcinome métastatique, le variant d'épissage de RON, RONΔ165, a été exprimée. En revanche, aucune expression de la protéine RON a été observée dans la muqueuse gastrique normale ou d'un tissu de ganglions lymphatiques normaux (Fig. 3, 4). Figure 3 Analyse par transfert Western d'expression RON dans le tissu gastrique de carcinome, tissus paranéoplasique, et les ganglions lymphatiques périgastriques. Des échantillons en double de tissu de carcinome gastrique (T), les tissus paranéoplasique (P), et de ganglions lymphatiques métastatique (L), les tissus ont été analysés pour l'expression de RONΔ 165 (165 kDa). une muqueuse gastrique normale (N) et des ganglions lymphatiques normaux (NL) des échantillons de tissus ont été comparés. β-actine (44 kDa) a été utilisé comme un contrôle de chargement.
Figure 4 Analyse par Western blot d'expression RON dans le tissu gastrique de carcinome, le tissu paranéoplasique, et de la muqueuse gastrique normale. Des échantillons en double de tissu de carcinome gastrique (T) et le tissu paranéoplasique (P) ont été analysés pour l'expression de RONΔ165 (165 kDa) et comparés avec des échantillons normaux muqueuse gastrique (N) de tissus. Marker (M) et le contrôle positif (PC) (160 kDa) ont été inclus Discussion de
. Dans la présente étude, nous montrons à la fois par IHC et Western blot, que l'expression RON est non détectable dans la muqueuse gastrique normale. Ces observations concordent avec les résultats de Okino et al [8]. Cependant, la coloration de RON dans les tissus de carcinome et les tissus paranéoplasiques correspondants par IHC a montré une expression significative de RON par rapport à des échantillons de muqueuse gastrique normale. analyse Western blot a fourni des informations plus spécifiques concernant l'expression RON avec détection de RONΔ165 dans les tissus de carcinome gastrique, tissus paranéoplasiques correspondant, et les ganglions lymphatiques avec métastases cancéreuses. Ces données indiquent que l'expression de pleine longueur RON, ainsi qu'une variante de RON, sont exprimés au cours du processus de transformation maligne des cellules épithéliales gastriques. Sur la base de ces données et le travail dans d'autres études sur le rôle de RON dans phénotypes tumorigènes, nous émettons l'hypothèse que RON peut agir comme un oncogène pour favoriser l'apparition, la progression, l'invasion et les métastases du cancer gastrique.
Des études antérieures ont montré que l'expression de RON est en corrélation avec l'invasion des cellules tumorales. Maggiora et al [9] a rapporté que RON a été exprimé dans 55% des tissus du cancer de l'ovaire. En outre, si une lignée cellulaire de cancer de l'ovaire, qui exprime fortement RON est induite par MSP, la croissance des tumeurs et de l'invasion est considérablement améliorée. Sur la base de ces données, on a émis l'hypothèse que RON joue un rôle dans la progression du cancer de l'ovaire. De même, Chan et al [10] ont montré que l'expression de RON a favorisé la croissance et la transformation maligne des papillomes de la peau, et Cheng et al [6] a montré qu'une forte expression de RON dans des lignées cellulaires de cancer de la vessie en corrélation avec la prolifération accrue et une inhibition de l'apoptose. Cette dernière étude a également démontré que l'expression de RON dans le carcinome gastrique positivement corrélée avec la profondeur de l'estomac invasif des cellules cancéreuses et les métastases des ganglions lymphatiques, et le niveau d'expression augmente significativement avec les pathologies cliniques plus élevés de cancer gastrique. Par conséquent, une forte expression de RON dans les tissus de cancer gastrique peut servir de marqueur pour indiquer une transformation de cellules normales en un phénotype malin, qui associée à une augmentation invasion des cellules tumorales et des métastases, serait associée à un mauvais pronostic pour la survie à long terme. La proximité du tissu de cancer gastrique à la dysplasie épithéliale des résultats de l'estomac dans la sensibilité de la dysplasie épithéliale de l'estomac, des lésions précancéreuses. Par conséquent, en signalant l'expression de RON dans le tissu paranéoplasique, qui a été recueilli ~ 0,5 cm des échantillons de carcinome gastrique, nous fournissons des données pour appuyer notre hypothèse selon laquelle RON joue un rôle important dans la promotion de cancer gastrique et peut servir de marqueur pour la conversion des tissus à un phénotype malin.
Dans des études antérieures sur la relation entre RON expression et de survie, Lee et al [11] a révélé que MET et RON étaient des facteurs pronostiques indépendants de récidive à long terme du cancer du sein, et que des spécimens positifs pour MET et d'expression RON eu un taux de survie sans maladie significativement plus faible de 10 ans. De même, Cheng et al [6] ont rapporté un taux de survie plus faible pour les cancers de la vessie positifs pour les deux MET et RON. En revanche, nous avons constaté que le taux de patients positifs pour l'expression RON de survie n'a pas été inférieur au taux de survie pour le groupe RON négatif patient. Il est possible que le taux de patients atteints de cancer gastrique de survie peut être affectée par de nombreux facteurs, et nos données de suivi n'a pas été suffisante pour fournir des informations supplémentaires sur les facteurs qui pourraient être importants.
Conclusion
Les résultats de cette étude montrent que RON est exprimée dans le cancer gastrique, mais pas dans la muqueuse gastrique normale. En outre, le taux d'expression de RON dans le cancer gastrique est positivement corrélée avec la profondeur invasive, le stade pathologique clinique, et l'étendue des métastases des ganglions lymphatiques. Nous supposons que RON joue un rôle important dans la survenue, la progression, l'invasion et les métastases du cancer de l'estomac, et pourrait donc être un marqueur important pour évaluer le comportement biologique du cancer gastrique. Les déclarations du résultats de nos études fournissent une base à partir de laquelle d'identifier davantage les détails mécanistiques du rôle de RON dans le cancer gastrique afin d'identifier RON comme cible thérapeutique dans le cancer gastrique.
Remerciements
Ce travail a été financée par la subvention de la recherche scientifique du Bureau de la santé de la province du Zhejiang (n ° 491010-W10380) (n ° 2006B039) et Natural science Foundation de la province du Zhejiang, en Chine (n ° Y2080168).
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Les auteurs déclarent qu'ils avoir aucun conflit d'intérêts.

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