Ekspresjon av RON reseptor tyrosinkinase og dens forbindelse med gastrisk karsinom i forhold til normale gastrisk vev

Uttrykk for RON reseptortyrosinkinasehemming og sin tilknytning til magekreft versus normale mage vev
Abstract
Bakgrunn
RECEPTEUR d'origine nantais (RON) er en reseptor tyrosin kinase som aktiveres av en serum-avledet, makrofag-stimulerende protein (MSP) vekstfaktor og er uttrykt i mange ondartede svulster. Hensikten med denne studien var å avdekke protein uttrykk profilen til RON og sitt forhold til clinicopathological karakteristikker av magekreft og prognose.
Metoder
Gastric carcinoma vev fra 98 pasienter, sammen med 29 eksemplarer av paraneoplastic vev og 10 eksemplarer av normal mageslimhinnen, ble undersøkt ved immunhistokjemi (IHC). Western blot analyse av 19 prøver av magekreft vev og tilsvar paraneoplastic vev, 8 eksemplarer av normal mageslimhinnen, og 2 eksemplarer av normale lymfeknuteprøver også oppdaget uttrykk for en spleisevariant av RON, RONΔ165. Alle prøver som ble ledsaget av pasientoppfølging data som varierte fra 3 til 89 måneder (median tid: 22 måneder).
Resultater
frekvensen av positive RON uttrykk signifikant forskjellig mellom magekreft vev [56,1%, ( 55/98)] og paraneoplastiske vev [25,6% (8/29)] (p = 0,007). I motsetning til dette, RON ekspresjon var fraværende i normale mageslimhinnen prøver. RON uttrykk positivt korrelert med invasiv dybden av tumor (p = 0,019), noder perigastric lymfeknutemetastase (p = 0,019), og TNM trinn (p = 0,001). Imidlertid RON ekspresjon var uavhengig av tumorvekstmønster i henhold til Bormann kriterier (p = 0,209), histopatologisk grad (p = 0,196), og forekomsten av fjernmetastaser (p = 0,400). RON ekspresjon var ikke relatert til en pasients overlevelse (p = 0,195). RONΔ165 ble sterkt uttrykt i frisk gastrisk karsinom vev, tilsvar paraneoplastic vev, og perigastric lymfeknuter med metastaserende. I motsetning til dette, ble ekspresjon av RONΔ165 ikke observert i normale mageslimhinne og prøvene normal lymph node vev.
Konklusjon
RON ekspresjon er signifikant gastrisk karsinom vev og tilhørende paraneoplastic vev, men blir ikke uttrykt i normal gastrisk mucosa. Uttrykk for RONΔ165 ble likeledes observert i gastrisk karsinom vev og i metastaser til stede i lymfeknute vev. Vi hypotese at RON og dens spleisevariant spiller en viktig rolle i forekomsten, progresjon, og metastasering av gastrisk karsinom, og kan derfor representere en nyttig markør for å evaluere den biologiske aktivitet av gastrisk karsinom.
Bakgrunn
sykelighet fra mave carcinoma øker hvert år, mens debutalder er avtagende. I Kina er gastrisk karsinom toppen ondartet svulst i begge kategorier av sykelighet og dødelighet [1]. RECEPTEUR d'origine nantais (RON) er en reseptor tyrosin kinase (RTK) som tilhører MET proto-onkogen familien. Nyere studier av en RON knockout mus modell viser at fullstendig avbrytelse av RON-genet er dødelig embryo [2], viser at RON er viktig i embryoutvikling. RON aktiveres ved et serum-avledet, makrofag stimulerende protein (MSP) vekstfaktor, og studier har vist at RON er uttrykt i mange ondartede svulster og spiller en rolle i deres forekomst og progresjon.
Zhou et al. [3] fant at RON er sterkt uttrykt i kolorektal karsinom, og de identifisert tre spleisevarianter av RON (RONΔ160, RONΔ165, og RONΔ155). Uttrykket av RON og variantene var assosiert med utviklingen av tykktarmskreft. Andre studier har vist at ekspresjon av RON og dens spleisevarianter kan utfelles kolon epitelcelle-kolonidannelse og øke deres levedyktighet. Når uttrykk for RON og dens spleisevarianter ble angrepet av siRNA i endetarms svulst cellestammer, ble spredning og metatasis betydelig hemmet, samtidig med økt apoptose. Basert på disse dataene, er RON og dens spleisevarianter antatt å ha en viktig rolle i forekomsten, progresjon, og metastasering av endetarmskreft [4]. Tilsvarende studier av RON uttrykk i både bryst og blære kreft vev har vist økte nivåer av RON uttrykk og en sammenheng med histologisk grad [5, 6].
Så vidt vi vet, har rollen RON i magekreft bare studert ved Collesi et al [7]. I denne studien ble spleisevariant av RON, RONΔ165, ble detektert i gastrisk karsinom cellestamme, KATO-III. RONΔ165 ble vist å forbedre invasjonen av magekreftceller, noe som indikerer en rolle for spleisevariant av RON i den maligne transformasjon av gastriske celler til et karsinom. I denne studien undersøker vi uttrykk for RON i gastrisk karsinom vev av 98 pasienter ved hjelp av Envision immunhistokjemi (IHC) -metoden. For å undersøke uttrykk for RONΔ165, ble Western blotting av frisk gastrisk karsinom vev utført. Pasientene som deltok i vår studie ble overvåket mellom 3 og 89 måneder etter operasjon for å undersøke sammenhengen av RON uttrykk, inkludert dens spleisevariant, til clinicopathological egenskapene til magekreft og prognose. På grunn av den komplekse patogenesen av gastrisk karsinom, har terapeutisk effekt ikke vist seg å være meget effektiv. Derfor er det viktig å undersøke patogenesen av magekreft for å finne nye terapeutiske mål.
Metoder
pasientprøver
Parafin innebygd vevsprøver fra 98 pasienter som gjennomgikk kirurgi for patologisk bekreftet magekreft i First Affiliated Hospital av College of Medicine av Zhejiang University mellom 1998 og 2003 ble oppnådd. Gastric prøver ble brukt med samtykke fra pasientene og tillatelse fra etiske komiteer av sykehus. Sytti menn og 28 kvinner, i alderen 21 til 76 år (median alder 58 år), ble inkludert i denne studien. Pasient diagnose inkludert 78 tilfeller av sinus ventriculi karsinom, 16 tilfeller av mage Cardia karsinom, og 4 tilfeller av total magekreft. Post-kirurgi patologiske rapporter diagnostisert 2 godt differensierte adenokarsinomer, 21 moderat differensierte adenokarsinomer, 69 dårlig differensierte adenokarsinomer, en signetring cellekreft, 2 mucinkjertler adenokarsinomer, og tre alvorlig dysplasi med cancerization. Ifølge UICCTNM (1998), ble det histologiske grad av prøvene bestemt til å omfatte 26 trinn I tilfeller 14 trinn II tilfeller, 30 trinn III tilfeller, og 28 stadium IV tilfeller. Oppfølgings sats for våre pasienter var 92%, med 8 pasienter ikke tilgjengelig for å fullføre oppfølging. Den oppfølgingsperioden var mellom 3 og 89 måneder (median tid på 22 måneder) etter operasjonen. Ti prøver av normal gastrisk mucosa ble undersøkt som kontroller. Nitten prøver av fersk gastrisk karsinom vev, paraneoplastic vev, og positiv perigastric lymfeknute vev ble oppsamlet for Western blot-analyse. Ti prøver av normal mageslimhinnen ble også inkludert som kontroller.
Immunohistochemistry
Parafin prøvene ble delt inn i 4 mikrometer tykke skiver som ble deparaffinized, hydrert og ruges i 20 min i 0,3% H 2o 2 å hemme endogen peroksidase aktivitet. For antigen gjenfinning, ble prøvene inkubert med 0,1 M citratbuffer (pH 6,0) og oppvarmet i en trykkoker i 8 min. Etter skylling i TBS, ble platene inkubert med 3% normalt esel serum (NDS) i TBS i 20 minutter for å forhindre ikke-spesifikk binding av det første antistoffet. Anti-kanin RON monoklonalt antistoff Ron β (C-20) (Santa Cruz Bioteknologi, USA) ble anvendt ved 1: 400. Envision kit (DAKO) ble brukt i henhold til produsentens anvisninger, og bundet antistoff ble påvist ved bruk av DAB. Prøvene ble også co-farget med hematoksylin. Prøvene ble observert under et lysmikroskop og en PBS-bare flekker prøven ble brukt som bakgrunn kontroll.
Evalueringskriterier for RON deteksjon av immunhistokjemi
vurdering av graden av farging ble bestemt ved bruk av en blindet evaluering prosedyre av erfarne patologer. Høyt strømforbruk felt (400 ×) ved hjelp av standard lys mikroskopi ble delt inn i ti deler som ble tilfeldig scoret. Tumorceller med buffy partikler i intracytoplasm ble scoret som positive, og andelen positive tumorceller og fargeintensitet for hver prøve ble registrert. Tumorceller som ikke flekke for RON uttrykk ble scoret som negativ, celler som svakt farget ble scoret som en moderat farging ble scoret med en 2, og sterkt flekker prøver ble scoret som 3. Av de positive tumorceller oppdaget, < 5% var negative, mellom 5 og 24% ble scoret som 1, 25-49% ble scoret med en 2, og > 50% ble scoret med en 3. Den kumulative resultatet av tumorceller som er identifisert i en prøve bestemmes en prøve endelige resultatet. Basert på sluttresultatet, ble svulstvevet fast bestemt på å være negativ (score på 0-2), eller positiv (score på 3-6) for RON uttrykk.
Protein immunoblotting
Femti mikrogram total protein for hver prøven ble separert ved elektroforese på en 10% polyakrylamid-gel og overført til PVDF-membran (Millipore). Påvisning av RON protein ble utført ved anvendelse av et anti-RON kanin-monoklonalt antistoff Ron β (C-20) (Santa Cruz Bioteknologi, USA) (1: 400). Antistoff-binding ble visualisert ved anvendelse av en anti-kanin antistoff konjugert til pepperrotperoksidase og et forbedret kjemiluminescens kit (ECL) (Biological Industries, Inc., Israel). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
Statistisk analyse
SPSS 13,0 statistisk programvare ble anvendt for å identifisere den statistiske signifikans av de data ved hjelp av firedelte tabeller eller R x C tabell χ 2-test. Overlevelseskurver ble evaluert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenligninger av overlevelse ble testet ved hjelp av en Log-rank test
. Resultater
RON uttrykk i mage vev og paraneoplastic vev
RON protein ble observert i cytolymph, men ikke i den kjerne, av gastrisk karsinom celler og vanligvis fremsto som et brungule granulo-farging (fig. 1). Prosentandelen av positive tumorceller, og den fargeintensitet for hver enkelt prøve ble registrert. For de 98 pasientprøver evaluert, ble RON ekspresjon observert hos 56,1% av gastrisk karsinom vev (55/98), men ikke i prøver av normal gastrisk mucosa. I magekreft paraneoplastic vev, som ble hentet fra slimete mage lag 0,5 cm unna magekarsinom prøvene, ble RON protein observert hos 25,6% av prøvene (8/29). Disse data representerer en betydelig statistisk forskjell i RON protein uttrykk mellom magekreft vev og tilhørende paraneoplastic vev (χ 2 = 7,290, p = 0,007). Figur 1 Påvisning av RON uttrykk ved immunhistochemistry. A, H) Påvisning av RON i et dårlig differensiert adenokarsinom i ventrikkel prøven. 200 × og 400 × forstørrelse. B, E) Forstørret visning av RON deteksjon i en prøve av dårlig differensiert adenokarsinom i ventrikkel. 400 × og 200 × forstørrelse. C) Påvisning av RON i en prøve av signet-ring cellekreft. 400 × forstørrelse. D) Påvisning av RON i en prøve av moderat differensiert adenokarsinom i ventrikkel. 400 × forstørrelse. F) Påvisning av RON i en prøve av moderat differensiert adenokarsinom i ventrikkel. 200 × forstørrelse. G) Påvisning av RON i en prøve av signet-ring cellekreft. . 400 × forstørrelse
RON protein uttrykk i forhold til patologi av magekreft
RON protein uttrykk ble ikke funnet å være assosiert med kjønn, alder eller syke region (p
> 0,05). Men i gastrisk karsinom vev, jo dypere et karsinomcellelinje infiltrert, ble sterkere RON protein uttrykt (p
= 0,019). RON protein uttrykk ble også funnet å positivt korrelert med perigastric lymfeknutemetastase og klinisk patologi scenen med statistisk signifikans (p
= 0,019, p
= 0,001) (tabell 1). I kontrast, var det ingen signifikante statistiske forskjeller i RON uttrykk med patologi gradering, Borrmann type, eller tilstedeværelse av metastaser. Det ble imidlertid observert at RON ekspresjon var sterkere i Borrmann III /IV-gruppen (63,6%) enn i Borrmann I /II-gruppen (53,8%), sterkere i fjern metastase-gruppen (68,2%) enn i den ikke-fjernt metastase-gruppen (52,6%), og sterkere i histologisk nedre differensiert gruppe (52,4%) enn i moderat og sterkt differensiert histologi gruppe (39,1%). Det var ingen signifikante statistiske forskjeller for disse sammenligningene (p = 0,209, p = 0,400, p = 0,196), henholdsvis (tabell 1) .table en forholdet mellom RON uttrykk for patologi parametere

RON
RON
Χ2
p product: (+) (%) plakater ( -)
Invasive Dybde
Tidlig magekreft
5 (29,4)
12
Infiltrerte til muskulære laget
15 (51,7)
14
7,795
p = 0,019
Infiltrerte til serøs membran
35 (67,3)
17
TNM Stage
Stage
14 (35,0)
26
12,245
p = 0,001
Stage
41 (70,7)
17
metastaser til lymfeknuter
N0
11 (37,9)
18
N1-3
44 (63,8)
25
5,535
p = 0,019
Borrmann Grade
I /II gruppe
14 (53,8)
12
III /IV gruppe
35 (63,6 )
20
0,708
p = 0,400
Andre
6
11
Histologi Grade
Middels & svært differensiert
9 (39,1)
14
1,577
p = 0,209
Mindre differensiert *
39 (54,2)
33
Andre **
0
3
fjernmetastaser
M0
40 (52,6)
36
1,675
p = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Inkluderer dårlig differensiert adenokarsinom, signet-ring cellekreft, mucinous adenokarsinom; ** Alvorlig dysplasi med cancerization.
RON uttrykk og overlevelse
For de 90 pasientene som deltok i denne studien som ble fulgt post-operativt, ble ingen signifikant statistisk forskjell i overlevelse funnet mellom pasienter med RON-positive magekarsinom prøver versus RON-negative magekarsinom prøver (fig. 2). Figur 2 Survival kurve for RON + versus RON-pasienter.
Påvisning av RONΔ165 spleisevariant
I 19 prøver av fersk gastrisk karsinom vev samlet, sammen med tilsvarende paraneoplastic vev, og patologisk bekreftet perigastric lymfeknuter med metastaserende, skjøte variant av RON, RONΔ165, ble uttrykt. I motsetning til dette ble ingen ekspresjon av RON protein observert i normal gastrisk mucosa eller normal lymph node vev (Fig. 3, 4). Figur 3 Western blot-analyse av RON ekspresjon i gastrisk karsinom vev, paraneoplastic vev, og perigastric lymfeknuter. Duplikat prøver av gastrisk karsinom vev (T), paraneoplastic vev (P), og metastatisk lymfeknute (L) vev ble analysert for ekspresjon av RONΔ 165 (165 kDa). Normal gastrisk mucosa (N) og vevsprøver normal lymph node (NL) ble sammenlignet. β-aktin (44 kDa) ble anvendt som en kontroll lasting.
Figur 4 Western blot analyse av RON ekspresjon i gastrisk karsinom vev, paraneoplastic vev, og normal gastrisk mucosa. Duplikat prøver av gastrisk karsinom vev (T) og paraneoplastic vev (P) ble analysert for ekspresjon av RONΔ165 (165 kDa) og sammenlignet med normale gastriske slimhinne (N) vevsprøver. Marker (M) og positiv kontroll (PC) (160 kDa) ble inkludert.
Diskusjon
I denne studien, viser vi både IHC og Western blot, som RON uttrykk er ikke synlig i normal mageslimhinnen. Disse observasjonene stemmer overens med resultatene fra Okino et al [8]. Men farging av RON i karsinom vev og tilhørende paraneoplastic vev ved IHC viste signifikant uttrykk for RON forhold til normale mageslimhinnen prøver. Western blot analyse gitt mer spesifikk informasjon om RON uttrykk med påvisning av RONΔ165 i magekreft vev, tilsvar paraneoplastic vev og lymfeknuter med carcinoma metastaser. Disse data indikerer at ekspresjon av full-lengde RON, samt en variant av RON, blir uttrykt under prosessen med malign transformasjon av mage-epitelceller. Basert på disse data og arbeide i andre studier på rollen RON i tumorigene fenotyper, hypotese vi at RON kan fungere som et onkogen å fremme forekomst, progresjon, invasjon og metastasering av magekreft.
Tidligere studier har vist at ekspresjon av RON korrelerer med invasjon av tumorceller. Maggiora et al [9] rapporterte at RON ble uttrykt i 55% av eggstokkreft vev. Videre, hvis en ovarial cancer-cellelinjen som sterkt uttrykker RON er indusert av MSP, tumorvekst og invasjon betraktelig forbedret. Basert på disse dataene, ble det antatt at RON spiller en rolle i utviklingen av eggstokkreft. Tilsvarende Chan et al [10] viste at uttrykket av RON fremmet vekst og malign transformasjon av hud papillomer, og Cheng et al [6] viste at sterk uttrykk for RON i blærekreftcellelinjer korrelert med økt spredning og apoptose hemming. Sistnevnte Studien viste også at uttrykket av RON i gastrisk karsinom positivt korrelert med invasiv dybden av magekreftcellen og lymfeknuter metastase, og nivået av ekspresjon økte signifikant med høyere kliniske patologi av magekreft. Derfor kan sterk ekspresjon av RON i magekreft vev tjene som en markør for å indikere en omdannelse av normale celler til en malign fenotype, som assosiert med økt tumorcelle-invasjon og metastase, ville være assosiert med en dårlig prognose for langtidsoverlevelse. Nærheten av magekreft vev til epitelial dysplasi av magen resultatene i hvilken grad epitel dysplasi i magen til forstadier til kreft. Derfor ved å rapportere uttrykk for RON i paraneoplastic vev, som ble samlet ~ 0,5 cm unna magekarsinom prøvene, gir vi data for å støtte vår hypotese om at RON spiller en viktig rolle i å fremme magekreft og kan tjene som en markør for konvertering av vev til en ondartet fenotype.
i tidligere studier som ser på sammenhengen mellom RON uttrykk og overlevelse, Lee et al [11] fant at MET og RON var uavhengige prognostiske faktorer av langsiktige tilbakefall av brystkreft, og at eksemplarer som positivt for MET og RON uttrykk hadde signifikant lavere 10-års sykdomsfri overlevelse. Tilsvarende Cheng et al [6] rapporterte en lavere overlevelsesrate for blærekreft positive for både MET og RON. I kontrast, fant vi at overlevelsen av pasienter positive for RON uttrykk var ikke lavere enn overlevelse for RON-negative pasientgruppen. Det er mulig at overlevelsen av pasienter med magekreft kan påvirkes av mange faktorer, og våre oppfølgingsdata var ikke tilstrekkelig til å gi større innsikt i hvilke faktorer som kan være viktig.
Konklusjon
Resultatene av denne studien viser at RON er uttrykt i magekreft, men ikke i normal gastrisk mucosa. Videre uttrykket frekvensen av RON i magekreft positivt korrelerer med invasiv dybde, klinisk patologiske scenen, og omfanget av lymfeknutemetastase. Vi hypotese at RON spiller en viktig rolle i forekomsten, progresjon, invasjon og metastasering av magekreft, og derfor kunne være en viktig markør i vurderingen av biologiske oppførsel av magekreft. Resultatene fra våre studier gir grunnlag for å ytterligere identifisere de mekanistiske detaljer om rollen RON i magekreft for å identifisere RON som et terapeutisk mål i magekreft.
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble finansiert av Scientific Research Grant of Health Bureau of Zhejiang-provinsen (nr 491010-W10380) (nr 2006B039) og Science Foundation i Zhejiang-provinsen i Kina (No. Y2080168) Natural.
Forfattere 'originale sendt filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 12885_2008_1291_MOESM1_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 1 12885_2008_1291_MOESM2_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 2 12885_2008_1291_MOESM3_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 3 12885_2008_1291_MOESM4_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 4 Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

• Laparoskopisk justerbar bøyle Roux-en-y gastrisk bypass som en primær prosedyre for super-super-overvektige (kroppsmasseindeks > 60 kg /m2)
• Økt risiko for adenokarsinom i ventrikkel etter behandling av primær mage diffuse store B-celle lymphoma