L'espressione del recettore della tirosin-chinasi RON e la sua associazione con carcinoma gastrico rispetto ai normali tessuti gastrici

Espressione della chinasi RON recettore tirosin e la sua associazione con carcinoma gastrico rispetto ai normali tessuti gastrici
Abstract
sfondo
Recepteur d'origine Nantais (RON) è un recettore tirosina chinasi che viene attivato da un siero di derivazione, macrofagi stimolante proteine ​​(MSP) fattore di crescita e viene espressa in molti tumori maligni. Lo scopo del presente studio è stato quello di rivelare il profilo di espressione proteica di RON e il suo rapporto con le caratteristiche clinico-patologici di carcinoma gastrico e la prognosi.
Metodi
tessuto carcinoma gastrico da 98 pazienti, insieme a 29 campioni di tessuto paraneoplastica e 10 esemplari di normale mucosa gastrica, sono stati esaminati mediante immunoistochimica (IHC). Analisi Western Blot di 19 campioni di tessuto carcinoma gastrico e corrispondenti tessuti paraneoplastic, 8 esemplari di normale mucosa gastrica, e 2 esemplari di normali campioni linfonodali anche rilevato espressione di una variante di splicing di RON, RONΔ165. Tutti i campioni ottenuti sono stati accompagnati da dati di follow-up del paziente, che variava da 3 a 89 mesi (tempo medio: 22 mesi).
Risultati
Il tasso di espressione positiva RON differiva in modo significativo tra i tessuti carcinoma gastrico [56,1%, ( 55/98)] e nei tessuti paraneoplastiche [25,6%, (8/29)] (p = 0,007). Al contrario, l'espressione RON era assente nelle normali campioni di mucosa gastrica. espressione RON correlata positivamente con la profondità invasiva del tumore (p = 0,019), la linfa perigastrica nodi metastasi (p = 0.019), e lo stadio TNM (p = 0,001). Tuttavia, l'espressione RON era indipendente modello di crescita del tumore in base a criteri Bormann (p = 0,209), di grado istopatologico (p = 0,196), e l'incidenza di metastasi a distanza (p = 0,400). espressione di Ron non era legato a tasso di sopravvivenza di un paziente (p = 0,195). RONΔ165 è stata fortemente espresso in fresco tessuto carcinoma gastrico, corrispondente tessuto paraneoplastica, e linfonodi perigastrici con carcinoma metastatico. In contrasto, l'espressione di RONΔ165 non è stata osservata in mucosa gastrica e normali campioni di tessuto linfonodale.
Conclusione
espressione RON è significativa nel tessuto carcinoma gastrico e corrispondenti tessuti paraneoplastica, ma non è espresso in mucosa gastrica. Espressione dei RONΔ165 era ugualmente osservata nel tessuto carcinoma gastrico e in metastasi presenti nei tessuti linfonodali. Noi ipotizziamo che RON e la sua variante splice svolgono un ruolo importante nella comparsa, progressione e metastasi del carcinoma gastrico, e quindi può rappresentare un marcatore utile per valutare l'attività biologica del carcinoma gastrico.
Sfondo
morbidità gastrica il carcinoma è in aumento ogni anno, mentre l'età di insorgenza è in diminuzione. In Cina, il carcinoma gastrico è il tumore maligno superiore in entrambe le categorie di morbilità e mortalità [1]. Recepteur d'origine Nantais (RON) è un recettore tirosin-chinasi (RTK), che appartiene alla famiglia proto-oncogene MET. Recenti studi di un modello di topo knockout RON mostra che completa disgregazione del gene RON è embrionale letale [2], dimostrando che RON è essenziale nello sviluppo embrionale. RON viene attivato da un fattore di crescita siero derivato, macrofagi stimolante proteine ​​(MSP), e gli studi hanno dimostrato che RON è espressa in molti tumori maligni e svolge un ruolo nella loro insorgenza e la progressione.
Zhou et al. [3] ha trovato che Ron è fortemente espresso nei carcinomi del colon-retto, e hanno identificato tre varianti di splicing di RON (RONΔ160, RONΔ165, e RONΔ155). L'espressione di RON e le sue varianti è stata associata con la progressione del carcinoma colorettale. Altri studi hanno dimostrato che l'espressione di RON e le sue varianti di splicing può precipitare colon epiteliali formazione di colonie di cellule e aumentare la loro vitalità. Quando l'espressione di RON e le sue varianti di splicing sono stati bersaglio di siRNA in ceppi di cellule tumorali del retto, la proliferazione e metatasis erano significativamente inibiti, in concomitanza con un aumento dell'apoptosi. Sulla base di questi dati, RON e le sue varianti di splicing sono ipotizzato di avere un ruolo importante nella comparsa, progressione e metastasi del cancro rettale [4]. Allo stesso modo, gli studi di espressione RON in entrambi i tessuti del cancro al seno e della vescica ha mostrato un aumento dei livelli di espressione RON e una correlazione con il grado istologico [5, 6].
A nostra conoscenza, il ruolo di RON a cancro gastrico è stato studiato solo da Collesi et al [7]. In questo studio la variante di splicing di RON, RONΔ165, è stato rilevato nel ceppo di cellule di carcinoma gastrico, KATO-III. RONΔ165 ha dimostrato di migliorare l'invasione delle cellule di cancro gastrico, indicando un ruolo per la variante di splicing del RON nella trasformazione maligna di cellule gastriche ad un carcinoma. In questo studio, esaminiamo l'espressione di RON nel tessuto carcinoma gastrico di 98 pazienti con il metodo Envision immunoistochimica (IHC). Per esaminare l'espressione di RONΔ165, Western blotting di fresco tessuto carcinoma gastrico è stata eseguita. I pazienti arruolati nel nostro studio sono stati monitorati tra i 3 ei 89 mesi dopo l'operazione per valutare l'associazione di espressione RON, compresa la sua variante di splicing, alle caratteristiche clinico-patologici di carcinoma gastrico e la prognosi. A causa della complessa patogenesi del carcinoma gastrico, l'efficacia terapeutica non ha dimostrato di essere molto efficace. Pertanto, è importante studiare la patogenesi del carcinoma gastrico per trovare nuovi bersagli terapeutici.
Metodi
campioni dei pazienti
campioni di tessuto paraffina da 98 pazienti che hanno subito un intervento chirurgico per patologicamente confermato carcinoma gastrico nel primo ospedale affiliato di college of Medicine di Zhejiang University tra il 1998 e il 2003 sono stati ottenuti. campioni gastrici sono stati utilizzati con il consenso dei pazienti e l'autorizzazione dei comitati etici di ospedali. Settanta uomini e 28 donne, di età compresa tra 21 e 76 anni (età media 58 anni), sono stati inclusi in questo studio. la diagnosi del paziente incluso 78 casi di carcinoma del seno ventriculi, 16 casi di carcinoma cardias, e 4 casi di carcinoma gastrico totale. Post-chirurgia rapporti patologici diagnosticati 2 adenocarcinomi ben differenziati, 21 adenocarcinomi moderatamente differenziati, 69 adenocarcinomi scarsamente differenziati, 1 carcinoma delle cellule ad anello con castone, 2 adenocarcinomi mucinose, e 3 displasia severa con cancerizzazione. Secondo UICCTNM (1998), il grado istologico dei campioni è stato determinato per includere 26 stadio I casi, 14 casi fase II, 30 casi fase III, e il 28 stadio IV casi. Il tasso di follow-up per i nostri pazienti è stata del 92%, con 8 pazienti non disponibile per completare il follow-up. Il periodo di follow-up è stato tra i 3 ei 89 mesi (tempo mediano di 22 mesi) dopo l'intervento. Dieci campioni di mucosa gastrica sono stati esaminati come controlli. Diciannove campioni di fresco tessuto gastrico carcinoma, tessuti paraneoplastica, e perigastrica tessuto linfonodale positivo sono stati raccolti per analisi Western Blot. Dieci campioni di mucosa gastrica sono stati inclusi anche come controlli.
Immunoistochimica
campioni di paraffina sono stati sezionati in 4 micron fette spesse che sono stati deparaffinate, idratata e incubate per 20 min a 0,3% H 2O 2 di inibire l'attività della perossidasi endogena. Per recupero dell'antigene, i campioni sono stati incubati con 0,1 M tampone citrato (pH 6,0) e riscaldato in una pentola a pressione per 8 min. Dopo lavaggio in TBS, i vetrini sono stati incubati con 3% di siero normale asino (NDS) in TBS per 20 min per prevenire il legame non specifico del primo anticorpo. Anti-RON coniglio anticorpo monoclonale Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotecnologie, USA) è stato utilizzato a 1: 400. Il kit Envision (DAKO) è stato utilizzato in base alle istruzioni del produttore, e anticorpo legato è stato rilevato usando DAB. I campioni sono stati anche co-colorate con ematossilina. I campioni sono stati osservati al microscopio ottico ed un PBS solo campione colorazione è stato utilizzato come controllo sfondo.
Criteri di valutazione per il rilevamento RON mediante immunoistochimica
La valutazione del grado di colorazione è stato determinato utilizzando una procedura di valutazione in cieco da esperti patologi. campi ad alta potenza (400 ×) utilizzando la microscopia ottica standard, sono stati divisi in dieci sezioni che sono stati segnati in maniera casuale. Le cellule tumorali con particelle buffy nel intracytoplasm stati segnati come positivo, ed è stato registrato la percentuale di cellule tumorali positive e l'intensità della colorazione per ciascun campione. Le cellule tumorali che non si macchiano di espressione RON sono stati segnati come negativi, le cellule che debolmente macchiati sono stati segnati come 1, colorazione moderata è stato segnato con un 2, e campioni fortemente colorazione sono stati segnati come 3. delle cellule tumorali positive rilevate, < 5% sono risultati negativi, tra il 5 e il 24% sono stati segnati come 1, 25-49% sono stati segnati con un 2, e > Il 50% sono stati segnati con un 3. Il punteggio cumulativo delle cellule tumorali individuate in un campione determinato punteggio finale di un campione. Sulla base del punteggio finale, il tessuto tumorale è stato determinato per essere negativo (punteggio di 0-2), o positivo (punteggio di 3-6) per l'espressione RON.
Proteine ​​immunoblotting
Cinquanta microgrammi di proteine ​​totali per ogni campione è stato separato mediante elettroforesi su un gel di poliacrilammide al 10% e trasferito su una membrana PVDF (Millipore). Individuazione di proteine ​​RON è stata effettuata utilizzando un anti RON-anticorpo monoclonale di coniglio Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotecnologie, Stati Uniti d'America) (1: 400). legame degli anticorpi è stato visualizzato utilizzando un anticorpo anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano e un kit di chemiluminescenza (ECL) (Industries biologici, Inc. Israele). β-actina è stato utilizzato come controllo di caricamento.
analisi statistica
SPSS 13.0 software statistico è stato utilizzato per identificare la significatività statistica dei nostri dati utilizzando quadruplici tabelle o R × tabella C χ 2 test. Le curve di sopravvivenza sono state valutate con il metodo Kaplan-Meier e il confronto di tassi di sopravvivenza sono stati testati utilizzando un log-rank test
. Risultati
espressione RON in tessuto gastrico e del tessuto paraneoplastic
proteine ​​RON è stata osservata nel cytolymph, ma non nel nucleolo, di cellule di carcinoma gastrico e tipicamente apparso come buffy granulo-colorazione (Fig. 1). La percentuale di cellule tumorali positive e l'intensità di colorazione per ciascun campione è stato registrato. Per i campioni dei pazienti 98 valutati, espressione RON è stata osservata nel 56,1% dei tessuti carcinoma gastrico (55/98), ma non in campioni di mucosa gastrica. Nel carcinoma gastrico tessuto paraneoplastica, che è stato raccolto dalla mucosa gastrica 0,5 strato di cm di distanza dai campioni carcinoma gastrico, la proteina RON è stata osservata nel 25,6% dei campioni (8/29). Questi dati rappresentano una differenza statistica significativa nel espressione della proteina RON tra tessuto carcinoma gastrico e il suo tessuto paraneoplastica associata (χ 2 = 7.290, p = 0,007). Figura 1 Rilevazione di RON espressione da immunhistochemistry. A, H) Rilevamento di RON in un campione di adenocarcinoma gastrico scarsamente differenziato. 200 × 400 × e ingrandimenti. B, E) Visualizzazione ingrandita della rilevazione RON in un campione di scarsamente differenziato adenocarcinoma gastrico. 400 × 200 ×. C) Rilevamento di RON in un campione di carcinoma a cellule ad anello con castone. 400 × ingrandimento. D) Il rilevamento di RON in un campione di adenocarcinoma gastrico moderatamente differenziato. 400 × ingrandimento. F) Rilevamento di RON in un campione di adenocarcinoma gastrico moderatamente differenziato. 200 × ingrandimento. G) Rilevamento di RON in un campione di carcinoma a cellule ad anello con castone. . 400 × ingrandimento
espressione della proteina RON in relazione alla patologia del carcinoma gastrico
espressione della proteina RON non è stata trovata per essere associate a sesso, età, regione o malati (p
> 0,05). Tuttavia, nei tessuti carcinoma gastrico, il più profondo di una cella di carcinoma infiltrata, la proteina più fortemente RON è stata espressa (p = 0,019
). espressione della proteina RON è risultata correlata positivamente con perigastrica metastasi linfonodali e lo stadio patologia clinica con significatività statistica (p = 0,019
, p
= 0,001) (Tabella 1). Al contrario, non vi erano differenze statisticamente significative nell'espressione RON con la classificazione patologia, tipo Borrmann, o la presenza di metastasi. Tuttavia, è stato osservato che l'espressione RON era più forte nel gruppo Borrmann III /IV (63,6%) rispetto al gruppo Borrmann I /II (53,8%), forte nel gruppo metastasi a distanza (68,2%) rispetto al non lontano gruppo di metastasi (52,6%), e più forte nel gruppo istologicamente più bassa differenziata (52,4%) rispetto al gruppo istologico moderatamente e altamente differenziata (39,1%). Non ci sono state differenze statisticamente significative per questi confronti (p = 0.209; p = 0.400; p = 0.196), rispettivamente (Tabella 1) .table 1 Relazione di espressione RON alla patologia parametri

RON
RON
Χ2
p
(+) (%)
( -) Profondità
invasiva
precoce cancro gastrico
5 (29,4)
12
un'irruzione per strato muscolare
15 (51,7)
14
7,795
p = 0,019
infiltrato a membrana sierosa
35 (67,3)
17
TNM fase
fase
14 (35,0)
26
12.245
p = 0.001
fase
41 (70,7)
17
metastasi ai linfonodi
N0
11 (37,9)
18
N1-3
44 (63,8)
25
5.535
p = 0.019
Borrmann Grade
gruppo I /II
14 (53,8)
12
III /IV gruppo
35 (63.6 )
20
0,708
p = 0.400
Terzi 6
11
Istologia grado
moderatamente & altamente differenziato
9 (39,1)
14
1.577
p = 0,209
meno differenziata *
39 (54,2)
33
Altro **
0 3
metastasi a distanza
M0
40 (52,6)
36
1.675
p = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Include adenocarcinoma scarsamente differenziato, carcinoma a cellule ad anello con castone, adenocarcinoma mucinoso; ** Displasia grave con cancerizzazione.
RON espressione e tassi di sopravvivenza
per i 90 pazienti arruolati in questo studio che sono stati seguiti post-operativamente, nessuna differenza statistica significativa nel tasso di sopravvivenza è stata riscontrata tra i pazienti con carcinoma gastrico RON-positivi campioni rispetto RON-negativi campioni di carcinoma gastrico (Fig. 2). Figura 2 Curva di sopravvivenza per RON + rispetto a Ron-pazienti.
rilevamento della RONΔ165 giunzione variante
Nei 19 campioni di tessuti di carcinoma gastrico fresche raccolte, insieme con i corrispondenti tessuti paraneoplastiche, e patologicamente confermato linfonodi perigastrici con carcinoma metastatico, la variante di splicing di RON, RONΔ165, è stato espresso. Al contrario, nessuna espressione di proteine ​​RON stata osservata in mucosa gastrica o tessuto normale linfonodi (Fig. 3, 4). Figura 3 Analisi Western Blot di espressione RON nel tessuto gastrico carcinoma, tessuti paraneoplastica, e linfonodi perigastrici. campioni duplicati di tessuto gastrico carcinoma (T), tessuto paraneoplastica (P), e tessuti metastatico linfonodali (L) sono stati analizzati per l'espressione di RONΔ 165 (165 kDa). mucosa gastrica normale (N) e campioni di tessuto normale linfonodi (NL) sono stati confrontati. β-actina (44 kDa) è stato utilizzato come controllo di caricamento.
Figura 4 Analisi Western blot dell'espressione RON in tessuto gastrico carcinoma, tessuti paraneoplastica e mucosa gastrica. campioni duplicati di tessuto gastrico carcinoma (T) e il tessuto paraneoplastica (P) sono stati analizzati per l'espressione di RONΔ165 (165 kDa) e confrontati con campioni di tessuto normale mucosa gastrica (N). Marker (M) e il controllo positivo (PC) (160 kDa) sono stati inclusi
. Discussione
Nel corso di studio, dimostriamo sia da IHC e Western Blot, che l'espressione RON non è rilevabile nel normale mucosa gastrica. Queste osservazioni sono coerenti con i risultati di Okino et [8] al. Tuttavia, la colorazione di RON nei tessuti di carcinoma e corrispondenti tessuti paraneoplastiche di IHC mostrato una significativa espressione di RON rispetto ai normali campioni di mucosa gastrica. Analisi Western Blot ha fornito informazioni più specifiche per quanto riguarda l'espressione RON con rilevamento di RONΔ165 nei tessuti carcinoma gastrico, corrispondente tessuti paraneoplastiche, e linfonodi con metastasi di carcinoma. Questi dati indicano che l'espressione di full-length RON, nonché una variante di RON, sono espressi durante il processo di trasformazione maligna delle cellule epiteliali gastriche. Sulla base di questi dati e di lavoro in altri studi sul ruolo di RON a fenotipi tumorali, ipotizziamo che RON può agire come un oncogene per promuovere l'insorgenza, progressione, invasione e metastasi del tumore gastrico.
Precedenti studi hanno dimostrato che espressione di RON correla con l'invasione delle cellule tumorali. Maggiora et al [9] ha riferito che Ron è stato espresso nel 55% dei tessuti di cancro ovarico. Inoltre, se una linea di cellule di cancro ovarico che esprime fortemente RON è indotta da MSP, la crescita del tumore e l'invasione è notevolmente migliorata. Sulla base di questi dati, è stato ipotizzato che RON svolge un ruolo nella progressione del cancro ovarico. Allo stesso modo, Chan et al [10] ha dimostrato che l'espressione di RON ha promosso la crescita e la trasformazione maligna di papillomi cutanei, e Cheng et al [6] ha dimostrato che una forte espressione di RON in linee cellulari di cancro della vescica correlata con una maggiore proliferazione e l'inibizione dell'apoptosi. Quest'ultimo studio ha anche dimostrato che l'espressione di RON nel carcinoma gastrico correlato positivamente con la profondità invasiva della gastrico delle cellule tumorali e linfonodi metastasi, e il livello di espressione è aumentata in modo significativo con una maggiore patologie cliniche di cancro gastrico. Pertanto, forte espressione di RON nei tessuti di cancro gastrico può servire come marcatore per indicare una conversione delle cellule normali a un fenotipo maligno, che associata ad un aumento invasione delle cellule tumorali e metastasi, sarebbe associata a una prognosi infausta per la sopravvivenza a lungo termine. La vicinanza del tessuto cancro gastrico alla displasia epiteliale dei risultati stomaco nella suscettibilità della displasia epiteliale dello stomaco per lesioni precancerose. Pertanto, riportando l'espressione di RON nel tessuto paraneoplastica, che è stato raccolto ~ 0,5 cm di distanza dai campioni di carcinoma gastrico, stiamo fornendo i dati per sostenere la nostra ipotesi che Ron ha un ruolo importante nella promozione di cancro gastrico e può servire come marker per la conversione dei tessuti a un fenotipo maligno.
In studi precedenti che esaminano la relazione tra Ron espressione e tassi di sopravvivenza, Lee et al [11] ha rilevato che il TEM e Ron erano fattori prognostici indipendenti di recidive a lungo termine di cancro al seno, e che i campioni positivi per il TEM e di espressione RON avuto un tasso di sopravvivenza libera da malattia a 10 anni significativamente più basso. Allo stesso modo, Cheng et al [6] ha riportato un tasso di sopravvivenza inferiore per tumori della vescica positivi sia per il MET e RON. Al contrario, abbiamo scoperto che il tasso di sopravvivenza dei pazienti positivi per l'espressione RON non era inferiore al tasso di sopravvivenza per il gruppo di pazienti RON-negativi. E 'possibile che il tasso di sopravvivenza dei pazienti con cancro gastrico può essere influenzata da molti fattori, e i nostri dati di follow-up non è stato sufficiente a fornire un'ulteriore visione delle quali fattori potrebbero essere importanti.
Conclusione
I risultati di questa studio mostrano che RON è espresso nel cancro gastrico, ma non nella mucosa gastrica. Inoltre, il tasso di espressione di RON a cancro gastrico è correlato positivamente con la profondità invasiva, lo stadio patologico clinica, e l'estensione delle metastasi linfonodali. Ipotizziamo che RON svolge un ruolo importante nella comparsa, progressione, invasione e metastasi del cancro gastrico, e quindi potrebbe essere un indicatore importante per valutare il comportamento biologico del cancro gastrico. I risultati dei nostri studi forniscono una base da cui partire per identificare ulteriormente i dettagli meccanicistici del ruolo di RON nel carcinoma gastrico al fine di individuare RON come un obiettivo terapeutico nel cancro gastrico.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla ricerca scientifica Concessione della Health Bureau della provincia di Zhejiang (n ° 491.010-W10380) (n 2006B039) e Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang, Cina (n Y2080168).
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Gli autori dichiarano di avere interessi in gioco.

• Laparoscopica regolabile fasciato Roux-en-Y bypass gastrico come procedura primaria per il super-super-obesi (indice di massa corporea > 60 kg /m2)
• Aumento del rischio di adenocarcinoma gastrico dopo il trattamento di gastrica primaria diffuso a grandi cellule B lymphoma