Expressie van de RON receptor tyrosine kinase en de associatie met maagcarcinoom versus normale maag tissues

expressie van de RON receptor tyrosine kinase en de associatie met maagcarcinoom versus normale maag weefsels
Abstracte achtergrond
Récepteur d'origine Nantais (RON) is een receptor tyrosine kinase dat wordt geactiveerd door serum-afgeleide, macrofaag stimulerend eiwit (MSP) groeifactor en wordt uitgedrukt in vele kwaadaardige tumoren. Het doel van deze studie was om de eiwitexpressie profiel van RON en de relatie met klinisch-pathologische kenmerken van maagcarcinoom en prognose onthullen.
Methods
Maagcarcinoom weefsel van 98 patiënten, samen met 29 monsters van weefsel en paraneoplastische 10 specimens van normaal maagslijmvlies werden onderzocht door immunohistochemie (IHC). Western blot analyse van 19 monsters van maagcarcinoom weefsel en overeenkomstige paraneoplastische weefsel, 8 monsters van normale maagslijmvlies en 2 monsters van normale lymfeknoop monsters ook ontdekt expressie van een splice variant van RON, RONΔ165. Alle verkregen monsters werden vergezeld door de patiënt follow-up gegevens die varieerden 3-89 maanden (mediaan: 22 maanden).
Resultaten
Het percentage positieve RON meningsuiting verschilde aanzienlijk tussen maagcarcinoom weefsels [56,1%, ( 55/98)] en paraneoplastische weefsels [25,6% (8/29)] (p = 0,007). Daarentegen RON expressie afwezig is in normale maagslijmvlies monsters. RON expressie positief gecorreleerd met de invasieve diepte van de tumor (p = 0,019), perigastric lymfeklieren metastase (p = 0,019), en TNM (p = 0,001). Echter, RON expressie was onafhankelijk van tumorgroei patroon volgens Bormann criteria (p = 0,209), histopathologische waardering (p = 0,196), en de incidentie van metastasen op afstand (p = 0,400). RON expressie was niet gerelateerd aan overlevingskans van de patiënt (p = 0,195). RONΔ165 was sterk uitgedrukt in verse maagcarcinoom weefsel, wat overeenkomt paraneoplastische weefsel en perigastric lymfeklieren met gemetastaseerd. Daarentegen werd de expressie van RONΔ165 niet waargenomen in normale maagslijmvlies en normale monsters lymfeknoop weefsel.
Conclusie
RON expressie significant in maagcarcinoom weefsel en overeenkomstige paraneoplastische weefsel, maar niet tot expressie in normale maagslijmvlies. Expressie van RONΔ165 lagen ook maagcarcinoom weefsel en in metastasen aanwezig in lymfeklier weefsels. Onze hypothese is dat RON en zijn splice-variant spelen een belangrijke rol bij het ontstaan, progressie en metastase van maagcarcinoom, en daarom kan een nuttige merker vormen voor de biologische activiteit van maagcarcinoom evalueren. Achtergrond
Morbiditeit aan maag- carcinoom stijgt elk jaar, terwijl de leeftijd waarop afneemt. In China, maagcarcinoom is boven kwaadaardige tumor in beide categorieën van morbiditeit en mortaliteit [1]. Récepteur d'origine nantais (RON) is een receptor tyrosine kinase (RTK), die behoort tot de BMO-proto-oncogen familie. Recente studies van RON knockout muismodel blijkt dat volledige verstoring van het RON-gen embryonaal lethaal [2], waaruit blijkt dat RON essentieel embryonale ontwikkeling. RON wordt geactiveerd door serum-afgeleide, macrofaag stimulerend eiwit (MSP) groeifactor, en studies hebben aangetoond dat RON wordt uitgedrukt in vele kwaadaardige tumoren en speelt een rol bij het ontstaan ​​en de progressie.
Zhou et al. [3] bleek dat RON sterk uitgedrukt in colorectale carcinomen, en ze geïdentificeerd drie splicing varianten van RON (RONΔ160, RONΔ165 en RONΔ155). De expressie van RON en de varianten werd geassocieerd met de progressie van colorectale carcinoom. Andere studies hebben aangetoond dat de expressie van RON en splice varianten darm epitheelcel kolonievorming kunnen neerslaan en hun levensvatbaarheid te verhogen. Als uitdrukking van RON en zijn splice varianten van de rectale tumorcel stammen werden het doelwit van siRNA, werden proliferatie en metatasis aanzienlijk geremd, gelijktijdig met een verhoogde apoptose. Op basis van deze gegevens, RON en splice varianten verondersteld een belangrijke rol bij het ontstaan, progressie en metastase van rectumkanker [4] hebben. Evenzo heeft studies van RON expressie in zowel borst- en blaaskanker weefsels shown verhoogde expressie RON en een correlatie met histologische graad [5, 6].
Zover wij weten, is de rol van RON bij maagkanker alleen onderzocht door Collesi et al [7]. In deze studie wordt de splice variant van RON, RONΔ165, gedetecteerd in de gastrische carcinoma cellijn, KATO III. RONΔ165 bleek de invasie van maagkanker cellen verbeteren, hetgeen een rol voor de splice variant van RON in de maligne transformatie van maag cellen aan een carcinoom. In deze studie onderzoeken we de uitdrukking van RON in het maagcarcinoom weefsel van 98 patiënten met behulp van de methode Envision immunohistochemie (IHC). Om expressie van RONΔ165 onderzoeken Western blotting verse maagcarcinoom weefsel werd uitgevoerd. De patiënten die deelnamen aan onze studie werden gevolgd tussen de 3 en 89 maanden na de operatie om de associatie van RON meningsuiting, met inbegrip van de splice-variant, de klinisch-pathologische kenmerken van maagcarcinoom en de prognose te onderzoeken. Vanwege de complexe pathogenese van maagkanker is therapeutische doeltreffendheid niet bewezen erg effectief te zijn. Derhalve is het belangrijk om de pathogenese van maagcarcinoom nieuwe therapeutische doelstellingen onderzoeken.
Methods
Patiëntenmonsters
paraffine ingebedde weefselmonsters van 98 patiënten die een operatie ondergaan voor pathologisch bevestigde maagcarcinoom in de Eerste Affiliated Hospital van het College of Medicine van Zhejiang University tussen 1998 en 2003 werden verkregen. Gastric monsters werden gebruikt met toestemming van de patiënten en de toestemming van de ethische commissies van de ziekenhuizen. Zeventig mannen en 28 vrouwen, variërend in leeftijd van 21-76 jaar (gemiddelde leeftijd 58 jaar), werden in deze studie. Patiënt diagnose opgenomen 78 gevallen van sinus ventriculi carcinoom, 16 gevallen van maag cardia carcinoom en 4 gevallen van de totale maagcarcinoom. Post-operatie pathologische rapporten gediagnosticeerd 2 goed gedifferentieerd adenocarcinoom 21 matig gedifferentieerd adenocarcinoom, 69 slecht gedifferentieerde adenocarcinomen, 1 zegelring cell carcinoma, 2 mucinous adenocarcinomen, en 3 ernstige dysplasie met cancerization. Volgens UICCTNM (1998), werd de histologische graad van de monsters bepaald 26 van fase I, 14 stadium II gevallen 30 gevallen stadium III en 28 stadium IV gevallen ook. De follow-up rate voor onze patiënten was 92%, met 8 patiënten die niet beschikbaar zijn voor de follow-up te voltooien. De follow-up periode was tussen de 3 en 89 maanden (mediane tijd van 22 maanden) na de operatie. Tien monsters van normale maagslijmvlies onderzocht als controles. Negentien monsters verse maagcarcinoom weefsel, paraneoplastische weefsel en positieve perigastric lymfeknoop weefsel werden verzameld voor Western blot analyse. Tien monsters van normale maagslijmvlies werden ook opgenomen als controles.
Immunohistochemie
paraffine monsters werden verdeeld in 4 micrometer dikke plakken die werden gedeparaffiniseerd, gehydrateerd en gedurende 20 min in 0,3% H 2O 2 endogene peroxidase-activiteit te remmen. Voor antigen retrieval, monsters werden geïncubeerd met 0,1 M citraatbuffer (pH 6,0) en verwarmd in een snelkookpan gedurende 8 min. Na spoelen in TBS werden de objectglaasjes geïncubeerd met 3% normaal serum ezel (NDS) in TBS gedurende 20 min niet-specifieke binding van het eerste antilichaam te voorkomen. Anti-konijn RON monoklonaal antilichaam Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologie, USA) werd gebruikt bij 1: 400. Envision kit (DAKO) werd gebruikt volgens de aanwijzingen van de fabrikant, en gebonden antilichaam werd gedetecteerd met DAB. Monsters werden ook co-gekleurd met hematoxyline. Monsters werden bekeken onder een lichtmicroscoop en een PBS-monster alleen kleuring werd gebruikt als een achtergrondcontrole.
Evaluatiecriteria voor RON detectie door immunohistochemie
De beoordeling van de graad van kleuring werd bepaald met een geblindeerde evaluatieprocedure door ervaren pathologen. Hoge krachtvelden (400 X) met behulp van standaard lichtmicroscopie werden verdeeld in tien delen die willekeurig werden gescoord. Tumorcellen met buffy deeltjes in de intracytoplasm werden als positief geteld en het percentage positieve tumorcellen en kleuring intensiteit voor elk monster werd geregistreerd. Tumorcellen die niet vlekken voor RON expressie werden gescoord als negatief, cellen die zwak gekleurd werden gescoord als 1, matige kleuring werd gescoord met een 2, en sterk kleuring monsters werden gescoord als 3. Van de positieve tumorcellen gedetecteerd, < 5% negatief, tussen de 5 en 24% werden gescoord als 1, 25-49% werden gescoord met een 2, en > 50% werden gescoord met een 3. De cumulatieve score van de tumorcellen die in een monster bepaald eindscore van een monster. Op basis van de uiteindelijke score, werd het tumorweefsel bepaald negatief (score van 0-2), of positief (score van 3-6) voor RON expressie.
Protein immunoblotting
Vijftig microgram totaal eiwit voor elk monster werd gescheiden door elektroforese op een 10% polyacrylamidegel en overgebracht op PVDF-membraan (Millipore). Detectie van RON eiwit werd uitgevoerd met een anti-konijn RON monoklonaal antilichaam Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologie, USA) (1: 400). Antilichaambinding werd zichtbaar gemaakt met behulp van een anti-konijn antilichaam, geconjugeerd met mierikswortelperoxidase en een verbeterde chemiluminescentie kit (ECL) (Biological Industries, Inc. Israël). β-actine werd gebruikt als beladingscontrole.
Statistische analyse
SPSS 13.0 statistische software werd gebruikt om de statistische significantie van onze gegevens met viervoudige tabellen of R x C tabel χ 2 proef identificeren. Survival curves werden geëvalueerd met behulp van de Kaplan-Meier-methode en vergelijkingen van de overlevingskansen werden getest met behulp van een Log-rank test.
Resultaten
RON expressie in de maag weefsel en paraneoplastische weefsel
RON eiwit werd waargenomen in de cytolymph, maar niet in de nucleolus van gastrische carcinoomcellen en typisch verscheen als een buffy granulo-kleuring (Fig. 1). Het percentage positieve tumorcellen en de kleuring intensiteit voor elk monster werd geregistreerd. Voor de 98 patiënten monsters geëvalueerd werd RON expressie waargenomen in 56,1% van de maagcarcinoom weefsels (55/98), maar niet in monsters van normale maagslijmvlies. In maagcarcinoom paraneoplastische weefsel, dat werd verzameld uit de maag slijmlaag 0,5 cm van de gastrische carcinoom monsters werd RON eiwit waargenomen in 25,6% van de monsters (8/29). Deze gegevens vormen een belangrijke statistisch verschil in RON eiwitexpressie tussen maagcarcinoom weefsel en de bijbehorende paraneoplastische weefsel (χ 2 = 7,290, p = 0,007). Figuur 1 Detectie van RON expressie door immunhistochemistry. A, H) Detectie van RON in een slecht gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag monster. 200 × 400 × vergroting. B, E) vergroot beeld van RON detectie in een monster van slecht gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag. 400 × en 200 × vergroting. C) Detectie van RON in een monster van zegelring cell carcinoma. 400 × vergroting. D) Detectie van RON in een monster van matig gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag. 400 × vergroting. F) Detectie van RON in een monster van matig gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag. 200 x vergroting. G) Detectie van RON in een monster van zegelring cell carcinoma. . 400 × vergroting
RON eiwit expressie in relatie tot de pathologie van maagcarcinoom
RON eiwit expressie werd niet gevonden te worden geassocieerd met geslacht, leeftijd, of zieke regio (p Restaurant > 0,05). In maagcarcinoom weefsels, hoe dieper een carcinoom cellen geïnfiltreerd, werd het sterker RON eiwitten tot expressie (p = 0,019
). RON eiwitexpressie bleek eveneens positief gecorreleerd met perigastric lymfeklier en klinische pathologie podium met statistische significantie (p
= 0,019, p = 0,001
) (Tabel 1). In tegenstelling, waren er geen statistisch significante verschillen in RON expressie met de pathologie sorteren, Borrmann soort, of de aanwezigheid van metastase. Er werd echter vastgesteld dat RON expressie was sterker in de Borrmann III /IV-groep (63,6%) dan in de Borrmann I /II groep (53,8%), sterker in de metastasen groep (68,2%) dan bij de niet-verre metastase groep (52,6%), en sterker in de onderste histologisch gedifferentieerde groep (52,4%) dan in de matig en gedifferentieerde histologie groep (39,1%). Er waren geen statistisch significante verschillen voor deze vergelijkingen (p = 0,209; p = 0,400; p = 0,196), respectievelijk (Tabel 1) .table 1 relatie tussen RON expressie pathologie parameters

RON
RON
Χ2
p
(+) (%)
( -)
Invasieve Diepte
Vroege maagkanker
5 (29,4)
12
geïnfiltreerd spierlaag
15 (51,7)
14
7,795
p = 0,019
geïnfiltreerd sereus membraan
35 (67,3)
17
TNM Stage
Stage
14 (35,0)
26
12,245
p = 0,001
Stage
41 (70,7)
17
uitzaaiingen naar de lymfeklieren
N0
11 (37,9)
18
N1-3
44 (63,8)
25 | 5,535
p = 0.019
Borrmann Grade
I /II groep Victoire 14 (53,8)
12
III /IV groep Victoire 35 (63.6 )
20
0,708
p = 0.400 overige
6
11
histologie Grade
Matig & zeer gedifferentieerde
9 (39,1)
14
1.577
p = 0,209
minder gedifferentieerd *
39 (54,2)
33
Anderen **
0
3
Distant metastase
M0
40 (52,6)
36
1.675
p = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Inclusief slecht gedifferentieerd adenocarcinoom, zegelring cell carcinoma, mucinous adenocarcinoom; ** Ernstige dysplasie met cancerization.
RON expressie en overleving
voor de 90 patiënten die deelnamen aan deze studie dat post-operationeel werden gevolgd, geen statistisch significant verschil in overleving tarieven werd gevonden tussen patiënten met RON-positieve maagkanker monsters versus RON-negatieve maagcarcinoom monsters (fig. 2). Figuur 2 Survival curve voor RON + versus RON-patiënten.
Detectie van de RONΔ165 splice variant
In de 19 monsters van verse maagcarcinoom weefsels verzameld, samen met de bijbehorende paraneoplastische weefsels, en pathologisch bevestigde perigastric lymfeklieren met gemetastaseerd carcinoom, de splice variant van RON, RONΔ165, werd uitgedrukt. In tegenstelling, geen expressie van RON eiwit werd waargenomen in normale maagslijmvlies of normale lymfeknoop weefsel (fig. 3, 4). Figuur 3 Western blot analyse van expressie in RON maagcarcinoom weefsel, paraneoplastische weefsel en perigastric lymfeklieren. Duplicaatmonsters van maagcarcinoom tissue (T), paraneoplastische weefsel (P) en metastatische lymfeknoop (L) weefsels werden geanalyseerd op expressie van RONΔ 165 (165 kDa). Normaal maagslijmvlies (N) en normale lymfeknoop (NL) weefselmonsters werden vergeleken. β-actine (44 kDa) werd gebruikt als beladingscontrole.
Figuur 4 Western blotanalyse van expressie in RON maagcarcinoom weefsel, paraneoplastische weefsel en normale maagslijmvlies. Duplicaatmonsters van maagcarcinoom weefsel (T) en paraneoplastische weefsel (P) werden geanalyseerd op expressie van RONΔ165 (165 kDa) vergeleken met normale maagslijmvlies (N) weefselmonsters. Marker (M) en positieve controles (PC) (160 kDa) werden opgenomen.
Discussie
In de huidige studie, tonen we door zowel IHC en Western blot, die RON uitdrukking is niet detecteerbaar in normale maagslijmvlies. Deze waarnemingen zijn consistent met de resultaten van Okino et al [8]. Echter, kleuring van RON in carcinoomweefsel en overeenkomstige weefsels paraneoplastische IHC significante expressie van RON vergeleken met normaal maagslijmvlies monsters. Western blot analyse die meer specifieke informatie over RON expressie met detectie van RONΔ165 in maagcarcinoom weefsels, wat overeenkomt paraneoplastische weefsels, en de lymfeklieren met carcinoom uitzaaiingen. Deze gegevens geven aan dat expressie van volledige lengte RON, alsmede een variant van RON worden die tijdens het proces van kwaadaardige transformatie van maagepitheelcellen. Op basis van deze gegevens en werken in andere studies over de rol van RON in tumorigene fenotype, veronderstellen we dat RON kan werken als een oncogen het optreden, progressie, invasie en metastase van maagkanker promoten.
Eerdere studies hebben aangetoond dat expressie van RON correleert met de invasie van tumorcellen. Maggiora c.s. [9] gemeld dat RON expressie werd gebracht in 55% van eierstokkanker weefsels. Bovendien, als een eierstokkanker cellijn die sterk tot expressie RON wordt geïnduceerd door MSP, tumorgroei en invasie is aanzienlijk verbeterd. Op basis van deze gegevens werd verondersteld dat RON speelt een rol in de progressie van eierstokkanker. Evenzo Chan et al [10] liet zien dat expressie van RON bevorderde de groei en maligne transformatie van de huid papillomen, en Cheng et al [6] is gebleken dat sterke expressie van RON in blaaskanker cellijnen correleerde met verhoogde proliferatie en apoptose remming. De laatste studie toonde ook aan dat de expressie van RON in maagcarcinoom positief gecorreleerd met de diepte van de invasieve maagkanker cel en lymfeklieren metastase, en het expressieniveau aanzienlijk toe bij hogere klinische pathologieën van maagkanker. Daarom kunnen sterke expressie van RON bij maagkanker weefsels dienen als een marker om een ​​omzetting van normale cellen naar een kwaadaardig fenotype dat geassocieerd met verhoogde tumorcel invasie en métastase aanduiden, worden geassocieerd met een slechte prognose voor de lange termijn overleving. De nabijheid van maagkanker weefsel om de epitheliale dysplasie van de maag resulteert in de gevoeligheid van de epitheliale dysplasie van de maag precancerous lesions. Door derhalve rapporteren de expressie van RON in paraneoplastische weefsel, dat werd verzameld ~ 0,5 cm van de gastrische carcinoom monsters, bieden we data onze hypothese dat RON speelt een belangrijke rol bij het bevorderen maagkanker ondersteunen en kan dienen als marker voor de omzetting van de weefsels naar een kwaadaardige fenotype.
In eerdere studies naar de relatie tussen RON expressie en overleving, Lee et al [11] vond dat een BMO en RON waren onafhankelijke prognostische factoren op de lange termijn herhaling van borstkanker, en dat specimens positief voor BMO en RON expressie hadden een significant lagere 10-jaars ziektevrije overleving. Op dezelfde manier, Cheng et al [6] rapporteerde een lagere overlevingskans voor blaaskanker positief voor zowel BMO en RON. In tegenstelling, vonden we dat de overlevingskans van de patiënten positief voor RON expressie was niet lager dan de overlevingskans voor de RON-negatieve groep patiënten. Het is mogelijk dat de overleving van patiënten met maagkanker kan worden beïnvloed door vele factoren, en onze follow-up gegevens waren niet voldoende om meer inzicht in welke factoren belangrijk kunnen zijn voorzien.

Conclusie De resultaten van deze onderzoek laten zien dat RON wordt uitgedrukt in maagkanker, maar niet in normale maagslijmvlies. Verder is de expressiesnelheid van RON bij maagkanker positief correleert met de invasieve diepte, klinisch pathologische stadium en omvang van lymfeklier. Onze hypothese is dat RON speelt een belangrijke rol bij het ontstaan, progressie, invasie en metastase van maagkanker en derhalve een belangrijke marker kunnen zijn bij de beoordeling van het biologische gedrag van maagkanker. De resultaten van onze studies bieden een basis van waaruit de mechanistische details van de rol van de RON bij maagkanker verder te identificeren om RON identificeren als een therapeutisch doel bij maagkanker.
Verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd gefinancierd door het Wetenschappelijk Onderzoek Subsidie ​​van de Health Bureau van de provincie Zhejiang (No. 491.010-W10380) (No. 2006B039) en Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang, China (No. Y2080168).
Authors 'originele bestanden ingediend voor images
Hieronder staan ​​de links naar originele ingediende dossiers van de auteurs voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12885_2008_1291_MOESM2_ESM.jpeg Authors' 12885_2008_1291_MOESM1_ESM.jpeg Auteurs originele bestand voor figuur 2 12885_2008_1291_MOESM3_ESM.jpeg Authors 'originele bestand voor figuur 3 12885_2008_1291_MOESM4_ESM.jpeg Authors' originele bestand voor figuur 4 Concurrerende belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat zij hebben geen concurrerende belangen.

• Laparoscopische verstelbare gestreepte Roux-en-Y gastric bypass als primaire procedure voor de super-super-obesitas (body mass index > 60 kg /m2)
• Verhoogd risico op maagdarmkanker na de behandeling van primaire maag diffuus grootcellig B-cellymfoom