Ekspression af RON receptortyrosinkinase og dens association med gastrisk karcinom versus normal gastrisk tissues

Angivelse af RON receptortyrosinkinase og dens association med gastrisk karcinom versus normale gastriske væv
Abstrakt
Baggrund
Recepteur d'origine Nantais (RON) er en receptortyrosinkinase, der aktiveres af en serum-afledt, makrofagstimulerende protein (MSP) vækstfaktor og udtrykkes i mange maligne tumorer. Formålet med denne undersøgelse var at afsløre protein udtryk profil RON og dets forhold til klinisk-patologiske karakteristika gastrisk karcinom og prognose.
Metoder
Gastrisk karcinom væv fra 98 patienter, sammen med 29 eksemplarer af paraneoplastisk væv og 10 eksemplarer af normal maveslimhinden, blev undersøgt ved immunhistokemi (IHC). Western blot analyse af 19 prøver af gastrisk karcinom væv og tilsvarende paraneoplastisk væv, 8 enheder af normal maveslimhinden, og 2 enheder af normale lymfeknudeceller prøver påvises også ekspression af et splejsningsvariant af RON, RONΔ165. Alle prøver opnåede blev ledsaget af patientens opfølgende data, der varierede fra 3 til 89 måneder (median tid: 22 måneder).
Resultater
Satsen for positive RON udtryk afveg betydeligt mellem gastrisk karcinom væv [56,1%, ( 55/98)] og paraneoplastiske væv [25,6%, (8/29)] (p = 0,007). I modsætning hertil RON ekspression var til stede i normale maveslimhinden prøver. RON ekspression positivt korreleret med invasiv dybde af tumoren (p = 0,019), perigastric lymfeknuder metastase (p = 0,019), og TNM fase (p = 0,001). Imidlertid RON ekspression var uafhængig af tumorvækst mønster ifølge Bormann kriterier (p = 0,209), histopatologisk bedømmelse (p = 0,196), og forekomsten af ​​fjernmetastaser (p = 0,400). RON ekspression blev ikke relateret til en patients overlevelse (p = 0,195). RONΔ165 var stærkt udtrykt i frisk gastrisk karcinom væv, svarende paraneoplastisk væv, og perigastric lymfeknuder med metastatisk karcinom. I modsætning hertil blev ekspression af RONΔ165 ikke observeret i normal gastrisk mucosa og normal lymfeknude vævsprøver.
Konklusion
RON ekspression er signifikant i gastrisk karcinom væv og tilsvarende paraneoplastisk væv, men som ikke udtrykkes i normal gastrisk mucosa. Ekspression af RONΔ165 blev ligeledes observeret i gastrisk carcinom væv og i metastaser til stede i lymfeknudevæv. Vi hypotesen, at RON og dets splejsningsvariant spiller en vigtig rolle i forekomsten, progression, og metastase af gastrisk karcinom, og derfor kan udgøre en nyttig markør til at vurdere den biologiske aktivitet af gastrisk karcinom.
Baggrund
Morbiditet fra gastrisk karcinom er stigende hvert år, mens alder debut er faldende. I Kina, gastrisk karcinom er toppen malign tumor i begge kategorier af sygelighed og dødelighed [1]. Recepteur d'origine Nantais (RON) er en receptor (RTK), der hører til MET proto-onkogen familie. Nylige undersøgelser af en RON knockout musemodel viser, at fuldstændig afbrydelse af RON-genet er embryonale letale [2], hvilket viser, at RON er afgørende i fosterudviklingen. RON aktiveres af en serum-afledt, makrofagstimulerende protein (MSP) vækstfaktor, og undersøgelser har vist, at RON udtrykkes i mange maligne tumorer og spiller en rolle i deres forekomst og progression.
Zhou et al. [3] fandt, at RON stærkt udtrykkes i kolorektale karcinomer, og de identificerede tre splejsning varianter af RON (RONΔ160, RONΔ165, og RONΔ155). Ekspressionen af ​​RON og dens varianter var forbundet med progression af colorektal carcinom. Andre undersøgelser har vist, at ekspressionen af ​​RON og dets splejsningsvarianter kan udfælde kolon epitelcelle kolonidannelse og øge deres levedygtighed. Når ekspressionen af ​​RON og dens splejsning varianter blev rettet af siRNA i rektal tumor cellestammer blev proliferation og metatasis betydeligt hæmmet, samtidig med øget apoptose. Baseret på disse data, er RON og dets splejsningsvarianter hypotese at have en vigtig rolle i forekomsten, progression, og metastase af rektal cancer [4]. Tilsvarende undersøgelser af RON udtryk i både bryst og blære kræft væv har vist forhøjede niveauer af RON udtryk og en korrelation med histologisk kvalitet [5, 6].
Så vidt vi ved, har rollen som RON i mavekræft kun blevet undersøgt ved Collesi et al [7]. I denne undersøgelse blev detekteret splejsningsvariant af RON, RONΔ165 i det gastriske carcinoma celle stamme, KATO-III. RONΔ165 blev vist at forøge invasionen af ​​gastriske cancerceller, hvilket indikerer en rolle for splejsningsvariant af RON i den maligne transformation af gastriske celler til et carcinom. I denne undersøgelse undersøger vi ekspressionen af ​​RON i det gastriske carcinoma væv af 98 patienter, som brugte Envision immunhistokemi (IHC) metode. For at undersøge ekspression af RONΔ165 blev Western blotting af frisk gastrisk karcinom væv udføres. De deltagende patienter i vores undersøgelse blev overvåget mellem 3 og 89 måneder efter operation for at undersøge sammenhængen af ​​RON-ekspression, herunder dens splejsningsvariant, at de klinisk-patologiske karakteristika gastrisk karcinom og prognose. På grund af den komplekse patogenesen af ​​gastrisk karcinom, har terapeutisk effektivitet ikke vist sig at være meget effektiv. Således er det vigtigt at undersøge patogenesen af ​​gastrisk karcinom at finde nye terapeutiske mål. Salg Metoder
patientprøver Salg paraffinindlejret vævsprøver fra 98 patienter, som gennemgik operation for patologisk bekræftet gastrisk karcinom i First Affiliated Hospital af College of Medicine i Zhejiang University mellem 1998 og 2003 blev opnået. Gastric prøver blev anvendt med samtykke fra patienterne og tilladelse fra etiske komitéer for hospitaler. Halvfjerds mænd og 28 kvinder, i alderen fra 21 til 76 år (median alder 58 år), blev inkluderet i denne undersøgelse. Patient diagnose inkluderet 78 tilfælde af sinus ventriculi karcinom, 16 tilfælde af gastrisk Cardia karcinom, og 4 tilfælde af total gastrisk karcinom. Post-kirurgi patologiske rapporter diagnosticeret 2 godt differentierede adenocarcinomer, 21 moderat differentierede adenocarcinomer, 69 dårligt differentierede adenocarcinomer, en signet-ring celle karcinom, 2 mucinøse adenocarcinomer, og tre svær dysplasi med cancerization. Ifølge UICCTNM (1998), blev den histologiske kvalitet af prøverne bestemmes til at omfatte 26 trin I tilfælde, 14 fase II-sager, 30 fase III sager, og 28 fase IV sager. Opfølgningen sats for vores patienter var 92%, med 8 patienter ikke tilgængelig for at fuldføre opfølgning. Opfølgningen periode var mellem 3 og 89 måneder (median tid på 22 måneder) efter operationen. Ti prøver af normal maveslimhinden blev undersøgt som kontroller. Nitten prøver af frisk gastrisk carcinoma væv, paraneoplastisk væv, og positiv perigastric lymfeknudevæv blev indsamlet til Western blot-analyse. Ti prøver af normal maveslimhinden blev også inkluderet som kontroller.
Immunhistokemi
Paraffin prøver blev opdelt i 4 um tykke skiver, som blev afparaffinerede, hydreret og inkuberet i 20 min i 0,3% H 2O 2 at inhibere endogen peroxidaseaktivitet. For antigen hentning blev prøver inkuberet med 0,1 M citratpuffer (pH 6,0) og opvarmes i en trykkoger i 8 min. Efter skylning i TBS blev objektglassene inkuberet med 3% normalt æsel serum (NDS) i TBS i 20 min for at forhindre ikke-specifik binding af det første antistof. Anti-RON kanin monoklonale antistof Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, USA) blev anvendt ved 1: 400. Envision kit (DAKO) blev anvendt ifølge producentens anvisninger, og bundet antistof blev påvist under anvendelse af DAB. Prøver blev også co-farvet med hematoxylin. Prøver blev observeret under et lysmikroskop og en PBS-only farvning prøve blev anvendt som en baggrund kontrol.
Evalueringskriterier for RON detektion ved immunhistokemi
vurdering af kvalitet af farvning blev bestemt ved anvendelse af en blindet evalueringsprocedure af erfarne patologer. High-power felter (400 ×) ved hjælp af standard lys mikroskopi blev inddelt i ti afsnit, der tilfældigt blev scoret. Tumorceller med buffy partikler i intracytoplasm blev scoret som positiv, og blev registreret procentdelen af ​​positive tumorceller og farvningsintensitet for hver prøve. Tumorceller, farvede ikke for RON ekspression blev bedømt som negative, celler, der svagt farvede blev bedømt som 1, moderat farvning blev scoret med en 2, og stærkt farvende prøver blev scoret som 3. Af de positive tumorceller detekteret, < 5% var negative, mellem 5 og 24% blev scoret som en, 25-49% blev scoret med en 2, og > 50% blev scoret med en 3. kumulative score af tumorcellerne identificeret i en prøve bestemmes en prøve endelige score. Baseret på den endelige score blev tumorvæv bestemt til at være negativ (score på 0-2), eller positive (score på 3-6) til RON udtryk.
Protein immunblotting
Halvtreds mikrogram total protein for hver prøve blev separeret ved elektroforese på en 10% polyacrylamidgel og overført til PVDF-membran (Millipore). Påvisning af RON-protein blev udført under anvendelse af et anti-RON kanin monoklonale antistof Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, USA) (1: 400). Antistofbinding blev visualiseret under anvendelse af et anti-kanin-antistof konjugeret til peberrodsperoxidase og et forøget kemiluminescens-kit (ECL) (Biological Industries, Inc. Israel). β-actin blev anvendt som en loading kontrol.
Statistisk analyse
SPSS 13.0 statistisk software blev anvendt til at identificere den statistiske signifikans af vore data ved hjælp firedobbelte tabeller eller R × C tabel χ 2 test. Overlevelse kurver blev evalueret ved brug af Kaplan-Meier-metoden og sammenligninger af overlevelsesrater blev testet ved hjælp af en log-rank test.
Resultater
RON udtryk i gastrisk væv og paraneoplastisk væv
RON protein blev observeret i cytolymph, men ikke i nucleolus, af gastriske carcinomceller og typisk fremstod som en buffy granulo-farvning (fig. 1). Procentdelen af ​​positive tumorceller og farvningen intensitet for hver prøve blev registreret. For de 98 patientprøver bedømmelsen blev RON ekspression observeret i 56,1% af de gastriske carcinoma væv (55/98), men ikke i prøver af normal gastrisk mucosa. I gastrisk karcinom paraneoplastisk væv, der blev indsamlet fra mavens slimlag 0,5 cm væk fra mavens carcinoma prøver blev RON protein observeret i 25,6% af prøverne (8/29). Disse data udgør en betydelig statistisk forskel i RON proteinekspression mellem gastrisk karcinom væv med tilhørende paraneoplastisk væv (χ 2 = 7,290, p = 0,007). Figur 1 Påvisning af RON ekspression ved immunhistochemistry. A, H) Påvisning af RON i et dårligt differentieret gastrisk adenocarcinom prøve. 200 × og 400 × forstørrelse. B, E) Forstørret visning af RON opdagelse i en prøve af dårligt differentieret gastrisk adenocarcinom. 400 × og 200 × forstørrelse. C) Påvisning af RON i en prøve af signet-ring celle karcinom. 400 ganges forstørrelse. D) Påvisning af RON i en prøve af moderat differentieret gastrisk adenocarcinom. 400 ganges forstørrelse. F) Påvisning af RON i en prøve af moderat differentieret gastrisk adenocarcinom. 200 × forstørrelse. G) Påvisning af RON i en prøve af signet-ring celle karcinom. . 400 × forstørrelse
RON proteinekspression i forhold til patologien af ​​gastrisk karcinom
RON-proteinekspression blev ikke fundet at være forbundet med køn, alder, eller sygt region (s Restaurant &0,05). Men i gastriske carcinoma væv, jo dybere et carcinom celle infiltreret blev stærkere RON protein udtrykt (p
= 0,019). RON-proteinekspression blev også fundet at positivt korrelere med perigastric lymfeknudemetastase og klinisk patologi scenen med statistisk signifikans (p
= 0,019, p
= 0,001) (tabel 1). I modsætning hertil var der ingen signifikante statistiske forskelle i RON udtryk med patologi sortering, BORRMANN type eller tilstedeværelsen af ​​metastaser. Det blev dog bemærket, at RON udtryk var stærkere i BORRMANN III /IV-gruppen (63,6%) end i BORRMANN I /II-gruppen (53,8%), stærkere i fjernmetastaser gruppen (68,2%) end i den ikke-fjern metastase gruppe (52,6%), og stærkere i histologisk lavere differentieret gruppe (52,4%) end i moderat og stærkt differentieret histologi gruppe (39,1%). Der var ingen signifikante statistiske forskelle for disse sammenligninger (p = 0,209; p = 0,400; p = 0,196) (tabel 1) .table 1 Forholdet af RON udtryk for patologi parametre

RON
RON
Χ2
p
(+) (%) Hotel ( -)
Invasiv Dybde
Tidlig mavekræft
5 (29,4)
12
Infiltreret til muskuløs lag
15 (51,7)
14
7,795
p = 0,019
Infiltreret til serøs membran
35 (67,3)
17
TNM Stage
Stage
14 (35,0)
26
12,245
p = 0,001
Stage
41 (70,7)
17
metastaser til lymfeknuder
n0
11 (37,9)
18
N1-3
44 (63,8)
25
5,535
p = 0,019
BORRMANN Grade
I /II-gruppen
14 (53,8)
12
III /IV gruppe
35 (63,6 )
20
0,708
p = 0,400
Andre
6
11
Histologi Grade
Moderat & stærkt differentieret
9 (39,1)
14
1,577
p = 0,209
Mindre differentieret *
39 (54,2)
33
Andre **
0
3
fjernmetastaser
M0
40 (52,6)
36
1,675
p = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Inkluderer dårligt differentieret adenocarcinom, signet-ring celle karcinom, mucinøs adenocarcinom; ** Svær dysplasi med cancerization.
RON udtryk og overlevelsesrater
For de 90 patienter, der deltog i denne undersøgelse, der blev fulgt post-operationelt, blev ingen signifikant statistisk forskel i overlevelse fundet mellem patienter med RON-positive gastrisk karcinom prøver versus RON-negative gastriske carcinoma prøver (fig. 2). Figur 2 Survival kurven for RON + versus RON-patienter.
Påvisning af RONΔ165 splejse variant
I de 19 prøver af friske gastrisk karcinom væv indsamlet, sammen med tilsvarende paraneoplastiske væv, og patologisk bekræftet perigastric lymfeknuder med metastatisk karcinom, splejse variant af RON, RONΔ165, blev udtrykt. I modsætning hertil blev der ingen ekspression af RON-protein observeret i normalt gastrisk mucosa eller normal lymfeknude væv (fig. 3, 4). Figur 3 Western blot-analyse af RON-ekspression i gastrisk karcinom væv, paraneoplastisk væv, og perigastric lymfeknuder. Dobbelte prøver af gastrisk karcinom væv (T), paraneoplastisk væv (P), og metastatisk lymfeknude (L) væv blev analyseret for ekspression af RONΔ 165 (165 kDa). Normal gastrisk mucosa (N) og normal lymfeknude (NL) vævsprøver blev sammenlignet. β-actin (44 kDa) blev anvendt som en loading kontrol.
Figur 4 Western blot analyse af RON-ekspression i gastrisk karcinom væv, paraneoplastisk væv, og normale maveslimhinden. Dobbelte prøver af gastrisk karcinom væv (T) og paraneoplastisk væv (P) blev analyseret for ekspression af RONΔ165 (165 kDa) og sammenlignet med normale gastrisk mucosa (N) vævsprøver. Markør (M) og positiv kontrol (PC) (160 kDa) blev medtaget.
Diskussion
I den aktuelle undersøgelse, viser vi både IHC og Western blot, at RON ekspression ikke påviselig i normalt gastrisk mucosa. Disse observationer er konsistente med resultaterne fra Okino et al [8]. Imidlertid farvning af RON i carcinom væv og tilsvarende paraneoplastiske væv ved IHC viste signifikant ekspression af RON forhold til normale maveslimhinden prøver. Western blot analyse forudsat mere specifikke oplysninger om RON udtryk med påvisning af RONΔ165 i gastrisk karcinom væv, svarende paraneoplastiske væv, og lymfeknuder med carcinom metastaser. Disse data indikerer, at ekspression af fuldlængde RON, samt en variant af RON, udtrykkes under processen med malign transformation af gastriske epitelceller. Baseret på disse data og arbejde i andre undersøgelser rolle RON i tumorgene fænotyper, vi hypotesen, at RON kan virke som et onkogen at fremme forekomst, progression, invasion og metastase af mavekræft.
Tidligere undersøgelser har vist, at ekspression af RON korrelerer med invasionen af ​​tumorceller. Maggiora et al [9], at RON blev udtrykt i 55% af kræft i æggestokkene væv. Desuden, hvis en ovariecancer cellelinie, som stærkt udtrykker RON induceres af MSP, tumorvækst og invasion er væsentligt forbedret. Baseret på disse data blev det antaget, at RON spiller en rolle i progressionen af ​​ovariecancer. Tilsvarende Chan et al [10] viste, at ekspressionen af ​​RON fremmet vækst og malign transformation af huden papillomer, og Cheng et al [6] viste, at stærke udtryk af RON i blærekræft cellelinjer korreleret med øget proliferation og apoptose hæmning. Sidstnævnte undersøgelse viste også, at ekspressionen af ​​RON i gastrisk karcinom positivt korreleret med invasiv dybde af gastrisk cancer celle og lymfeknuder metastase, og ekspressionsniveauet steg betydeligt med højere kliniske patologier af mavekræft. Derfor kan stærk ekspression af RON i gastrisk cancer væv tjene som en markør til at angive en omdannelse af normale celler til en malign fænotype, som er forbundet med øget tumorcelleinvasion og metastase, vil være forbundet med en dårlig prognose for langtidsoverlevelse. Nærheden af ​​gastrisk cancer væv til epitel dysplasi af maven resulterer i modtagelighed epitel dysplasi i maven til præcancerøse læsioner. Derfor ved at rapportere ekspression af RON i paraneoplastisk væv, som blev indsamlet ~ 0,5 cm væk fra mavens carcinoma prøver, vi leverer data til at støtte vores hypotese, at RON spiller en vigtig rolle i at fremme gastrisk kræft og kan tjene som en markør for omdannelse af væv til en ondartet fænotype.
i tidligere undersøgelser, der ser på forholdet mellem RON udtryk og overlevelsesrater, Lee et al [11] fandt, at MET og RON var uafhængige prognostiske faktorer for langsigtet tilbagefald af brystkræft, og det prøver positive for markedsøkonomisk behandling og RON udtryk havde en signifikant lavere 10-års sygdomsfri overlevelse sats. Tilsvarende Cheng et al [6] rapporterede en lavere overlevelsesrate for blære kræftformer er positive for både markedsøkonomisk behandling og RON. I modsætning hertil fandt vi, at overlevelsesraten for patienter positive for RON ekspression ikke var mindre end overlevelsesraten for RON-negative patientgruppe. Det er muligt, at overlevelsesraten for patienter med gastrisk cancer kan påvirkes af mange faktorer, og vores opfølgningsdata ikke var tilstrækkelig til at tilvejebringe yderligere indsigt i hvilke faktorer kan være vigtigt.
Konklusion
Resultaterne af denne undersøgelse viser, at RON udtrykkes i gastrisk cancer, men ikke i normal gastrisk mucosa. Endvidere ekspressionen på RON i gastrisk cancer positivt korrelerer med invasiv dybde, den kliniske patologiske stadium, og omfanget af lymfeknudemetastase. Vi hypotesen, at RON spiller en vigtig rolle i forekomsten, progression, invasion, og metastase af mavekræft, og derfor kunne være et vigtigt markør i vurderingen af ​​biologiske adfærd mavekræft. Resultaterne af vores undersøgelser giver et fundament, hvorfra man desuden fastlægge mekanistiske detaljer rolle RON i gastrisk kræft for at identificere RON som terapeutisk target i mavekræft.
Erklæringer
Tak
Dette arbejde blev finansieret af videnskabelig forskning Grant af Health Bureau of Zhejiang-provinsen (nr 491.010-W10380) (nr 2006B039) og Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (nr Y2080168).
Forfattere 'oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2008_1291_MOESM1_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2008_1291_MOESM2_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12885_2008_1291_MOESM3_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12885_2008_1291_MOESM4_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 4 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.

• Laparoskopisk justerbar banded roux-en-y gastrisk bypass som en primær procedure for super-super-overvægtige (BMI > 60 kg /m2)
• Øget risiko for gastrisk adenocarcinom efter behandling af primær gastrisk diffust storcellet B-celle lymfom