Экспрессия RON тирозинкиназы рецептора и его связь с желудочной карциномы по сравнению с нормальными тканями желудка

Экспрессия рецептора тирозин-киназы RON и его ассоциации с желудочным раком желудка по сравнению с нормальными тканями
Аннотация
Справочная информация
Recepteur d'Origine Nantais (RON) представляет собой рецептор тирозин-киназы, который активируется сыворотка происхождения, макрофагальный стимулирующий белок (ПНС) фактор роста и выражается во многих злокачественных опухолей. Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы выявить профиль экспрессии белка Роном и его взаимосвязи с клинико-патологическими характеристиками карциномы желудка и прогноза.
Методы
ткани карциномы желудка из 98 пациентов, наряду с 29 образцами паранеопластического ткани и 10 образцы нормальной слизистой оболочки желудка, исследовали с помощью иммуногистохимии (IHC). Вестерн-блот-анализ 19 образцов желудочной ткани карциномы и соответствующей паранеопластического ткани, 8 образцов нормальной слизистой оболочки желудка, а также 2-х образцов нормальных образцов лимфатических узлов также обнаружено экспрессию сплайс варианта RON, RONΔ165. Все образцы, полученные сопровождались пациента последующих данных, которые варьировались от 3 до 89 месяцев (среднее время: 22 месяцев).
Результаты
Скорость положительного выражения RON значимо различались желудочных тканей карциномы [56,1%, ( 55/98)] и паранеопластическим ткани [25,6% (8/29)] (р = 0,007). В противоположность этому, экспрессия РОН отсутствовал в нормальных образцов желудочного слизистую оболочку. Выражение РОН положительно коррелирует с инвазивной глубины опухоли (р = 0,019), окружающий пищеварительный тракт лимфатических узлов метастаз (р = 0,019), и TNM стадия (p = 0,001). Однако экспрессия RON не зависит от модели роста опухоли в соответствии с критериями Борман (р = 0,209), гистологической степени (р = 0,196), а также частоты отдаленных метастазов (р = 0,400). Выражение RON не было связано с выживаемости пациента (р = 0,195). RONΔ165 была сильно выражена в свежей ткани карциномы желудка, соответствующие паранеопластический ткани и лимфатические узлы окружающий пищеварительный тракт с метастатическим раком. В противоположность этому, экспрессия RONΔ165 не наблюдалось в нормальном слизистой оболочки желудка и нормальных образцах ткани лимфатического узла.
Заключение
выражение RON имеет важное значение в желудочном ткани карциномы и соответствующие паранеопластический ткани, но не экспрессируется в нормальной слизистой оболочке желудка. Выражение RONΔ165 аналогичным образом наблюдали в желудочном карцинома ткани и метастазов, присутствующих в лимфатических узлах тканей. Мы предполагаем, что РОН и его сращивания вариант играют важную роль в возникновении, прогрессии и метастазирования рака желудка, и, следовательно, может представлять собой полезный маркер для оценки биологической активности рака желудка.
Справочная
из желудка ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ рак растет с каждым годом, в то время как возраст начала уменьшается. В Китае, рак желудка является верхней злокачественной опухоли в обеих категориях заболеваемости и смертности [1]. Recepteur d'Origine Nantais (РОН) представляет собой рецептор тирозинкиназы (РТК), который принадлежит к MET протоонкогена семьи. Недавние исследования модели нокаута мыши RON показывает, что полное разрушение гена RON является эмбриональный летальный [2], демонстрируя, что RON имеет важное значение в эмбриональном развитии. РОН активируется, макрофагальный стимулирующий белок (МПВ) фактора роста в сыворотке, полученных, и исследования показали, что РОН выражается во многих злокачественных опухолей и играет определенную роль в их возникновении и развитии.
Zhou и др. [3] установлено, что RON сильно выражен в колоректальных карцином, и они определили три варианта сплайсинга Роном (RONΔ160, RONΔ165 и RONΔ155). Выражение RON и его вариантов был связан с прогрессированием колоректального рака. Другие исследования показали, что экспрессия RON и его вариантов сплайсинга может ускорить образование клеток колонии толстой кишки эпителия и повысить их жизнеспособность. Когда выражение RON и его вариантов сплайсинга были мишенью миРНК в штаммах ректальных опухолевых клеток, пролиферацию и metatasis были существенно тормозится, одновременно с увеличением апоптоза. На основании этих данных, RON и его варианты сплайсинга предположили играют важную роль в возникновении, прогрессии и метастазирования рака прямой кишки [4]. Точно так же исследования экспрессии RON в обеих молочных желез и мочевого пузыря раковых тканей показал повышенные уровни экспрессии RON и корреляция с гистологической класса [5, 6].
Насколько нам известно, только изучена роль RON при раке желудка по Collesi и др [7]. В этом исследовании сращивание вариант RON, RONΔ165, был обнаружен в желудочном штамм клеток карциномы, Kato-III. RONΔ165 было показано, усиливает инвазию клеток рака желудка, что указывает на роль для сращивания варианта RON в опухолевой трансформации клеток желудка к карциноме. В данном исследовании мы рассмотрим выражение RON в желудочном карцинома ткани 98 пациентов с использованием метода Envision иммуногистохимии (IHC). Для изучения экспрессии RONΔ165, проводили Вестерн-блоттинга свежей ткани рака желудка. контролировали пациентов, включенных в наше исследование от 3 до 89 месяцев после операции, чтобы исследовать ассоциацию экспрессии RON, в том числе его сращивания вариант, к клинико-патологическими характеристиками карциномы желудка и прогноза. В связи со сложным патогенезом рака желудка, терапевтическая эффективность не оказалась весьма эффективной. Таким образом, важно исследовать патогенез карциномы желудка, чтобы найти новые терапевтические мишени.
Методы
Образцы пациентов
парафином образцы ткани от 98 пациентов, перенесших операцию по поводу патологически подтвердил рак желудка в первой больнице Дочернее колледжа медицины университета Zhejiang в период между 1998 и 2003 годах были получены. Желудочный образцы были использованы с согласия пациентов и разрешения комитетов по этике больниц. Семьдесят мужчин и 28 женщин, в возрасте от 21 до 76 лет (средний возраст 58 лет), были включены в данное исследование. Диагноз пациентов включала 78 случаев синусового желудочек карциномы, 16 случаев карциномы кардиального отдела желудка, а также 4 случая общего рака желудка. Послеоперационный патологические отчеты диагностирована 2 хорошо дифференцированной аденокарциномы, 21 умеренно дифференцированной аденокарциномы, 69 слабо дифференцированной аденокарциномы, 1 перстень-кольцо-клеточная карцинома, 2 муцинозные аденокарциномы и 3 тяжелой дисплазии с cancerization. Согласно UICCTNM (1998), гистологическая оценка образцов определяли включать 26 этап I больных 14 этап случаи II, III этап 30 случаев и 28 этап IV случаев. Последующая ставка для наших пациентов составила 92%, при этом у 8 пациентов не доступны для завершения последующей деятельности. Период наблюдения составил от 3 до 89 месяцев (среднее время 22 месяцев) после операции. Десять образцов нормальной слизистой оболочки желудка были исследованы в качестве контрольной группы. Девятнадцать образцы свежей ткани карциномы желудка, паранеопластического ткани и положительной ткани лимфатических узлов окружающий пищеварительный тракт были собраны для Вестерн-блот-анализа. Десять образцов нормальной слизистой оболочки желудка также были включены в качестве контрольных.
Immunohistochemistry
парафиновые образцы разрезали на 4 мкм ломтики толщиной, которые были депарафинировали, увлажненной и инкубировали в течение 20 мин в 0,3% H <югу> 2О <суб> 2 ингибировать эндогенную активность пероксидазы. Для извлечения антигенов, образцы инкубировали с 0,1 М цитратном буфере (рН 6,0) и нагревали в скороварке в течение 8 мин. После промывки в TBS, предметные стекла инкубировали с 3% нормальной сыворотки осла (NDS) в TBS в течение 20 мин, чтобы предотвратить неспецифическое связывание первого антитела. Анти-РОН кролика моноклональное антитело Рон β (С-20) (Santa Cruz БИОТЕХНОЛОГИИ, США) использовали в соотношении 1: 400. Envision комплект (DAKO) использовали в соответствии с инструкциями изготовителя, и связанное антитело детектировали с использованием DAB. Образцы были также совместно окрашивали гематоксилином. Образцы наблюдали под световым микроскопом и PBS-только окрашивания образец использовали в качестве фонового контроля.
Критерии оценки для обнаружения RON с помощью иммуногистохимии
оценке степени окрашивания определяли с использованием ослепил процедуры оценки опытными патологи. Поля высокой мощности (400 ×) с использованием стандартных световой микроскопии были разделены на десять секций, которые были случайным образом забитых. Опухолевые клетки с частицами лейкоцитарных в intracytoplasm оценивали как положительные, и процент положительных опухолевых клеток и интенсивность окрашивания для каждого образца регистрировали. Опухолевые клетки, которые не окрашивали для экспрессии RON оценивали как отрицательные, клетки, которые слабо запятнанные оценивали как 1, умеренное окрашивание оценивали с 2, и сильно окрашивающие образцы оценивали как 3. Из положительных опухолевых клеток, обнаруженных и ЛТ; 5% были отрицательными, от 5 до 24% оценивали как 1, 25-49% были забиты с 2, и > 50% были забиты с 3. Кумулятивная оценка опухолевых клеток, идентифицированных в образце определяется окончательный счет в образце. На основании окончательной оценки, опухолевая ткань была определена отрицательным (оценка 0-2), или положительный (оценка 3-6) для экспрессии RON.
Protein иммуноблоттинга
Пятьдесят микрограммов общего белка для каждого образец разделяли с помощью электрофореза на полиакриламидном геле в 10% и переносили на PVDF мембрану (Millipore). Обнаружение белка RON проводили с использованием анти-RON кролика моноклональное антитело Ron β (C-20) (Santa Cruz биотехнологии, США) (1: 400). Связывание антител визуализировали с использованием антитела против кроличьего, конъюгированного с пероксидазой хрена, и усовершенствованный набор хемилюминесценции (ECL) (Biological Industries, Inc. Израиль). β-актин был использован в качестве нагрузочного контроля.
Статистический анализ
SPSS 13,0 статистического программного обеспечения была использована для определения статистической значимости наших данных с использованием четвертого порядка таблицы или R × C таблице χ 2 теста. Кривые выживаемости оценивались по методу Каплана-Мейера и сравнения показателей выживаемости были протестированы с использованием теста Log ранга.

Результаты выражения RON в желудочной ткани и ткани паранеопластического
наблюдалась RON белка в cytolymph, но не в ядрышек, желудочных клеток карциномы и, как правило, появился как лейкоцитарной granulo окрашивания (рис. 1). Процент положительных опухолевых клеток и интенсивность окрашивания для каждого образца регистрировали. Для оценивали 98 образцов пациентов, экспрессия РОН наблюдалось в 56,1% желудочных тканей карциномы (55/98), но не в образцах нормальной слизистой оболочки желудка. При карциноме желудка паранеопластического ткани, которая была собрана из слизистой желудка слоя 0,5 см от желудочных образцов карциномы, РОН белка наблюдалось в 25,6% проб (8/29). Эти данные представляют собой значительную статистическую разницу в экспрессии белка RON между желудочной ткани карциномы и связанного с ним паранеопластического ткани (χ 2 = 7,290, р = 0,007). Рисунок 1 Обнаружение экспрессии RON по иммуногистохимии. A, H) Обнаружение RON в низкодифференцированная желудочной образце аденокарциномы. 200 × 400 и кратным увеличением. B, E) Увеличенный вид обнаружения RON в образце слабо дифференцированной аденокарциномы желудка. 400 × 200 и кратным увеличением. C) Обнаружение RON в образце карциномы перстень клеток. 400-кратным увеличением. D) Обнаружение RON в образце умеренно дифференцированной аденокарциномы желудка. 400-кратным увеличением. F) Обнаружение RON в образце умеренно дифференцированной аденокарциномы желудка. 200-кратным увеличением. G) Обнаружение RON в образце карциномы перстень клеток. . 400-кратным увеличением изображения экспрессии белка RON по отношению к патологии желудка карциномы
экспрессии белка RON не было установлено, что связано с полом, возрастом, или пораженной области (р
≫ 0,05). Тем не менее, в желудочных тканях карциномы, чем глубже проникали клеточный рак, была выражена сильнее белка RON (р = 0,019
). Экспрессия белка РОН было также обнаружено, что положительно коррелирует с окружающий пищеварительный тракт метастазировании в лимфатические узлы и клинической стадии патологии со статистической значимостью (р = 0,019
, р
= 0,001) (таблица 1). В отличие от этого, не было никаких существенных статистических различий в экспрессии RON с патологией Оценивание, типа Боррманна или наличие метастазов. Тем не менее, было отмечено, что выражение RON был сильнее в Боррманна III /IV группы (63,6%), чем в группе Бормана I /II (53,8%), сильнее в отдаленными метастазами группе (68,2%), чем в не отдаленном метастазирование группа (52,6%), и сильнее в гистологически ниже дифференцированной группы (52,4%), чем в умеренно и сильно дифференцированной гистологии группы (39,1%). Там не было никаких существенных статистических различий для этих сравнений (р = 0,209; р = 0,400; р = 0,196), соответственно (таблица 1) .table 1 Связь выражения RON патологии параметры
<й>
RON

RON

Χ2

р

(+) (%)
( -)
инвазивного глубина
Ранний рак желудка
5 (29,4)
12
инфильтрированного в мышечный слой
15 (51,7) 14

7,795
р = 0,019
инфильтрированного к серозной оболочки
35 (67,3)
17
TNM Stage
Этап
14 (35,0) 26

12,245
р = 0,001
Этап
41 (70,7) 17

метастазами в лимфоузлы

11 N0 (37,9)
18
N1-3
44 (63,8)
25
5,535
р = 0,019
Боррманна Grade
I /II группа
14 (53,8) 12

III /IV группа
35 (63,6 )
20
0,708
р = 0.400
Другие
6
11
гистологии Оценка
Умеренно &Amp; сильно дифференцирована
9 (39,1)
14
1,577
р = 0,209
менее дифференцированы *
39 (54,2) 33

Другие **
0 страница 3 отдаленными метастазами
M0
40 (52,6) 36

1.675
р = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Включает слабо дифференцированная аденокарцинома, карцинома перстень-кольцо клеток, коллоидный аденокарциномы; ** Тяжелая дисплазия с cancerization.
Экспрессии и выживаемости RON
Для 90 пациентов, включенных в это исследование, которые были последовавших после оперативно, никаких существенных статистических различий в показателях выживаемости не было найдено между пациентами с РОН-положительным раком желудка образцы в сравнении с октановым-отрицательных образцах карциномы желудка (рис. 2). Рисунок 2 Выживание кривая для RON + по сравнению с Ron-пациентов.
Обнаружение RONΔ165 сращивания вариант
В 19 образцах свежих тканей карциномы желудка собирают вместе с соответствующими паранеопластических ткани, и патологически подтвердили окружающий пищеварительный тракт лимфатических узлов с метастатическим раком, вариант сплайсинга RON, RONΔ165 было выражено. В отличие от этого, не наблюдалось экспрессии белка RON в нормальном слизистой оболочке желудка или нормальной ткани лимфатических узлов (рис. 3, 4). Рисунок 3 Вестерн-блот-анализ экспрессии RON в карциномы желудка ткани, паранеопластического ткани, и окружающий пищеварительный тракт лимфатических узлов. Были проанализированы Повторяющиеся образцы ткани карциномы желудка (Т), паранеопластического ткани (P), и метастатических лимфатических узлов (L) ткани для экспрессии RONΔ 165 (165 кДа). сравнивались нормальной слизистой оболочки желудка (N), и нормальный лимфатический узел (NL) образцов ткани. β-актин (44 кДа), использовали в качестве контроля нагрузки. Рисунок 4
Вестерн-блот-анализ экспрессии RON в карциномы желудка ткани, паранеопластического ткани и нормальной слизистой оболочки желудка. Были проанализированы Повторяющиеся образцы ткани карциномы желудка (Т) и паранеопластического ткани (P) для экспрессии RONΔ165 (165 кДа), и по сравнению с нормальной слизистой желудка (N) образцов ткани. Маркер (M) и положительного контроля (ПК) (160 кДа) были включены.
Обсуждение
В настоящем исследовании мы показываем обоими IHC и Вестерн-блоттинга, что экспрессия RON не обнаруживается в нормальной слизистой оболочке желудка. Эти наблюдения согласуются с результатами Okino и др [8]. Тем не менее, окрашивание RON в тканях карциномы и соответствующих паранеопластических тканей IHC показали значительное экспрессию RON по отношению к нормальным желудочным образцов слизистой оболочки. Вестерн-блот-анализ предоставил более конкретную информацию о выражении RON с обнаружением RONΔ165 в желудочных тканях карциномы, соответствующие паранеопластических ткани и лимфатических узлов с метастазами рака. Эти данные указывают на то, что экспрессия полноразмерного RON, а также вариант RON, выражены в процессе злокачественной трансформации эпителиальных клеток желудка. На основании этих данных и работы в других исследованиях, посвященных роли RON в онкогенных фенотипов, мы предполагаем, что РОН может действовать как онкоген, чтобы способствовать возникновению, прогрессию, инвазию и метастазирование рака желудка.
Предыдущие исследования показали, что экспрессия RON коррелирует с вторжением опухолевых клеток. Маджиора и др [9] сообщили, что было выражено RON в 55% раковых тканей яичника. Кроме того, если яичников линии раковых клеток, что сильно выражает RON индуцируется МПВ, рост опухоли и вторжение значительно усиливается. На основании этих данных, было высказано предположение, что РОН играет роль в прогрессировании рака яичников. Точно так же, Чен и др [10] показали, что экспрессия RON способствовало росту и злокачественной трансформации папиллом кожи, и Cheng и др [6] показали, что сильное выражение RON в линиях клеток рака мочевого пузыря коррелирует с усилением пролиферации и ингибирования апоптоза. Последнее исследование также показало, что экспрессия RON в карциноме желудка положительно коррелирует с инвазивной глубины клеток желудка и лимфатических узлах метастаз, и уровень экспрессии значительно увеличена с более высокой клинической патологии рака желудка. Таким образом, сильное выражение RON в желудочном раковых тканей может служить в качестве маркера, чтобы указать, превращение нормальных клеток к злокачественному фенотипу, который ассоциируется с повышенным инвазии опухолевых клеток и метастазирования, было бы связано с плохим прогнозом для выживания в долгосрочной перспективе. Близость желудочной ткани рака к эпителиальной дисплазии результатов желудка в восприимчивости эпителиальной дисплазии желудка до предраковых поражений. Поэтому, сообщая экспрессию RON в паранеопластического ткани, которая была собрана ~ 0,5 см от образцов желудочного рака, мы предоставляем данные, чтобы поддержать нашу гипотезу о том, что RON играет важную роль в развитии рака желудка и может служить маркером для преобразование тканей к злокачественному фенотипу.
в предыдущих исследованиях, глядя на отношения между выражением и RON выживаемости, Lee и др [11] обнаружили, что МЕТ и RON были независимыми прогностическими факторами долгосрочного рецидива рака молочной железы, и что образцы положительной для MET и экспрессия РОН была значительно ниже 10-летняя выживаемость без признаков заболевания. Точно так же, Cheng и др [6] сообщили о более низкий уровень выживаемости для рака мочевого пузыря положительных для обоих МЕТ и RON. В отличие от этого, мы обнаружили, что выживаемость пациентов положительных для экспрессии RON был не ниже, чем коэффициент выживаемости в группе РОН-отрицательным пациентом. Вполне возможно, что уровень выживаемости больных раком желудка может зависеть от многих факторов, и наши последующие данные не было достаточно, чтобы обеспечить дополнительное понимание, какие факторы могут иметь важное значение.
Заключение
Результаты этого исследование показало, что РОН выражается в раке желудка, но не в нормальной слизистой оболочке желудка. Кроме того, уровень экспрессии RON при раке желудка положительно коррелирует с инвазивной глубины, клинической патологической стадии и степени метастазов в лимфатических узлах. Мы предполагаем, что РОН играет важную роль в возникновении, прогрессии, инвазию и метастазирование рака желудка, и, следовательно, может быть важным маркером при оценке биологического поведения рака желудка. Результаты наших исследований обеспечивают фундамент для дальнейшего выявления механистические детали роли RON при раке желудка с целью выявления RON в качестве терапевтической мишени при раке желудка.
Заявления
Благодарности Знакомства работы финансировался научно-исследовательского гранта Бюро здравоохранения провинции Чжэцзян (№ 491010-W10380) (№ 2006B039) и фонд естественных наук провинции Чжэцзян, Китай (№ Y2080168).
Авторы 'оригинальные файлы представлены для изображения
Ниже приведены ссылки на оригинальные файлы представленных авторов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12885_2008_1291_MOESM2_ESM.jpeg Авторского 12885_2008_1291_MOESM1_ESM.jpeg авторов исходного файла для Рисунок 2 12885_2008_1291_MOESM3_ESM.jpeg Авторского исходного файла для Рисунок 3 12885_2008_1291_MOESM4_ESM.jpeg Авторского исходного файла для фигурного 4 конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что они нет конкурирующих интересов.

• Лапароскопическая регулируемая ленточная Roux-ан-у желудочного шунтирования в качестве первичной процедуры д…
• Повышенный риск развития аденокарциномы желудка после лечения первичного желудка диффузной большой В-клето…