Expressão da RON receptor tirosina quinase e sua associação com carcinoma gástrico contra tecidos gástricos normais

A expressão do receptor de quinase de tirosina de RON e sua associação com carcinoma gástrico contra tecidos normais gástricas
Resumo
fundo
Récepteur d'origine nantais (RON) é um receptor tirosina-quinase que é activada por um derivado de soro, factor de estimulação de macrófagos de proteína (MSP) e o crescimento é expressa em muitos tumores malignos. O objetivo do presente estudo foi o de revelar o perfil de RON e sua relação com características clinicopatológicas de carcinoma gástrico e prognóstico expressão da proteína.
Métodos
tecido carcinoma gástrico de 98 pacientes, juntamente com 29 espécimes de tecido paraneoplastic e 10 amostras de mucosa gástrica normal, foram analisados ​​por imuno-histoquimica (IHC). A análise de Western blot de 19 amostras de tecido de carcinoma gástrico e correspondente tecido paraneoplástico, 8 amostras de mucosa gástrica, normais e 2 amostras de amostras de nódulos linfáticos normais também detectada expressão de uma variante de splicing de RON, RONΔ165. Todas as amostras obtidas foram acompanhados por dados de acompanhamento do paciente que variou de 3 a 89 meses (tempo médio: 22 meses).
Resultados
A taxa de expressão RON positiva diferiu significativamente entre os tecidos de carcinoma gástrico [56,1%, ( 55/98)] e tecidos paraneoplásicos [25,6%, (29/08)] (p = 0,007). Em contraste, a expressão RON estava ausente em amostras de mucosa gástrica normais. expressão RON positivamente correlacionada com a profundidade invasivo do tumor (p = 0,019), linfa perigastric nodos metástases (p = 0,019), e fase TNM (p = 0,001). No entanto, a expressão RON foi independente do padrão de crescimento tumoral de acordo com critérios Bormann (p = 0,209), grau histopatológico (p = 0,196), e incidência de metástases à distância (p = 0,400). expressão RON não estava relacionada à taxa de sobrevivência de um paciente (p = 0,195). RONΔ165 foi fortemente expresso no tecido carcinoma gástrico fresco, tecido paraneoplastic e linfonodos perigastric com carcinoma metastizado correspondente. Em contraste, a expressão de RONΔ165 não foi observada na mucosa gástrica normal e amostras de tecido de linfonodos normais.
Conclusão
expressão RON é significativa em tecido de carcinoma gástrico e do tecido paraneoplastic correspondente, mas não é expresso na mucosa gástrica normal. Expressão de RONΔ165 semelhante foi observada em tecido de carcinoma gástrico e nas metástases presentes nos tecidos dos nódulos linfáticos. Nós supomos que RON e a sua variante de splicing desempenhar um papel importante na ocorrência, progressão e metástase de carcinoma gástrico, e, portanto, podem representar um marcador útil para avaliar a actividade biológica do carcinoma gástrico.
Fundo
A morbidade dos gástrico carcinoma está aumentando a cada ano, enquanto que a idade de início está diminuindo. Na China, carcinoma gástrico é o tumor maligno superior em ambas as categorias de morbidade e mortalidade [1]. Récepteur nantais d'origine (RON) é um receptor tirosina-quinase (RTK) que pertence à família dos proto-oncogene MET. Estudos recentes sobre um modelo de rato knockout RON mostra que a ruptura completa do gene RON é letal embrionário [2], demonstrando que RON é essencial no desenvolvimento embrionário. Ron é activado por um factor de crescimento derivado de soro, proteína estimulante de macrófagos (MSP), e estudos demonstraram que RON é expressa em muitos tumores malignos e desempenha um papel na progressão e a sua ocorrência.
Zhou et al. [3] descobriu que RON é fortemente expresso no carcinoma colorretal, e eles identificaram três variantes de splicing de RON (RONΔ160, RONΔ165 e RONΔ155). A expressão de RON e as suas variantes foi associada com a progressão do carcinoma colorrectal. Outros estudos têm mostrado que a expressão de RON e suas variantes de splicing pode precipitar epiteliais do cólon formação de colónias de células e aumentar a sua viabilidade. Quando a expressão de RON e suas variantes de splicing foram alvo de siRNA em estirpes de células de tumor rectal, proliferação e metatasis foram significativamente inibida, concomitante com um aumento da apoptose. Com base nestes dados, Ron e suas variantes de splicing é a hipótese de ter um papel importante na ocorrência, progressão e metástase do cancro rectal [4]. Da mesma forma, estudos de expressão RON em ambos os de mama e bexiga tecidos de câncer tem mostrado aumento dos níveis de expressão RON e uma correlação com grau histológico [5, 6].
Para o nosso conhecimento, o papel de RON no câncer gástrico foi apenas estudado por Collesi et al [7]. Neste estudo, a variante de splicing de RON, RONΔ165, foi detectado na linhagem de células do carcinoma gástrico, KATO-III. RONΔ165 foi mostrada para aumentar a invasão de células de cancro gástrico, o que indica um papel para a variante de splicing de RON na transformação maligna de células gástricas de um carcinoma. Neste estudo, nós examinamos a expressão de RON no tecido carcinoma gástrico de 98 pacientes utilizando o método Envision imuno-histoquímica (IHQ). Para examinar expressão de RONΔ165, foi realizada Western blot de tecido carcinoma gástrico fresco. Os pacientes incluídos no estudo foram monitorados entre 3 e 89 meses de pós-operação para investigar a associação de expressão RON, incluindo a sua variante de processamento, com as características clinicopatológicas de carcinoma gástrico e prognóstico. Devido à complexa patogénese do carcinoma gástrico, a eficácia terapêutica não provou ser muito eficaz. Assim, é importante investigar a patogênese do carcinoma gástrico para encontrar novos alvos terapêuticos.
Métodos
amostras de pacientes
amostras de tecido embebidos em parafina de 98 pacientes submetidos a cirurgia para patologicamente confirmada carcinoma gástrico no Primeiro Hospital Filiado da faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang entre 1998 e 2003 foram obtidos. amostras gástricas foram utilizados com o consentimento dos pacientes e permissão dos comitês de ética dos hospitais. Setenta homens e 28 mulheres, com idade variando de 21 a 76 anos (idade média de 58 anos), foram incluídos neste estudo. diagnóstico do paciente incluiu 78 casos de carcinoma ventriculi sinusal, 16 casos de carcinoma cárdia, e 4 casos de carcinoma gástrico total. -Cirurgia pós relatórios patológicos diagnosticado 2 adenocarcinomas bem diferenciados, 21 adenocarcinomas moderadamente diferenciados, 69 adenocarcinomas pouco diferenciados, 1 carcinoma anel de sinete celular, 2 adenocarcinomas mucinosos, e 3 displasia grave com cancerização. De acordo com UICCTNM (1998), o grau histológico das amostras foi determinada para incluir 26 etapa casos I, 14 estágio II casos, 30 estádio III casos, e 28 estádio IV casos. A taxa de follow-up para os nossos pacientes foi de 92%, com 8 pacientes não disponível para completar o follow-up. O período de acompanhamento foi de entre 3 e 89 meses (tempo médio de 22 meses) após a cirurgia. Dez amostras de mucosa gástrica normal foram examinados como controle. Dezenove amostras de tecido fresco gástrica carcinoma, tecido paraneoplásica, e tecido de linfonodo perigastric positiva foram colhidas para análise de Western blot. Dez amostras de mucosa gástrica normal, também foram incluídos como controlos. A imuno-histoquímica

amostras de parafina foram seccionados em fatias de 4 uM de espessura que foram desparafinadas, hidratadas e incubadas durante 20 min em 0,3% de H 2O 2 para inibir a actividade da peroxidase endógena. Para a recuperação de antigénio, as amostras foram incubadas com tampão de citrato 0,1 M (pH 6,0) e aqueceu-se numa panela de pressão durante 8 min. Após lavagem em TBS, as lâminas foram incubadas com soro normal de burro a 3% (NDS) em TBS durante 20 minutos para evitar a ligação não específica do primeiro anticorpo. anticorpo monoclonal de coelho anti-RON Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, EUA) foi utilizado a 1: 400. O kit Envision (DAKO) foi usado segundo as instruções do fabricante, e o anticorpo ligado foi detectado utilizando DAB. As amostras foram também co-corados com hematoxilina. As amostras foram observadas sob um microscópio de luz e uma solução de PBS-única amostra de coloração foi utilizado como um controlo de fundo. Os critérios de avaliação para a detecção
RON por imuno-histoquímica
A avaliação do grau de coloração foi determinada utilizando um processo de avaliação cega por experiente patologistas. campos de alta potência (400 ×) através de microscopia de luz padrão foram divididos em dez seções que foram marcados aleatoriamente. As células de tumor com partículas buffy no intracytoplasm foram classificados como positivos, e a percentagem de células de tumor positivas e a intensidade de coloração para cada amostra foi registado. As células tumorais que não coram para a expressão RON foram marcados como negativos, as células fracamente corados que foram marcados como 1, coloração moderada foi pontuada com um 2, e as amostras que coram fortemente foram marcados como 3. das células tumorais positivas detectadas, < 5% foram negativos, entre 5 e 24% foram marcados como 1, 25-49% foram marcados com um 2, e > 50% foram marcados com um 3. A pontuação cumulativa das células tumorais identificadas numa amostra determinada uma pontuação final da amostra. Com base na pontuação final, o tecido tumoral foi determinada a ser negativo (escore de 0-2), ou positivo (escore de 3-6) para a expressão RON.
Immunoblotting Protein
Cinquenta microgramas de proteína total para cada amostra foi separado por electroforese num gel de poliacrilamida a 10% e transferida para membrana de PVDF (Millipore). Detecção de proteína RON foi realizada utilizando um RON anticorpo monoclonal anti-coelho de Ron β (C-20) (Santa Cruz Biotechnologies, EUA) (1: 400). A ligação do anticorpo foi visualizada utilizando um anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano e um kit de quimioluminescência aumentada (ECL) (Biological Industries, Inc. Israel). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A análise estatística

SPSS 13.0 software estatístico foi usada para identificar a significância estatística dos nossos dados, usando tabelas ou quádruplas da tabela R × C χ 2 teste. As curvas de sobrevida foram avaliados pelo método de Kaplan-Meier e as comparações de taxas de sobrevivência foram testados utilizando um teste Log-rank.
Resultados
expressão RON em tecido gástrico e tecido paraneoplásico
proteína RON foi observado no cytolymph, mas não no nucléolo, de células de carcinoma gástrico e tipicamente apareceu como um granuloma buffy-coloração (fig. 1). A percentagem de células de tumor positivas e a intensidade de coloração para cada amostra foi registado. Para as amostras de pacientes avaliadas 98, RON expressão foi observada em 56,1% dos tecidos do carcinoma gástrico (55/98), mas não em amostras de mucosa gástrica normal. No carcinoma gástrico paraneoplastic tecido, o qual foi recolhido a partir da camada mucosa gástrica 0,5 cm de distância a partir dos espécimes de carcinoma gástrico, a proteína foi observada em RON 25,6% de amostras (29/08). Estes dados representam uma diferença estatisticamente significativa na expressão da proteína RON entre o tecido carcinoma gástrico e seu tecido paraneoplásica associada (χ 2 = 7,290, p = 0,007). Figura 1 Detecção de expressão RON por immunhistochemistry. Um, H) Detecção de RON numa amostra adenocarcinoma gástrico pouco diferenciado. 200 × e 400 × ampliação. B, E) de visualização ampliada da detecção RON em uma amostra de adenocarcinoma gástrico pouco diferenciado. 400 × e 200 × ampliação. C) Detecção de RON numa amostra de carcinoma do anel de sinete. 400 × ampliação. D) de detecção de RON numa amostra de um adenocarcinoma moderadamente diferenciado gástrico. 400 × ampliação. F) Detecção de RON numa amostra de um adenocarcinoma moderadamente diferenciado gástrico. 200 × ampliação. G) A detecção de RON numa amostra de carcinoma do anel de sinete. . 400 × ampliação
expressão da proteína RON em relação à patologia do carcinoma gástrico
expressão da proteína RON não foi encontrado para ser associado com sexo, idade, ou região doente (p Art > 0,05). No entanto, nos tecidos do carcinoma gástrico, o mais profundo um infiltrado de células de carcinoma, a proteína mais fortemente RON foi expresso (p = 0,019
). a expressão da proteína RON também se correlacionou positivamente com perigastric metástases em linfonodos e estágio patologia clínica com significância estatística (p = 0,019
, p
= 0,001) (Tabela 1). Em contraste, não houve diferenças estatísticas significativas na expressão RON com a classificação patologia, tipo de Borrmann, ou a presença de metástase. No entanto, observou-se que a expressão RON foi mais forte no grupo Borrmann III /IV (63,6%) do que no grupo Borrmann I /II (53,8%), mais forte no grupo metástase distante (68,2%) do que nos não-distante grupo metástases (52,6%), e mais forte no grupo histologicamente inferior diferenciado (52,4%) do que no grupo histologia moderadamente diferenciadas e altamente (39,1%). Não houve diferenças estatísticas significativas para estas comparações (p = 0,209; p = 0,400; p = 0,196), respectivamente (Tabela 1) .table 1 Relação de expressão RON à patologia parâmetros

RON
RON
Χ2
p
(+) (%)
( câncer gástrico precoce) profundidade de invasiva
5 (29,4)
12
infiltrada para a camada muscular
15 (51,7)
14
7,795
p - = 0,019
invadido para membrana serosa
35 (67,3)
17
TNM Stage
Stage
14 (35,0)
26
12,245
p = 0,001
Stage
41 (70,7)
17
metástases para linfonodos
N0
11 (37,9)
18
N1-3
44 (63,8)
25
5.535
p = 0,019
Borrmann Grade
I /II grupo
14 (53,8)
12
III /IV grupo
35 (63,6 )
20
0,708
p = 0,400
Outros
6
11
Histologia Grade
Moderadamente &
altamente diferenciada 9 (39,1)
14
1.577
p = 0,209
menos diferenciado *
39 (54,2)
33
Outros **
0 Sims 3
Distante Metástase
M0
40 (52,6)
36
1.675
p = 0,196
M1
15 (68,2)
7
* Inclui adenocarcinoma pouco diferenciado, carcinoma de células em anel de sinete, adenocarcinoma mucinoso; ** Displasia grave com cancerização.
Expressão e sobrevivência taxas RON
Para os 90 pacientes incluídos neste estudo, que foram seguidas de pós-operacional, não houve diferença estatisticamente significativa nas taxas de sobrevivência entre os pacientes com carcinoma gástrico RON-positivos amostras em comparação com amostras de RON-negativos do carcinoma gástrico (Fig. 2). Figura 2 Curva de sobrevida para RON + contra Ron-pacientes.
Detecção do RONΔ165 emenda variante
Nas 19 amostras de tecidos de carcinoma gástrico frescos recolhidos, juntamente com tecidos paraneoplásicos correspondente e patologicamente confirmada linfonodos perigastric com carcinoma metastático, a variante de processamento de RON, RONΔ165, foi expressa. Em contraste, não se observou nenhuma expressão de proteína RON na mucosa gástrica normal ou o tecido normal do linfonodo (Fig. 3, 4). Figura 3 a análise Western blot de expressão RON no tecido gástrico carcinoma, tecido paraneoplastic e linfonodos perigastric. As amostras em duplicado de tecido de carcinoma gástrico (T), o tecido paraneoplastic (P), e dos nodos linfáticos metastáticos (L) tecidos foram analisados ​​para a expressão de RONΔ 165 (165 kDa). mucosa gástrica normal (N) e amostras de tecido de linfonodos normais (NL) foram comparados. β-actina (44 kDa) foi utilizada como um controlo de carga.
Figura 4 Análise de mancha de Western da expressão RON em tecido de carcinoma gástrico, tecido paraneoplástico, e mucosa gástrica normal. As amostras em duplicado de tecido de carcinoma gástrico (T) e tecido paraneoplastic (P) foram analisadas quanto à expressão de RONΔ165 (165 kDa) e comparadas com amostras de tecidos normais da mucosa gástrica (N). Marcador (M) e controlo positivo (PC) (160 kDa) foram incluídos.

Discussão No presente estudo, nós mostrar tanto por IHC e Western blot que a expressão de RON não é detectável na mucosa gástrica normal. Estas observações são consistentes com os resultados de Okino et [8] al. No entanto, a coloração de RON em tecidos de carcinoma e os tecidos paraneoplásicos correspondentes por IHQ mostraram expressão significativa de RON relativamente a amostras normais da mucosa gástrica. análise de Western blot forneceram informações mais específicas sobre a expressão RON com detecção de RONΔ165 em tecidos de carcinoma gástrico, tecidos paraneoplásicos correspondente e linfonodos com metástases de carcinoma. Estes dados indicam que a expressão de RON de comprimento completo, bem como uma variante de RON, são expressos durante o processo de transformação maligna de células epiteliais gástricas. Com base nestes dados e trabalho em outros estudos sobre o papel de RON em fenótipos tumorigénicas, os autores sugerem que RON pode actuar como um oncogene para promover a ocorrência, progressão, invasão e metástases de cancro gástrico.
Estudos anteriores demonstraram que expressão de RON correlaciona-se com a invasão de células tumorais. Maggiora et ai [9] relataram que RON foi expresso em 55% de tecidos de cancro do ovário. Além disso, se uma linha de células de cancro do ovário que expressa fortemente RON é induzida por MSP, o crescimento tumoral e a invasão é significativamente melhorada. Com base nestes dados, foi colocada a hipótese de que RON desempenha um papel na progressão de cancro do ovário. Da mesma forma, Chan et al [10] demonstraram que a expressão de RON promoveu o crescimento e transformação maligna de papilomas da pele, e Cheng et al [6] demonstraram que a expressão forte de RON em linhas celulares de cancro da bexiga correlacionado com o aumento da proliferação e inibição da apoptose. Este último estudo também demonstrou que a expressão de RON no carcinoma gástrico positivamente correlacionada com a profundidade invasiva do cancro gástrico de células e os gânglios linfáticos metástase, e o nível de expressão aumentou significativamente com patologias clínicas mais elevados de cancro gástrico. Portanto, a expressão forte de RON em tecidos de cancro gástrico pode servir como um marcador para indicar uma conversão de células normais para um fenotipo maligno, o que está relacionado com o aumento da invasão de células de tumores e metástases, iria ser associado a um mau prognóstico para a sobrevivência a longo prazo. A proximidade do tecido de cancro gástrico à displasia epitelial do estômago resulta em susceptibilidade do displasia epitelial do estômago para lesões pré-cancerosas. Portanto, relatando a expressão de RON no tecido paraneoplástico, que foi recolhido ~ 0,5 cm de distância das amostras de carcinoma gástrico, que estão fornecendo dados para suportar a hipótese de que RON desempenha um papel importante na promoção do cancro gástrico e pode servir como um marcador para a a conversão de tecidos a um fenótipo maligno.
Em estudos anteriores olhando para a relação entre as taxas de expressão e sobrevivência Rony, Lee et al [11] descobriu que MET e RON foram fatores prognósticos independentes de recorrência a longo prazo do câncer de mama, e que amostras positivas para MET e expressão Ron tinha uma taxa de sobrevivência significativamente menores de 10 anos livre da doença. Da mesma forma, Cheng et al [6] relataram uma menor taxa de sobrevivência para os cancros da bexiga positivos tanto para MET e RON. Em contrapartida, verificou-se que a taxa de sobrevivência de pacientes positivos para a expressão RON não foi menor do que a taxa de sobrevivência para o grupo de pacientes RON-negativo. É possível que a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer gástrico pode ser afetado por muitos fatores, e os nossos dados de acompanhamento não foi suficiente para fornecer esclarecimentos adicionais sobre os fatores que podem ser importantes.
Conclusão
Os resultados deste estudo mostram que RON é expressa em câncer gástrico, mas não na mucosa gástrica normal. Além disso, a taxa de expressão de RON no câncer gástrico correlaciona-se positivamente com a profundidade invasiva, o estágio patológico clínica, e extensão da metástase ganglionar. Nossa hipótese é que RON desempenha um papel importante na ocorrência, a progressão, invasão e metástase de câncer gástrico e, portanto, poderia ser um marcador importante na avaliação do comportamento biológico do câncer gástrico. Os resultados de nossos estudos fornecem uma base a partir da qual para identificar melhor os detalhes mecanicistas do papel da RON no câncer gástrico, a fim de identificar RON como um alvo terapêutico no cancro gástrico.
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Research Grant Científico do Bureau da Província de Zhejiang Saúde (No. 491.010-W10380) (No. 2006B039) e Natural Science Foundation da província de Zhejiang, China (No. Y2080168).
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Os autores declaram que têm interesses conflitantes.

• -Roux en-y de desvio laparoscópica ajustável faixas gástrica como procedimento primário para o super-super-obesos (índice de massa corporal > 60 kg /m2)
• Aumento do risco de adenocarcinoma gástrico após o tratamento de gástrico primário difuso de grandes células B lymphoma