Наличие S100A9-позитивных клеток воспаления в тканях раковых коррелирует с ранней стадии рака и лучшим прогнозом у больных раком желудка

Наличие S100A9-позитивных клеток воспаления в тканях рака коррелирует с ранней стадии рака и лучшим прогнозом у пациентов с раком желудка
Аннотация
фона
S100A9 первоначально был открыт как фактор, секретируемый клетками воспаления. В последнее время S100A9 было установлено, что связано с несколькими злокачественных опухолей человека. Целью данного исследования является изучение экспрессии S100A9 при раке желудка и исследовать его роль в прогрессии рака.
Методы
экспрессии S100A9 в образцах ткани желудка из 177 больных раком желудка оценивали с помощью иммуногистохимии. Выражение его димеризации партнера S100A8 и гетеродимера S100A8 /А9 также оценивали таким же способом. Влияние экзогенного S100A9 на моторику клеток рака желудка AGS и BGC-823 затем исследовали.
Результаты
S100A9 была специфически экспрессируется воспалительными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы в человека рака желудка и гастрит тканей. Статистический анализ показал, что подсчет высокой S100A9 клеток (> = 200) на 200-кратное увеличение микроскопического поля в тканях рака была предиктором ранней стадии рака желудка. Высокая S100A9-позитивных клеток было отрицательно коррелирует с метастазов в лимфатических узлах (P = 0,009
) и опухолевой инвазии (P
= 0,011). S100A9 был идентифицирован как независимый прогностический предиктором общей выживаемости пациентов с раком желудка (P
= 0,04). Пациенты с высоким S100A9 подсчета клеток с благоприятным прогнозом (P = 0,021
). Дальнейшее исследование показало, что распределение S100A8 в желудочном раковых тканей человека была похожа на S100A9. Тем не менее, количество S100A8-позитивных клеток не положительно коррелирует с выживаемостью пациентов. Воспалительные клетки проникают рак были S100A8 /A9 отрицательным, в то время как при гастрите были положительными. Кроме того, экзогенный белок S100A9 заторможенные миграцию и инвазию клеток рака желудка.
Выводы
Наши результаты свидетельствуют о S100A9-положительных воспалительных клеток в желудочных тканях рака связаны с ранней стадией рака желудка и хорошим прогнозом.
Ключевые слова
рак желудка S100A9 Воспалительные клетки стадирования опухоли по выживанию фон
рак желудка является одной из ведущих причин смертности от рака во всем мире. В общей сложности 989,600 новых случаев рака желудка и 738,000 смертей, по оценкам, имели место в 2008 году, и более 70% новых случаев заболевания и смерти происходят в развивающихся странах, таких как Китай [1]. Рак желудка обычно обнаруживается на поздних стадиях, когда прогностические результаты являются бедными. Почти 70-80% пациентов имеют вовлечение региональных лимфатических узлов, оказывает большое влияние на выживаемость [2, 3]. Таким образом, открытие новых биомаркеров, помогающих в раннем выявлении и точного прогнозирования поведения опухоли может улучшить выживаемость пациентов [4-6].
Члены семейства белков S100 появляются в качестве биомаркеров в нескольких типах опухолей [7]. Член семьи S100 S100A9 является 13kd белок, который содержит консервативные структурные мотивы, состоящие из двух EF-руки Ca 2 + -связывающим доменов. После связывания кальция, S100A9 взаимодействует с другим S100 членом семьи S100A8, чтобы сформировать функциональный гетеродимера под названием калпротектина [8, 9]. S100A9 первоначально был идентифицирован как фактор, секретируемый воспалительными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы в ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника и других воспалительных заболеваний [10-14]. S100A9, S100A8, а также гетеродимер калпротектина S100A8 /А9, избыточно экспрессируются во время воспаления канцерогенез [15]. S100A9 выражение повышающей регуляции в опухолевых клетках в легких [16], предстательной железы [17], а также рак молочной железы [18, 19], в то время как он вниз регулируется в пищеводных раковых клетках человека [20]. В образцах колоректальной ткани рака, однако, белок S100A9 не был обнаружен в раковых клетках, а в воспалительных клетках, разбросанных по всей строме опухоли [21]. Кроме того, S100A9 был в образцах кала больных колоректальным раком значительно выше, чем в контрольной группе [22]. При раке желудка, экспрессию генов и протеомики анализ показал высокую экспрессию S100A9 в ткани. [23, 24]. Тем не менее, его распределение в ткани и ассоциации с клинико-патологическими особенностями не были полностью подтверждена.
В этом исследовании мы использовали анализ экспрессии генов, чтобы сравнить экспрессию S100A9 в желудочном раковых тканях и в соседних, якобы нормальных тканей. Иммуногистохимическое окрашивание показало S100A9 в опухолеассоциированными воспалительных клеток. Кроме того, мы обратились корреляцию между числом S100A9-позитивных клеток в опухолевых тканях и клинико-патологическими особенностями. Мы также обратились к совместной локализации S100A9 и S100A8, а также локализацию димера калпротектина иммунофлюоресценции. Наконец, чтобы получить представление о функции S100A9 в раковых клетках, мы исследовали влияние рекомбинантного белка S100A9 по миграции и инвазии клеток рака желудка AGS и BGC-823.
Методы
Пациенты и образцы ткани <бр> Это исследование было проведено после утверждения комитетом по этике пекинской онкологической больницы университета им. Было получено информированное согласие от каждого пациента. Были изучены Сто семьдесят шесть пациентов с раком желудка. 124 мужчин и 53 женщин (средний возраст, 57 лет, диапазон, 26-80 лет) был поставлен диагноз и хирургическое лечение в онкологическом госпитале пекинского университета в период с 1998 по 2004 Глубина инвазии опухоли, гистологической степени, метастаз узла лимфы, метастазов в печени, и сосудистой инвазии были получены из клинических и гистологических отчетов. Стадия рака желудка была классифицирована в соответствии с 7-е издание опухоли узел метастазирования (TNM) классификации, рекомендуемой Американской Объединенного комитета по вопросам рака путем. Ни один из пациентов не получали химиотерапии или лучевой терапии перед операцией. Все пациенты находились под наблюдением вплоть до января 2010 г. После гастрэктомии, одна часть образца резецированных фиксировали в 10% формалине и обрабатываются регулярно патологической оценки, а другая была быстро замораживали в жидком азоте хранятся при температуре -80 ° С для экстракции РНК. Кроме того, 30 совпадающая метастатические лимфатические узлы были собраны из этих пациентов. Десять случаев хронических тканей аппендицита с обострением были предоставлены кафедрой общей хирургии, аффилированное больница Циндао медицинского колледжа университета.
Иммуногистохимия (IHC)
Четыре микрометра секций из фиксированных формалином парафиновых срезах тканей были установлены поли-L-лизин покрытием скользит, а затем депарафинировали в ксилоле и повторно гидратируют с помощью спирта в дистиллированной воде. Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3% перекиси водорода в течение 15 мин при комнатной температуре. После того, как давление приготовления слайдов в 10 ммоль /л ЭДТА (рН 8,0) в течение 3 минут, срезы инкубировали с 5% козьей сывороткой, затем инкубируют в течение ночи при 4 ° С с мышиной анти-S100A9 антителом (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Швейцария), или мышиное анти-S100A8 антител (1: 200, T1031, БМА Biomedicals), или мышиное анти-S100A8 /А9 антител (1: 200, T1023, БМА Biomedicals). Первичные антитела были обнаружены с помощью двухступенчатой ​​системы Envision (Dako, Glostrup, Дания). Хрен пероксидазу и гидрохлорид diaminobenzedene (DAB) были фермента и хромоген использовали. Выражение S100A9, S100A8 и S100A8 /A9 были также обнаружены в Cybrdi ткани микрочипов слайдам (IC00-01-001, Cybrdi, Сиань, Китай), содержащий хронический гастрит с метаплазией (57 случаев) и желудочных тканей карциномы (23 случаев). Десять случаев хронического аппендицита образцов с обострением были обслужены в качестве положительного контроля для S100A8 /A9.
Оценку IHC и отсечение определение
S100A9 и S100A8 окрашивали в воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, проникающих опухолевых тканей. Положительные клетки показали разную степень цитоплазматического окрашивания. Изображения были получены с использованием Ariol системы анализа изображений (Applied Imaging, Сан-Хосе, Калифорния, США). Сканер на основе микроскопа Olympus BX61 с моторизованным сцены и автофокусом возможностей, оснащенных камерой. Слайды сканировали при 200-кратном увеличении. Степень моноклональное S100A9 или реакционной способности антитела S100A8 в каждой секции ткани оценивали путем подсчета количества окрашивающего воспалительных клеток в трех 200-кратном увеличении областей. Это было проведено двумя независимыми патологоанатомов с помощью автоматической системы микроскопа и программного обеспечения для обработки изображений (см Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Пороговые значения S100A9 окрашенных клеток воспаления для прогнозирования пациента патологического этапа определяли с помощью приемника характеристической кривой (ROC).
Лазерного конфокального сканирования
Чтобы исследовать совместной локализации S100A9 и его димеризации партнера S100A8, или гетеродимер S100A8 /А9, ткань микрочипов слайды Cybrdi (IC00-01-001) были инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре с мышиного анти-S100A9 антителом (1: 200), предварительно меченных с комплектом Зенон Alexa Fluor 647 Мышь IgG Labeling (Z-25008, красная флуоресценция), и либо анти-S100A8 антител (1: 200) или анти-S100A8 /A9 антител (1: 200), предварительно меченных с Зенон Alexa Fluor 488 Mouse IgG Labeling Kit (Z-25002 , зеленая флуоресценция). Конфокальные изображения были получены с помощью Leica TCS SP5 конфокальной микроскопии (Leica, Mannheim, Германия). . Кроме того, ядер контрастно с DAPI (Vector, Burlingame, CA, США), возбуждение при 358 нм
Образцы тканей хронических аппендицита с обострением, инкубировали с анти-S100A9 антителом (1: 200, красный флуоресцентной меченый), и анти-S100A8 /А9 антитела. (1: 200, зеленая флуоресценция маркированы) в качестве положительного контроля для специфической экспрессии гетеродимера S100A8 /A9
клеточные культуры
обеих клеточных линий в данном исследовании, были предварительно профилированных по микрочипов анализа и регулярно проверять с помощью анализа STR (короткий тандемный повтор ДНК-дактилоскопии) [25]. Линия клеток желудка AGS была получена из АТСС (Американской коллекции типовых культур, Manassas, VA), и клеточной линии BGC-823 был создан в Китае и полученный из клеток научно-исследовательский институт, Шанхай, Китай. Раковые клетки были обычно выращивают в виде монослоя в среде RPMI-1640 среде (GIBCO BRL, Карлсбад, Калифорния), с добавлением 10% (об /об) фетальной телячьей сыворотки (FCS, Gibco), и антибиотики при 37 ° C в увлажненной 5% CO <югу> 2 атмосферы.
инвазии клеток анализ
CytoSelect 24-Well инвазии клеток набора для анализа был приобретен у Cell Biolabs, США. S100A9 рекомбинантный белок был приобретен у фирмы BMA Biomedicals, Швейцария. Инвазии клеток анализы проводили с Transwell вкладышем, который позволяет клеткам мигрировать через 8 мкм размер пор мембраны из поликарбоната. Верхняя поверхность вставки мембраны была покрыта равномерным слоем высушенный подвального мембранного раствора матрицы. Клетки ресуспендировали в среде без сыворотки, высевали в верхней палате каждого Transwell при плотности 10 6 клеток /мл (200 мкл /камеры). S100A9 рекомбинантный белок был добавлен в верхней среде камере при 0, 10, 20, 50, или 100 нг /мл. Нижняя камера была заполнена 500 мкл среды, содержащей 10% FCS. Клетки давали возможность мигрировать в течение 48 ч при 37 ° С. Клетки, которые оставались в верхней камере, были удалены с помощью ватного тампона, и клетки, которые проникали к нижней стороне мембраны, были окрашены в Cell Stain раствор в течение 15 минут, и подсчитывали в девяти случайно выбранных микроскопических полей (200 ×) на лунку , Каждый вкладыш затем переносили в пустую лунку и инкубировали в 200 мкл экстракционного раствора. Через 10 минут 100 мкл раствора из каждой пробы переносили на планшет для микротитрования 96-луночного и измеряется в планшет-ридере при OD560nm. Миграция
Анализ клеточного
подвижности клеток оценивали с помощью анализа заживления раны. Клетки высевали в шесть-луночных планшетах для культуры тканей и культивировали до тех пор, пока сливная, чтобы получить клеточный монослой, который затем был раненую с использованием стерильных 200 мкл кончики пипеток. Любой клеточный дебрис удал ли путем промывки PBS. Раненый монослой клеток инкубировали в среде с 100 нг /мл рекомбинантного белка S100A9. Контрольные клетки обрабатывали свободной от сыворотки среде RPMI-1640. Время покадровой изображения были получены с помощью перевернутого фазового контрастного микроскопа при 200-кратном увеличении на 0, 24 и 48 ч. Способность миграции клеток оценивали путем вычисления среднего расстояния миграции клеток.
Статистический анализ
клиникопатологическими переменные были получены из клинических и гистологических отчетов. Кривые ROC были использованы при определении среза значение S100A9-положительным воспалительным подсчета клеток при оценке патоморфологической стадии TNM. Ассоциация S100A9-положительного воспалительного количества клеток с различными стадиями TNM было сделано с помощью теста Вилкоксона. Для того, чтобы получить связь между количеством клеток S100A9 или S100A8 и клиникопатологическими переменных, данные были кросс-табличной и χ
2 тест был выполнен. Накопительное выживание оценивали с помощью метода Каплана-Мейера, а сравнение между группами проводили с помощью теста лог-ранга. Общая выживаемость была измерена с даты начальной операции до даты смерти, считая смерть от любой причины в качестве конечной точки, или последней даты информации в качестве конечной точки, если ни одно событие не было документально зафиксировано. Многофакторный анализ пропорциональных рисков регрессионной модели Кокса (назад, ступенчатого) была создана, чтобы оценить влияние каждой переменной на выживание. Значение была установлена ​​на уровне P &
ЛТ; 0.05.

Результаты Экспрессия S100A9 в инфильтрации воспалительных клеток при раке желудка и хронических гастритах тканей
В предыдущем анализе массива генов, мы обнаружили, что желудочные раковые ткани отличались от соседних доброкачественное слизистой характерными различиями в их паттерны экспрессии генов [26]. Разнообразие моделей экспрессии гена, может отражать различия в свойствах, присущих опухолевых и нормальных клеток, а также изменение клеточного состава этих сложных тканей. В пределах этих генов, экспрессия S100A9 в желудочном раковых тканей была выше, чем у соседнего согласованного доброкачественное слизистой оболочки (P
= 0,00241, рис 1А). Рисунок 1. Экспрессия S100A9 при раке желудка и прилегающих к нему нераковых тканей. (A) другое значение выражение S100A9 в 72 раковых тканей желудка и не в паре не-раковых тканей путем анализа данных из Illumina Sentrix BeadChip кДНК микрочипов. (В-Е) Иммуногистохимическое окрашивание S100A9 в желудочном раковых тканей (B) метастатические лимфатические узлы (С), хронический гастрит (D), а также прилегающих незлокачественный слизистую оболочку желудка (Е). локализация S100A9 было обнаружено в виде коричневого или красного гранулированной локусов в цитоплазме инфильтрации воспалительных клеток, особенно в мононуклеарных фагоцитов и нейтрофильных гранулоцитов. (Увеличение 200 ×).
Иммуногистохимия образцов из 177 больных раком желудка показало, что S100A9 был положительным во всех первичных раковых тканей с иммунным окрашиванием исключительно находится в воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, проникающих первичных опухолевых тканей (различные типы клеток в ткани образцы были идентифицированы с помощью двух независимых патологи) (Фигура 1В). Все рассмотренные метастатических лимфатических узлов (п = 30) также были положительными для S100A9 с иммунным окрашиванием исключительно находится в воспалительных клетках, окружающих метастатических раковых тканей (рис 1C). В соседней нераковая слизистой оболочки, была выражена S100A9 в воспалительных клетках, проникающих гастрит. Слизистая оболочка желудка была отрицательная или очень слабое выражение S100A9 (рис 1D, E).
S100A9-положительным воспалительным количество клеток в тканях рака связан со стадией рака и пациента выживания
Чтобы оценить степень экспрессии S100A9 в желудочном железы с связанная среды, число S100A9-положительных воспалительных клеток в каждой ткани опухоли измеряли путем усреднения числа клеток трех полей (оригинальное увеличение, 200 ×) в области с наибольшим количеством положительных клеток на месте глубокой инвазии опухоли. Соотношение между количеством клеток и клинико-патологическими параметрами и выживаемости пациентов анализировали с использованием Уилкоксона тест суммы рангов и метод Каплана-Мейера. Как показано на рисунке 2А, ​​постепенное снижение S100A9-положительного воспалительного количества клеток в раковых тканях было связано с увеличением опухоли патологического стадии от I до IV (Вилкоксона критерий суммы рангов для 4-х этапов, P
= 0,0265). Рисунок 2 Высокая S100A9 количество клеток в ткани рака указывает на лучший результат в больных раком желудка. (А) Разброс участок S100A9-положительного воспалительного количества клеток в каждой патологической стадии TNM. Синяя линия указывает на уровень 200 (B) ROC кривой подсчета клеток S100A9 для прогнозирования патоморфологической стадии TNM. Стрелка указывает на точку среза около 200 (C) Kaplan-Meier анализ общей выживаемости для каждой стадии патологического TNM. (D) Каплана-Мейера анализ общей выживаемости для подсчета S100A9 высокой клеток (≥ 200) группа и количество клеток с низким S100A9 (&л; 200) группу. (Только 176 пациентов были включены в анализ для одного пациента потеряли для последующего наблюдения).
Тогда мы тестировали силу предсказания подсчета S100A9 клеток для стадии опухоли при раке желудка. На основании стадии TNM, пациенты были разделены на две группы, менее развитой группы (этап I + II) и передовой группы (стадия III + IV). Площадь под кривой (ППК), полученной от приемника характеристических (ROC) кривых с использованием S100A9-положительных клеток воспаления подсчет был 0,623 для патологических стадий TNM. Значение среза было 198,5 (мы использовали 200 в последующем анализе) в поле 200-кратным увеличением с 64,3% чувствительностью и 61.9% специфичностью для прогнозирования стадии опухоли (рис 2В). Граничная линия 200 может быть использован для разделения менее продвинутой группы из передовой группы. Разница была значительной между двумя группами (Вилкоксона критерий суммы рангов для двух групп, P
= 0,017, рис 2А).
Поскольку анализ выживаемости показал значительно отличается прогноз для больных раком желудка на разных стадиях рака (рис 2C) , мы проанализировали связь между S100A9-положительными воспалительными клетками подсчета и выживаемости пациентов. Пациенты были разделены по значению обрезания в большой кол S100A9 клеток (≥ 200) группа и количество клеток с низким S100A9 (&л; 200) группы. Скорость 5-летняя выживаемость составила 44,6% в высокой количеству клеток группе по сравнению с 22,5% в низкое количество клеток группе (P = 0,021
, Рисунок 2D). Медиана выживаемости составила 35,1 ± 10,8 месяцев для высокой клеточной количеству группы и 20,3 ± 3,0 месяца для низкого числа клеток группы, соответственно. Взятые вместе, S100A9-положительный воспалительный количество клеток в ткани рака желудка может быть использован в качестве предсказателя, чтобы отличить ранней стадии и раком желудка с среза 200 положительных клеток /HPF. Наличие S100A9-положительных воспалительных клеток в раковых тканях коррелирует с лучшим прогнозом у больных раком желудка.
Низкое число S100A9-положительных воспалительных клеток в раковых тканях положительно коррелирует с плохим клинико-патологическими
Особенности подсчета Низкая S100A9 клеток было обнаружено коррелируют с глубиной инвазии опухоли (Т стадия), узел метастаза лимфатический (N стадия) и клинической стадии TNM (P
= 0,011, 0,009 и 0,002, соответственно). Корреляция между графом S100A9 клеток и других клинических особенностей, таких как пол, возраст, место опухоли, метастазов в печени (M этап), сосудистой инвазии и дифференцировки не были статистически значимыми (все P
> 0,05) (таблица 1). Кроме того, многомерный анализ показал N стадию (P = 0,006
), метастаз печени (P = 0,000
), и количество S100A9 клеток (P
= 0,046), чтобы быть независимыми факторами прогнозирования общей выживаемости (Таблица 2 ) .table 1 Ассоциация S100A9-положительным воспалительным количество клеток в раковых тканях с клинико-патологическими параметрами у больных раком желудка
Variables

Low S100A9 (положительных клеток < 200)

High S100A9 ( положительных клеток и Гт = 200)

P значение на
Sex
0,125
Male
74
50
Женский
25
28
Возраст
0,089
&50 Лт;
32
18
50-59
24
12
60-69
33
33
> = 70
10
15
Опухоль местоположение
0,271
Cardia
26
15
Non-кардиального
73
63
Глубина инвазия опухоли **
0,011
T1
3 страница 2 T2
7
19
T3
69
42
T4 <бр> 20
15
лимфоузлов метастаз
0,009

13 N0
23
N1
32
30
N2
32 <бр> 17
N3
22
8
Печень метастаз
0,571
Негативный
89
68
позитиве
10
10
TNM стадия
0,002
3 І

12
II
37
35
III
50
21
IV
9
10
васкулярной инвазии
0,742
Негативный
38
31
позитиве
58
43
Не записано * страница 3 4
Дифференциация **
0,472
Ну
2 4
Умеренно + Плохо
82
66
Другие типы
13
6
Не определено
2 страница 2 * Данные неполные.
** точный критерий Фишера.
Таблица 2 Многофакторный анализ прогностических факторов общей выживаемости больных раком желудка
Вариации

P


RR

CI (95%)

Секс
0,671
1,106
0.694-1.765 <бр> мужчина по сравнению с женской
Возраст
0,179
1,148
0.938-1.405
&л; 50
50-59
60-69
> = 70
опухолевые Локация
0,545
0,864
0.538-1.387
Cardia против
Non-кардиального
дифференциацию
0,301
0,751
0.437- 1,292
Ну по сравнению с умеренно + плохо
узла метастазирования лимфы
0,006
1,841
1.196-2.835
N0 + N1 по сравнению с N2 + N3
Глубина инвазии опухоли
0.1
1,756
0.897-3.435
T1 + T2 по сравнению с T3 + T4
метастаз печени
0
3,461
2.002-5.983
Отрицательный Положительный сравнению
васкулярной инвазии
0,107
1,452
0.922-2.285
Негативный по сравнению с S100A9-положительный положительный
воспалительной клетки счетчик
0,046
0,643
0.417-0.991
&л; 200 по сравнению с > = 200
RR: относительный риск; ДИ:. Доверительный интервал
Статус экспрессии S100A8 и гетеродимер S100A8 /A9 в желудочном раковые ткани и ткани гастрит
Хронический гастрит является хроническим желудка поражение, патологически характеризуется неспецифическим хроническим воспалением слизистой оболочки желудка. Воспалительные клетки при хроническом гастрите морфологически как те инфильтрации первичные желудка тканей рака. В некоторых случаях, хронический гастрит, даже может привести к раку желудка. Далее, мы дополнительно исследовали экспрессию S100A8, близкого члена семьи S100A9 и форме гетеродимеризации S100A8 /А9 в обоих желудочных раковых тканей и прилегающих к ним неопухолевыми хронических гастритов тканей в желудочном образцов рака путем проведения иммуногистохимии. Точно так же к образцу S100A9, выражалось S100A8 исключительно в воспалительных клетках, проникающих как опухолевых тканей и прилегающих тканей гастрит. . S100A8 не экспрессируется во всех клеток рака желудка и нормальной слизистой оболочки желудка
Далее, мы количественно число S100A8-позитивных воспалительных клеток в каждой ткани опухоли, как описано ранее для S100A9 (дополнительный файл 1: Рисунок S1). Удивительно, но S100A8 количество клеток в желудочных тканях рака не коррелировала с большинством функций (клинико-патологическими дополнительный файл 2: Таблица S1) или выживания пациента (Дополнительный файл 3: Рисунок S2). Кроме того, выражение вида гетеродимеризации S100A8 /А9 не был обнаружен ни в одном воспалительных клеток, проникающих желудочные раковых тканей, в то время как некоторые S100A8 /A9 положительные клетки были обнаружены в тканях хронических гастритов (данные не показаны). Эти данные свидетельствуют о том, что распределение S100A9, S100A8 и S100A8 /A9 может отличаться от рака желудка человека и хронических гастритов тканей.
Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы дополнительно исследовали внутриклеточную картину локализации S100A9, S100A8 и S100A8 /A9 гетеродимера выражение, выполняя immunofluorecence окрашивание в микрочипе ткани в том числе 23 случаев рака желудка и 57 случаев хронического гастрита. В желудочном раковых тканей, как S100A9 и S100A8 белки были обнаружены в опухолевых инфильтрующих воспалительных клеток (Фигура 3А, В), в то время как не S100A8 /А9 гетеродимер не было обнаружено ни в одном случае (рис 3G). Выражение S100A8 и S100A9 частично перекрываться в цитоплазме клеток (рис 3D, E). Кроме того, S100A9 и S100A8 белки были обнаружены в воспалительных клетках при хроническом гастрите (рис 3K, L). Распределение этих двух белков также частично перекрываться (рисунок 3N, O). В соответствии с результатами иммуногистохимии, S100A8 /A9 не было выражено в любых клетках тканей рака желудка (рис 3G), в то время как экспрессия S100A8 /A9 частично перекрывается с S100A9 в воспалительных клетках гастрита тканей (рис 3Q, S, T) , Неудивительно, что экспрессия и распределение S100A8 /A9 в хронических аппендицита тканях с обострением (положительный контроль) были похожи друг на друга тем, при хронических гастритах тканях (рис 3U, V, X, Y). Взятые вместе, дифференциальное выражение и внутриклеточной локализации S100A9, S100A8 и S100A8 /A9 в различных тканях может вовлечь их различные роли при раке желудка или хроническим гастритом среде. Рисунок 3 иммунофлуоресценции изображения S100A9, S100A8 и S100A8 /A9 белков в ткани микрочипов слайдах, содержащих желудочные раковые ткани (A-J) и хронических гастритов тканей (K-T), а также хронических аппендицита тканей с обострением (U-Y). S100A9 и S100A8 были обнаружены моноклональные антитела, prelabeled с Зенон Alexa Fluor Mouse IgG Labeling Kit (с зеленой и красной флуоресценции соответственно). Ядро было окрашивали DAPI. S100A8 /A9 гетеродимеры были обнаружены с использованием димера специфических антител 27E10 из BMA Biomedicals prelabeled с зеленой флуоресценции. Совместно локализация S100A9 и S100A8 или S100A8 /A9 проявилось в присоединяемых снимков (D, I, N, S, X) и более крупных слившихся изображений (E, J, O, T, Y). Белая стрелка в 3 T показывает совместной локализации S100A9 и S100A8 /A9 при хроническом гастрите. Длина Бар, 50 мкм.
ингибирующее действие рекомбинантного белка S100A9 по вопросам миграции и инвазии желудка линий раковых клеток в пробирке
Белок S100A9 выражается в и выделяемыми воспалительными клетками, выступающей в качестве посредника в острой и хроническое воспаление. Так как S100A9-положительным воспалительным количество клеток коррелирует с менее агрессивным клинико-патологическими характеристиками, мы дополнительно тестировали прямую тормозную функцию рекомбинантного S100A9 на миграцию и инвазии клеток рака желудка. Для оценки инвазивную способность клеток рака желудка, использовали Transwell анализы. Два желудка линии раковых клеток, AGS и КУП-823, обрабатывали свободной от сыворотки средой или средой, содержащей различные концентрации S100A9 рекомбинантного белка (10, 20, 50 и 100 нг /мл, соответственно). Инвазивные клетки подсчитывали в девяти случайно выбранных микроскопических полей (200 ×). Результаты показали, что S100A9 рекомбинантный белок слегка ингибируется AGS проникновению клеток (фиг.4А), в то время как S100A9 значительно ингибирует КУП-823 вторжение в зависимости от концентрации (Р
≪ 0,05, фиг.4С). Для анализа перенастройки способности клеток рака желудка, мы провели ранозаживляющих анализа. Обе клеточные линии были обработаны не содержащей сыворотки среде или среде, содержащей 100 нг /мл рекомбинантного белка S100A9. Результаты показали, что S100A9 слегка ингибируется миграция клеток АГС (4В), в то время как миграция клеток расстояния КУП-823 клеток, обработанных S100A9 через 24 ч и 48 ч инкубации, были значительно ниже, чем у контрольной (P
&ЛТ 0,05, Рисунок 4D). Рисунок 4. Влияние S100A9 рекомбинантного белка на инвазию и миграцию клеток желудка линий. В Transwell анализе, AGS (А) и КУП-823 (C) клетки обрабатывали не содержащей сыворотки среде или среде, содержащей 10, 20, 50 или 100 нг /мл рекомбинантного белка S100A9. Инвазивные клетки подсчитывают в случайно выбранных девяти микроскопических полей (200 ×). В процессе заживления ран анализе, AGS (В) и КУП-823 (D), клетки обрабатывали свободной от сыворотки среде RPMI-1640, или средой, содержащей 100 нг /мл рекомбинантного белка S100A9. Фотографии были захвачены перевернутой фазового контрастного микроскопа при 0 ч, 24 ч и 48 ч после ранения. были проведены три независимых эксперимента. Результаты были представлены в виде средних значений ± S.D. из этих независимых экспериментов. Значение Р
по сравнению с контролем
группы.
Обсуждение
человека рак является хроническим заболеванием, которое берет свое начало из трансформированных клеток, несущих генетический, а также эпигенетических изменений. Тем не менее, рак не состоит только из раковых клеток. раковой ткани содержит другие типы клеток, включая фибробласты и эпителиальные клетки, клетки иммунной системы и клеток, образующих кровеносные сосуды и лимфатических сосудов [27]. В этом сложном опухолевого микроокружения, медиаторы воспаления регулируют различные стадии развития опухоли, включая инициирование, продвижение, инвазию и метастазирование [28].
S100A9, член семейства S100, изобилует гранулоцитов, моноцитов и активированных кератиноцитов во время различных воспалительные состояния. В этом исследовании мы обнаружили, что S100A9 был специально расположен в воспалительных клеток, проникающих желудка тканей рака и хронических гастритов тканей, в то время как все раковые клетки желудка или соседние клетки слизистой оболочки желудка не выражали S100A9. Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями, демонстрируя высокий уровень экспрессии S100A9 в инфильтрации иммунных клеток в различных типах рака, включая рак толстой кишки [21] и раком поджелудочной железы [29]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Выявление изменений метилирования ДНК, связанных с человеческим желудочным cancer
• Характеристика человека карциномы желудка, связанных с метилирования 9 микроРНК CpG островов и подавления их в…