La presencia de células inflamatorias S100A9 positivo en tejidos de cáncer se correlaciona con un cáncer en etapa temprana y un mejor pronóstico en pacientes con cáncer gástrico

La presencia de células inflamatorias S100A9-positivas en tejidos de cáncer se correlaciona con un cáncer en etapa temprana y un mejor pronóstico en pacientes con cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

S100A9 fue descubierto originalmente como un factor secretado por las células inflamatorias. Recientemente, S100A9 se encuentra asociado con varias enfermedades malignas humanas. El propósito de este estudio es investigar la expresión de S100A9 en el cáncer gástrico y explorar su papel en la progresión del cáncer.
Métodos
expresión S100A9 en muestras de tejido gástrico de 177 pacientes con cáncer gástrico se evaluó mediante técnicas de inmunohistoquímica. La expresión de su socio de dimerización S100A8 y el heterodímero S100A8 /A9 también se evaluaron por el mismo método. A continuación, se investigó el efecto de S100A9 exógeno sobre la motilidad de células de cáncer gástrico AGS y BGC-823.
Resultados
S100A9 se expresó específicamente por las células inflamatorias tales como macrófagos y neutrófilos en los tejidos de cáncer gástrico y gastritis humanos. El análisis estadístico mostró que un número alto de S100A9 células (> = 200) por ampliación 200x campo microscópico en tejidos de cáncer fue predictivo de cáncer gástrico en la etapa temprana. Alto número de células positivas S100A9 se correlacionó negativamente con metástasis en los ganglios linfáticos (P = 0,009
) y la invasión tumoral (p = 0,011
). S100A9 fue identificado como un factor de predicción de pronóstico independiente de la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico (P
= 0,04). Los pacientes con recuentos de células de alta S100A9 estaban con pronóstico favorable (P = 0,021
). La investigación adicional reveló que la distribución de S100A8 en tejidos de cáncer gástrico humano fue similar a S100A9. Sin embargo, el número de células S100A8-positivo no se correlacionó positivamente con la supervivencia del paciente. Las células inflamatorias que infiltran el cáncer eran S100A8 /A9 negativo, mientras que los de gastritis fueron positivos. Por otra parte, la proteína S100A9 exógeno migración y la invasión de células de cáncer gástrico inhibidas.
Conclusiones Nuestros resultados sugieren
células inflamatorias S100A9-positivas en los tejidos de cáncer gástrico se asocian con la etapa temprana de cáncer gástrico y de buen pronóstico.
Palabras clave
El cáncer gástrico S100A9 células inflamatorias La estadificación del tumor Supervivencia Antecedentes
El cáncer gástrico es una de las principales causas de mortalidad por cáncer en todo el mundo. se estima un total de 989,600 nuevos casos de cáncer de estómago y 738.000 muertes que se han producido en 2008, y más del 70% de los nuevos casos y muertes se producen en países en desarrollo como China [1]. El cáncer gástrico se detecta habitualmente en etapas avanzadas, cuando los resultados de pronóstico son pobres. Casi el 70-80% de los pacientes tienen afectación de los ganglios linfáticos regionales que tiene una profunda influencia en la supervivencia [2, 3]. Por lo tanto, el descubrimiento de nuevos biomarcadores ayudar en la detección temprana y la predicción precisa del comportamiento del tumor podría mejorar la supervivencia de los pacientes [4-6].
Miembros de la familia de las proteínas S100 están surgiendo como biomarcadores en múltiples tipos de tumores [7]. El miembro de la familia S100 S100A9 es una proteína de 13 kD que contiene motivos estructurales conservados que consta de dos manos EF-Ca 2 + dominios de unión a. Después de la unión de calcio, S100A9 interactúa con otro miembro de la familia S100 S100A8 para formar el heterodímero funcional llamado calprotectina [8, 9]. S100A9 se identificó originalmente como un factor secretado por células inflamatorias tales como neutrófilos y macrófagos en la artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, y otras enfermedades inflamatorias [10-14]. S100A9, S100A8, así como la calprotectina heterodímero S100A8 /A9, se sobreexpresa durante la inflamación inducida por la carcinogénesis [15]. S100A9 expresión es regulada hasta en las células tumorales en el pulmón [16], de próstata [17], y el cáncer de mama [18, 19], mientras que se ha reducido regulado en las células de cáncer de esófago humanos [20]. En muestras de tejido de cáncer colorrectal, sin embargo, la proteína S100A9 no se detectó en las células cancerosas, sino más bien en las células inflamatorias dispersas en el estroma del tumor [21]. Además, S100A9 fue significativamente mayor en las muestras de heces de pacientes con cáncer colorrectal que en los controles [22]. En el cáncer gástrico, la expresión génica y el análisis proteómico demostraron la alta expresión de S100A9 en el tejido. [23, 24]. Sin embargo, su distribución dentro del tejido y la asociación con características clínico no fueron demostrados plenamente.
En este estudio, hemos utilizado el análisis de la expresión génica para comparar la expresión S100A9 en tejidos de cáncer gástrico y en los tejidos adyacentes, aparentemente normales. La tinción inmunohistoquímica reveló S100A9 en las células inflamatorias asociadas a tumores. Además, hemos abordado la correlación entre el número de células S100A9-positivas en los tejidos tumorales y las características clinicopatológicas. También abordamos la co-localización de S100A9 y S100A8, así como la localización de la calprotectina dímero por inmunofluorescencia. Por último, para comprender mejor la función de S100A9 en las células cancerosas, se investigó el efecto de la proteína S100A9 recombinante sobre la migración y la invasión de células de cáncer gástrico AGS y BGC-823.
Métodos
Pacientes y muestras de tejido
Esta investigación se llevó a cabo después de la aprobación por el Comité de Ética del hospital de cáncer de la Universidad de Pekín. El consentimiento informado se obtuvo de cada paciente. Se estudiaron ciento setenta y seis pacientes con cáncer gástrico. 124 hombres y 53 mujeres (edad media, 57 años; rango, 26-80 años) fueron diagnosticados y tratados quirúrgicamente en el Hospital del Cáncer de la Universidad de Pekín entre 1998 y 2004. La profundidad de la invasión tumoral, el grado histológico, metástasis en los ganglios linfáticos, metástasis hepáticas, y la invasión vascular se obtuvieron de los informes clínicos e histopatológicos. Etapa del cáncer gástrico se clasificó de acuerdo a la clasificación 7ª edición de tumores linfáticos metástasis (TNM), recomendado por el Comité Conjunto sobre el Cáncer. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o terapia de radiación antes de la cirugía. Todos los pacientes fueron seguidos hasta enero de 2010. Después de la gastrectomía, una parte de la pieza resecada se fijó en formalina al 10% y se procesa de forma rutinaria para la evaluación patológica, y la otra fue instantánea congelada en nitrógeno líquido almacenado a -80 ° C para la extracción de RNA. Además, 30 ganglios linfáticos metastásicos emparejados, también se recogieron a partir de estos pacientes. Diez casos de tejidos apendicitis crónica con exacerbación fueron proporcionados por el Departamento de Cirugía General, el Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao Medical College.
Inmunohistoquímica (IHC)
secciones de cuatro micrómetros de parafina de tejidos fijados con formol se montaron en poli-L-lisina-revestido diapositivas y luego desparafinaron en xileno y se rehidrata a través de alcohol a agua destilada. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la cocción las diapositivas de 10 mmol /L EDTA (pH 8,0) durante 3 minutos la presión, las secciones se incubaron con suero de cabra al 5%, luego se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpo de ratón anti-S100A9 (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Suiza), o anticuerpo anti-S100A8 ratón (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), o anticuerpo anti-S100A8 /A9 de ratón (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Los anticuerpos primarios se detectaron usando un sistema EnVision de dos pasos (Dako, Glostrup, Dinamarca). peroxidasa de rábano picante y clorhidrato de diaminobenzedene (DAB) eran enzima y cromógeno emplean. La expresión de S100A9, S100A8 y S100A8 /A9 también se detectaron en Cybrdi microarrays diapositivas de tejidos (IC00-01-001, Cybrdi, Xian, China) que contiene la gastritis crónica con metaplasia (57 casos) y los tejidos de carcinoma gástrico (23 casos). Diez casos de especímenes de apendicitis crónica con exacerbación sirvieron como control positivo de S100A8 /A9.
Evaluación IHC y de corte definición
S100A9 y S100A8 se tiñeron en las células inflamatorias como los macrófagos y neutrófilos que infiltran los tejidos tumorales. Las células positivas mostraron un grado variable de tinción citoplasmática. Las imágenes fueron adquiridas mediante Ariol sistema de análisis de imágenes (Applied Imaging, San Jose, CA, EE.UU.). El escáner se basa en un microscopio Olympus BX61 con una motorizados capacidades de la etapa y de enfoque automático equipado con una cámara. Las láminas fueron escaneados a 200 × magnificación. El grado de S100A9 monoclonal o reactividad de anticuerpos S100A8 en cada sección de tejido se evaluó contando el número de células inflamatorias de colores en tres 200 × ámbitos de aumento. Esto se llevó a cabo por dos patólogos independientes con la ayuda de un sistema de microscopio automático y el software de procesamiento de imágenes (ver archivo adicional 1: Figura S1). el valor de corte de S100A9 manchado células inflamatorias para la predicción del estadio patológico del paciente fue determinada por la curva característica de funcionamiento del receptor (ROC). confocal de barrido láser

Para investigar la co-localización de S100A9 y S100A8 su socio de dimerización, o el heterodímero S100A8 /A9, las diapositivas de microarrays de tejido Cybrdi (IC00-01-001) se incubaron 1,5 horas a temperatura ambiente con anticuerpo anti-S100A9 ratón (1: 200) pre-marcado con el Kit de Zenon Alexa Fluor 647 de ratón IgG etiquetado (Z-25008, fluorescencia roja), y, o bien el anticuerpo anti-S100A8 (1: 200) o anti-S100A8 anticuerpo /A9 (1: 200) pre-etiquetados con el Zenon Alexa Fluor 488 de ratón IgG Labeling Kit (Z-25002 , fluorescencia verde). Confocal imágenes fueron adquiridas mediante el Leica TCS SP5 microscopio confocal (Leica, Mannheim, Alemania). . Además, los núcleos contrastados con DAPI (Vector, Burlingame, CA, EE.UU.), excitación a 358 nm
Las muestras de tejidos de apendicitis crónica con exacerbación se incubaron con anticuerpo anti-S100A9 (1: 200, fluorescencia roja de etiqueta), y anti-S100A8 /A9 anticuerpo. (1: 200, fluorescencia verde etiquetado) como un control positivo para la expresión específica heterodímero S100A8 /A9 cultura y la célula
Ambas líneas celulares en este estudio fueron previamente perfilado por el análisis de microarrays y fueron verificados periódicamente utilizando el análisis de STR (short tandem repeat huella de ADN) [25]. línea celular de cáncer gástrico AGS se obtuvo de la ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), y la línea celular BGC-823 se estableció en China y obtuvo del Instituto de Investigación de la célula, Shanghai, China. Las células cancerosas se cultivaron rutinariamente como una monocapa en medio RPMI-1640 (GIBCO BRL, Carlsbad, CA), suplementado con 10% (v /v) de suero de ternera fetal (FCS, GIBCO) y antibióticos a 37 ° C en un 5% humidificado CO 2 atmósfera.
ensayo de invasión celular
CytoSelect 24 Bueno celular kit de ensayo de invasión se adquirió de la célula Biolabs, EE.UU.. proteína recombinante S100A9 se adquirió de BMA Biomedicals, Suiza. ensayos de la invasión de células se realizaron con Transwell inserciones, que permite que las células migran a través de un tamaño de poro de membrana de policarbonato 8 micras. La superficie superior de la membrana de inserción se revistió con una capa uniforme de solución de matriz de la membrana basal se seca. Las células se volvieron a suspender en medio libre de suero se sembraron en la cámara superior de cada Transwell a una densidad de 10 6 células /ml (200μL /cámara). proteína recombinante S100A9 se añadió al medio de cámara superior a los 0, 10, 20, 50, o 100 ng /ml. La cámara inferior se llenó con medio de 500μL que contiene 10% de FCS. Las células fueron autorizados a emigrar durante 48 horas a 37 ° C. Las células que permanecieron en la cámara superior se retiraron con un hisopo de algodón, y las células que habían penetrado en el lado inferior de la membrana se tiñeron en Cell solución de tinción durante 15 minutos, y se contaron en nueve campos microscópicos seleccionados al azar (200 ×) por pocillo . A continuación, cada inserto se transfirió a un pocillo vacío y se incubó en 200μL de solución de extracción. Después de 10 minutos, 100 pl de solución de cada muestra se transfirió a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se midió en un lector de placas a OD560nm.
Ensayo de migración celular
la movilidad de las células se evaluó a través de una herida de ensayo de curación. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de seis pocillos y se cultivaron hasta la confluencia para obtener una monocapa de células, que luego fue herido utilizando puntas estériles 200 l de pipeta. Cualquier residuo celular se eliminó por lavado con PBS. A continuación, la monocapa de células heridos se incubó en medio con 100 ng de proteína /ml S100A9 recombinante. Las células de control se trataron con medio RPMI-1640 sin suero. imágenes con lapso de tiempo fueron capturados utilizando un microscopio de contraste de fase invertida a 200 × magnificación de 0, 24 y 48 h. La capacidad de la migración celular se evaluó mediante el cálculo de la distancia media de migración celular.
El análisis estadístico
las variables clinicopatológicas se extrajeron de los informes clínicos e histopatológicos. Las curvas ROC se utilizaron para determinar el valor de corte del conteo de células inflamatorias S100A9-positivo en la evaluación estadio TNM patológico. La asociación de recuento de células inflamatorias S100A9-positiva con diferentes estadios TNM se realizó con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Para obtener las asociaciones entre S100A9 o S100A8 recuento de células y las variables clínico-patológicas, los datos eran tabulación cruzada y una χ
2 se llevó a cabo la prueba. La supervivencia acumulada se estimó con el método de Kaplan-Meier y las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de log-rank. La supervivencia global se mide a partir de la fecha de la cirugía inicial hasta la fecha de la muerte, contando muerte por cualquier causa como el punto final, o la última fecha de la información como el punto final si ningún caso se documentó. Un análisis multivariante del modelo de riesgos proporcionales de regresión de Cox (hacia atrás, pasos) fue creado para evaluar la influencia de cada variable en la supervivencia. La significación se fijó en P Hotel < .
0.05 Resultados
expresión de S100A9 en la infiltración de células inflamatorias en el cáncer gástrico y los tejidos gastritis crónica
En un anterior análisis conjunto de genes, hemos encontrado que los tejidos de cáncer gástrico se distinguieron de mucosa no canceroso adyacente por diferencias características en su los patrones de expresión de genes [26]. La diversidad de patrones de expresión de genes puede reflejar la variación en las propiedades intrínsecas de las células tumorales y normales, así como la variación en la composición celular de estos tejidos complejos. Dentro de estos genes, la expresión de S100A9 en tejidos de cáncer gástrico fue mayor que la de la mucosa no canceroso adyacente emparejado (P = 0,00241
, Figura 1A). Figura 1 La expresión de S100A9 en el cáncer gástrico y los tejidos no cancerosos adyacentes. (A) diverso valor de la expresión de S100A9 en 72 tejidos de cáncer gástrico y vinculado no tejidos cancerosos mediante el análisis de los datos de Illumina Sentrix BeadChip cDNA microarrays. (B-E) La tinción inmunohistoquímica de S100A9 en tejidos de cáncer gástrico (B) los ganglios linfáticos metastáticos (C), la gastritis crónica (D), y la mucosa gástrica no canceroso adyacente (E). S100A9 localización se reveló como loci granulado marrón o rojo en el citoplasma de la infiltración de células inflamatorias, especialmente en los fagocitos mononucleares y granulocitos neutrófilos. (Magnificación 200 x).
La inmunohistoquímica de muestras de 177 pacientes con cáncer gástrico mostró que S100A9 fue positivo en todos los tejidos de cáncer primarios con inmunoticción situado exclusivamente en las células inflamatorias tales como macrófagos y neutrófilos que infiltran los tejidos tumorales primarios (Los diferentes tipos de células en el tejido las muestras fueron identificadas por dos patólogos independientes) (Figura 1B). Todos los ganglios linfáticos metastásicos examinadas (n = 30) también fueron positivos para S100A9 con inmunoticción situado exclusivamente en las células inflamatorias que rodean a los tejidos de cáncer metastásico (Figura 1C). En mucosa no canceroso adyacente, S100A9 se expresó en células inflamatorias infiltrantes gastritis. mucosa gástrica tenía la expresión S100A9 negativa o muy débil (Figura 1 D, E).
recuento de células inflamatorias S100A9 positivo en tejidos de cáncer se asocia con la etapa del cáncer y la supervivencia del paciente
Para evaluar el grado de expresión de S100A9 en cáncer-gástrico medio ambiente asociados, se midió el número de células inflamatorias S100A9-positivas de cada tejido tumoral promediando los recuentos de células de tres campos (ampliación original, 200 aumentos) en la zona con el mayor número de células positivas en el sitio de la más profunda invasión tumoral. Correlación entre el recuento celular y los parámetros clínico-patológicos y supervivencia de los pacientes se analizaron mediante la prueba de Wilcoxon de suma de rangos y el método de Kaplan-Meier. Como se muestra en la Figura 2A, la disminución gradual del número de células inflamatorias S100A9 positivo en tejidos de cáncer se asoció con el aumento del estadio patológico del tumor de I a IV (prueba de Wilcoxon de suma de rangos de 4 etapas, P = 0,0265
). Figura 2 Alta S100A9 recuento de células en el tejido canceroso indica un mejor resultado en los pacientes con cáncer gástrico. (A) Diagrama de dispersión del recuento de células inflamatorias S100A9 positivo en cada estadio TNM patológico. La línea azul indica el nivel de 200. (B) de la curva ROC del recuento de células S100A9 para la predicción del estadio TNM patológico. Flecha indica el punto de corte alrededor de 200. (C) Análisis de Kaplan-Meier de supervivencia global para cada estadio TNM patológico. (D) El análisis de Kaplan-Meier de supervivencia global para alta recuento de células S100A9 (≥ 200) del grupo y bajo recuento de células S100A9 (< 200) del grupo. (Sólo 176 pacientes fueron incluidos en el análisis de un paciente perdió durante el seguimiento).
A continuación, hemos probado el poder de predicción de la cantidad de elementos de S100A9 estadio tumoral en el cáncer gástrico. Basado en el estadio TNM, los pacientes fueron divididos en dos grupos, el grupo menos avanzado (estadio I + II) y el grupo de avanzada (etapa III + IV). El área bajo la curva (AUC) obtenido a partir de la curvas ROC (ROC) utilizando las células inflamatorias S100A9 positivo recuento fue 0,623 para estadios TNM patológicos. El valor de corte fue de 198,5 (utilizamos 200 en el siguiente análisis) por 200 campo × magnificación con sensibilidad 64,3% y 61,9% de especificidad para la predicción de la etapa del tumor (Figura 2B). línea de corte de 200 se puede utilizar para separar el grupo menos avanzada del grupo avanzado. La diferencia fue significativa entre los dos grupos (prueba de Wilcoxon de suma de rangos para los dos grupos, P = 0,017
, Figura 2A).
Desde el análisis de supervivencia mostró significativamente diferente pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico en diferentes etapas del cáncer (Figura 2C) , hemos analizado la relación entre las células inflamatorias S100A9 positivo contar y la tasa de supervivencia de los pacientes. Los pacientes fueron estratificados según el valor de corte de alta en el recuento de células S100A9 (≥ 200) del grupo y bajo recuento de células S100A9; grupo (<200). tasa de supervivencia a los 5 años fue del 44,6% en el grupo de alto conteo de células frente a un 22,5% en el grupo de bajo recuento de células (P = 0,021
, Figura 2D). tiempo medio de supervivencia fue de 35,1 ± 10,8 meses en el grupo de alto recuento de células y 20,3 ± 3,0 meses para el grupo de bajo recuento de células, respectivamente. En conjunto, el recuento de células inflamatorias S100A9-positivas en el tejido de cáncer gástrico se puede utilizar como un predictor de distinguir etapa temprana y cáncer gástrico avanzado con el punto de corte de 200 células positivas /HPF. La presencia de células inflamatorias S100A9-positivas en tejidos de cáncer se correlaciona con un mejor pronóstico en pacientes con cáncer gástrico.
Bajo número de células inflamatorias S100A9-positivos en los tejidos de cáncer se correlaciona positivamente con características clínico-patológicas se encontró pobres
bajo recuento de células S100A9 que se correlaciona con la profundidad de invasión tumoral (estadio T), metástasis a los ganglios linfáticos (estadio N), y el estadio TNM clínica (P = 0,011
, 0,009 y 0,002, respectivamente). Correlación entre el recuento de células S100A9 y otras características clínicas tales como el sexo, edad, localización del tumor, metástasis hepática (fase M), la invasión vascular y la diferenciación no fueron estadísticamente significativas (todos p Hotel > 0,05) (Tabla 1). Además, el análisis multivariado demostró el estadio N (P = 0,006
), metástasis hepáticas (P = 0,000
), y el recuento de células S100A9 (P = 0,046
) eran factores independientes en la predicción de la supervivencia global (Tabla 2 ) .Tabla 1 Asociación de S100A9 positivo recuento de células inflamatorias en los tejidos de cáncer con parámetros clínico en pacientes con cáncer gástrico
variables
bajo S100A9 (células positivas < 200) guía empresas de alta S100A9 ( células positivas > = 200)
P valor
La
Sexo Masculino 0.125

74
50
Mujer
25
28
Edad
0,089 Hotel < 50
32
18
50-59
24 página 12
60-69
33
33 Hotel > = 70
10
15
Localización del tumor
0,271
Cardia
26
15
no cardias
73
63 Profundidad de
la invasión tumoral **
0,011
T1 página 3
2 T2 página 7 página 19
T3
69
42
T4
20
15
metástasis de ganglios linfáticos
0,009
N0 página 13
23
N1
32
30
N2
32
17
N3
22 página 8
hígado metástasis
0,571
negativo
89
68
positiva
10
10
el estadio TNM
0,002
І página 3 página 12
II
37
35
III
50
21
IV página 9
10
La invasión vascular
0.742
negativo
38
31
positiva
58
43
No se ha grabado * página 3
4
Diferenciación **
0.472
Bueno
2 4 +
Moderadamente mal
82
66
Otros tipos página 13 página 6
No determinada página 2
2 * datos incompletos.
** prueba exacta de Fisher.
Tabla 2 análisis multivariado de factores pronósticos de la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico
Variaciones
P
RR
IC (95%) guía empresas Sexo
0.671 1.106

0,694-1,765
Hombre contra mujer
Edad
0.179 1.148

0,938-1,405 Hotel < 50
50-59 60-69
Hotel > = 70
Localización del tumor
0,545 0,864

0,538-1,387
Cardia vs.
no cardias
Diferenciación
0,301 0,751

0.437- 1.292
bien frente moderadamente + mal
metástasis de ganglios linfáticos
0.006 1.841

1,196-2,835
N0 N1 + N2 + N3 frente
profundidad de la invasión tumoral
0,1
1.756
0,897-3,435
T1 + T2 + T3 T4 frente
metástasis de hígado
0
3.461
2,002-5,983
negativo positivo frente
invasión vascular
0,107 1,452

0,922-2,285
negativo positivo frente
células inflamatorias S100A9 positivo recuento
0,046 0,643

0,417 a 0,991 Hotel < 200 frente > = 200
RR: riesgo relativo; CI:. Intervalo de confianza Francia El estado de expresión de S100A8 y el heterodímero S100A8 /A9 en tejidos de cáncer gástrico y los tejidos gastritis
gastritis crónica es una lesión gástrica crónica, patológicamente caracterizado por la inflamación crónica no específica de la mucosa gástrica. Las células inflamatorias en la gastritis crónica son morfológicamente similares a los infiltrar los tejidos de cáncer gástrico primario. En algunos casos, la gastritis crónica puede incluso conducir al cáncer de estómago. A continuación, examinó además la expresión de S100A8, un miembro cercano de la familia de S100A9 y la forma heterodimerización S100A8 /A9 en ambos tejidos con cáncer gástrico y gastritis crónica tejidos no tumorales adyacentes en las muestras de cáncer gástrico mediante la realización de técnicas de inmunohistoquímica. De manera similar al patrón de S100A9, S100A8 se expresa exclusivamente en células inflamatorias infiltrantes ambos tejidos tumorales y tejidos gastritis adyacentes. . S100A8 no se expresa en todas las células de cáncer gástrico y la mucosa gástrica normal
A continuación, se cuantificó el número de células inflamatorias S100A8-positiva en cada tejido del tumor como se describió anteriormente para S100A9 (archivo adicional 1: Figura S1). Sorprendentemente, el recuento de células S100A8 en tejidos de cáncer gástrico no se correlacionó con la mayoría de las características clinicopatológicas (archivo adicional 2: Tabla S1) o la supervivencia del paciente (archivo adicional 3: Figura S2). Además, la expresión de la forma heterodimerización S100A8 /A9 no se detectó en las células inflamatorias que infiltran los tejidos de cáncer gástrico, mientras que se identificaron algunas células S100A8 /A9 positivos en los tejidos gastritis crónica (datos no mostrados). Estos datos indican que la distribución de S100A9, S100A8 y S100A8 /A9 podría ser diferente en el cáncer gástrico humano y los tejidos gastritis crónica.
Para confirmar esta hipótesis, se investigó el patrón de localización subcelular de S100A9, S100A8 y S100A8 /A9 heterodímero expresión mediante la realización de tinción immunofluorecence en un microarray de tejido incluyendo 23 casos de cáncer gástrico y 57 casos de gastritis crónica. En los tejidos de cáncer gástrico, tanto las proteínas S100A8 y S100A9 se detectaron en las células inflamatorias infiltrantes de tumor (Figura 3 A, B), mientras que no heterodímero S100A8 /A9 se encontró en todos los casos (Figura 3G). La expresión de S100A8 y S100A9 se superponen en parte en el citoplasma de las células (Figura 3D, E). Además, se detectaron proteínas S100A9 y S100A8 en las células inflamatorias en gastritis crónica (Figura 3K, L). La distribución de estas dos proteínas también se superponen parcialmente (Figura 3N, O). En consonancia con los resultados de la inmunohistoquímica, S100A8 /A9 no se expresa en las células de los tejidos de cáncer gástrico (Figura 3G), mientras que la expresión de S100A8 /A9 en parte se superponen con la S100A9 en las células inflamatorias de los tejidos gastritis (Figura 3T, S, T) . Como era de esperar, la expresión y distribución de S100A8 /A9 en los tejidos de apendicitis crónica con exacerbación (el control positivo) eran muy parecidos a los tejidos en gastritis crónica (Figura 3U, V, X, Y). Tomados en conjunto, la expresión diferencial y la localización subcelular de S100A9, S100A8 y S100A8 /A9 en diversos tejidos pueden implicar a sus diferentes funciones en el cáncer gástrico o el medio ambiente gastritis crónica. Figura 3 imágenes de inmunofluorescencia de S100A9, S100A8 y S100A8 proteínas /A9 en tejido diapositivas de microarrays que contienen tejidos de cáncer gástrico (A-J) y tejidos gastritis crónica (K-T), y tejidos de apendicitis crónica con exacerbación (T-Y). S100A9 y S100A8 se detectaron por el anticuerpo monoclonal, premarcan con el Zenon Alexa Fluor ratón IgG Labeling Kit (con fluorescencia verde y rojo, respectivamente). El núcleo fue positivo con DAPI. heterodímeros S100A8 /A9 fueron detectables mediante el anticuerpo 27E10-dímero específico de BMA Biomedicals premarcan con fluorescencia verde. La co-localización de S100A9 y S100A8 o S100A8 /A9 se mostró en imágenes fusionadas (D, I, N, S, X) y las grandes imágenes fusionadas (E, J, O, T, Y). La flecha blanca en 3 T muestra co-localización de S100A9 y S100A8 /A9 en gastritis crónica. longitud de la barra, de 50 micras.
El efecto inhibidor de la proteína recombinante S100A9 sobre la migración y la invasión de líneas celulares de cáncer gástrico in vitro
La proteína S100A9 se expresa en y secretados por las células inflamatorias, que actúa como mediador en aguda y inflamación crónica. Puesto que el recuento de células inflamatorias S100A9-positiva correlacionada con características clinicopatológicas menos agresivos, hemos probado aún más la función inhibitoria directa de S100A9 recombinante en la migración y la invasión de células de cáncer gástrico. Para evaluar la capacidad invasiva de las células de cáncer gástrico, se utilizó transwell ensayos. Dos líneas celulares de cáncer gástrico, AGS y BGC-823, se trataron con medio o medio libre de suero que contenía diferentes concentraciones de la proteína S100A9 recombinante (10, 20, 50 y 100 ng /ml, respectivamente). células invasoras se contaron en nueve seleccionados al azar campos microscópicos (200 ×). Los resultados mostraron que la proteína recombinante S100A9 inhibió ligeramente la invasión de células AGS (Figura 4A), mientras que S100A9, inhibió BGC-823 invasión de una manera dependiente de la concentración (P
< 0,05, Figura 4C). Para analizar la capacidad de migración de células de cáncer gástrico, se realizó el ensayo de curación de la herida. Ambas líneas celulares se trataron con medio o medio libre de suero que contenía 100 ng /ml de proteína recombinante S100A9. Los resultados mostraron que S100A9 ligeramente inhibido la migración de células AGS (Figura 4B), mientras que las distancias de migración de células de BGC-823 células tratadas con S100A9 después de 24 h y 48 h de incubación fueron significativamente inferiores a los de control (P
< 0,05, Figura 4D). Figura 4 Efecto de la proteína recombinante S100A9 en la invasión y migración de las líneas celulares de cáncer gástrico. En transwell ensayo, las células AGS (A) y BGC-823 (C) se trataron con medio o medio libre de suero que contiene 10, 20, 50 o 100 ng /ml de proteína recombinante S100A9. Las células invasoras se contaron en aleatoriamente seleccionados de nueve campos microscópicos (200 ×). En ensayo de curación de la herida, las células AGS (B) y BGC-823 (D) se trataron con medio RPMI-1640 sin suero o medio que contiene 100 ng /ml de proteína recombinante S100A9. Las fotografías fueron capturadas por un microscopio de contraste de fase invertida a 0 h, 24 hy 48 h después de la herida. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Los resultados se presentan como medias ± S. D. de estos experimentos independientes. P
valor vs grupo
control.
Discusión
cáncer humano es una enfermedad crónica que se origina a partir de células transformadas que albergaban genética, así como las alteraciones epigenéticas. Sin embargo, el cáncer no se compone solamente de las células cancerosas. El tejido canceroso contiene otros tipos de células, incluyendo fibroblastos y células epiteliales, células del sistema inmune, y las células que forman los vasos sanguíneos y vasos linfáticos [27]. En este microambiente tumoral complejo, mediadores de la inflamación regulan diferentes etapas del desarrollo del tumor, incluyendo la iniciación, promoción, invasión y metástasis [28].
S100A9, un miembro de la familia S100, es abundante en granulocitos, monocitos y queratinocitos activados durante varios condiciones inflamatorias. En este estudio, se encontró que S100A9 se encuentra específicamente en las células inflamatorias que infiltran los tejidos de cáncer gástrico y los tejidos gastritis crónica, mientras que todas las células de cáncer gástrico o de las células adyacentes de la mucosa gástrica no expresaron S100A9. Nuestros resultados concuerdan con estudios previos que demuestran la alta expresión de S100A9 en la infiltración de células inmunes en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer colorrectal [21] y el cáncer de páncreas [29]. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

• Identificación de cambios en la metilación de ADN asociadas con la identificación cancer
• Caracterización de metilación relacionados con carcinoma gástrico humano de 9 islas CpG MIR y la represión de sus expresiones in vitro e in vivo