Jelenléte S100A9-pozitív gyulladásos sejtek rákos szövetekben korrelál a korai szakaszban a rák és egy jobb prognózis betegeknél gyomorrák

Jelenléte S100A9-pozitív gyulladásos sejtek rákos szövetekben korrelál a korai szakaszban a rák és egy jobb prognózis betegeknél gyomorrákos
Abstract
alapon
S100A9 eredetileg felfedezett mint tényező által szekretált gyulladásos sejtek. Nemrégiben az S100A9 azt találtuk, hogy kapcsolatos számos emberi rosszindulatú betegségben. A tanulmány célja az, hogy megvizsgálja S100A9 kifejezés a gyomorrák és fedezze fel a szerepe daganatos progresszió. Katalógusa módszerek katalógusa S100A9 kifejezés a gyomor szövetminta 177 gyomorrákos betegek értékelték immunhisztokémiai. A kifejezés a dimerizáció partner S100A8 és S100A8 /A9 heterodimer is értékelték ugyanazzal a módszerrel. A hatás exogén S100A9 a motilitás a gyomor rákos sejtek AGS és BGC-823 ezután vizsgáltuk.
Eredménye
S100A9 specifikusan által kifejezett gyulladásos sejtek, például a makrofágok és neutrofilek humán gyomorrák és gyomorhurut szövetekben. Statisztikai elemzés kimutatta, hogy a magas S100A9 sejtszám (> = 200) per 200x nagyítású mikroszkóp látóterében a rákos szövetekben volt prediktív korai szakaszában gyomorrák. Nagy S100A9-pozitív sejtszám negatívan korrelált a nyirokcsomó-metasztázis (P = 0,009 katalógusa) és a tumor invázió (P = 0,011 katalógusa). S100A9 azonosították független prognosztikai előrejelzője teljes túlélése gyomorrákos betegeknél (P katalógusa = 0,04). A betegek nagy S100A9 sejtszám voltak kedvező prognózist (P katalógusa = 0,021). A további vizsgálat megállapította, hogy az S100A8 eloszlása ​​humán gyomorrák szövetekben hasonló volt S100A9. Azonban a több S100A8-pozitív sejtek nem pozitívan korrelál a beteg túlélését. A gyulladásos sejtek infiltráló rákos volt S100A8 /A9 negatív, míg a gyomorhurut pozitív volt. Továbbá exogén S100A9 protein gátolja migrációs és behatolás gyomorrák sejtek. Katalógusa Következtetések katalógusa Eredményeink azt mutatják, S100A9-pozitív gyulladásos sejtek gyomorrák szöveteket összefüggésbe a korai szakaszában a gyomorrák és a jó prognózisú. Katalógusa kulcsszavak
a gyomorrák S100A9 gyulladásos sejtek stádium Túlélés Háttér katalógusa gyomorrák az egyik vezető oka a rák okozta halálozás világszerte. Összesen 989.600 új gyomorrák esetek és 738.000 halálesetet becslések szerint 2008-ban bekövetkezett, és több mint 70% -át az új megbetegedések és halálesetek fordulnak elő a fejlődő országokban, mint Kína [1]. A gyomorrák gyakran észlelhető előrehaladott szakaszában, amikor a prognózis kimenetele gyenge. Közel 70-80% A betegek bevonását a regionális nyirokcsomók, amely alapvetően befolyásolja a túlélést [2, 3]. Ezért felfedezés új biomarkerek segítik a korai felismerés és pontos előrejelzésére tumor viselkedés javíthatja a betegek túlélését [4-6]. Katalógusa tagjai S100 proteinek családja kiemelkednek, mint biomarkerek több típusú daganatok [7]. Az S100 családtag S100A9 egy 13kd fehérje, amely konzervált szerkezeti motívum, amely két EF-hand Ca 2 + kötő domének. Miután a kalcium-kötő, az S100A9 kölcsönhatásba lép egy másik S100 családtag S100A8, hogy létrehozzák a funkcionális heterodimer nevezett kalprotektin [8, 9]. S100A9 eredetileg azonosították faktor által szekretált gyulladásos sejtek, például neutrofilok és a makrofágok a rheumatoid arthritis, gyulladásos bélbetegség és más gyulladásos betegségek [10-14]. S100A9, az S100A8, valamint az S100A8 /A9 heterodimer kalprotektin, expresszálódnak a gyulladás során indukált karcinogenezis [15]. S100A9 expresszió fel szabályozott tumorsejtekben a tüdőben [16], a prosztatában [17], és az emlőrák [18, 19], miközben a lefelé szabályozni az emberi nyelőcsőrák sejtek [20]. Kolorektális rákban szövetmintákban, azonban az S100A9 protein nem volt kimutatható a rákos sejtekben, hanem inkább a gyulladásos sejtek szétszóródtak a tumor sztróma [21]. Ezen túlmenően, az S100A9 szignifikánsan magasabb volt széklet mintákban kolorektális rákos betegek, mint a kontrollokban. [22] A gyomorrák, génexpressziós és proteomikai analízis azt mutatta, magas szintű expresszióját S100A9 a szövetben. [23, 24]. Azonban megoszlása ​​a szövetekben és társulási klinikopatológiai jellemzői nem teljesen bizonyított.
Ebben a tanulmányban használtuk génexpresszió elemzés összehasonlítani S100A9 kifejezés gyomorrákban szövetek és a szomszédos, látszólag normális szövetekben. Immunhisztokémiai festéssel kimutattuk S100A9 a tumor-asszociált gyulladásos sejtek. Továbbá, mi foglalkozott a korreláció száma közötti S100A9-pozitív sejtek tumor szövetekben, és a klinikopatológiai jellemzői. Azt is foglalkozott a ko-lokalizációja S100A9 és S100A8 valamint a lokalizáció a dimer kalprotektin immunfluoreszcenciával. Végül, hogy betekintést nyerjünk a funkciója S100A9 a rákos sejtekben vizsgáltuk a hatását a rekombináns fehérje S100A9 a migrációval és invázió gyomorrák sejtek AGS és BGC-823. Katalógusa Módszerek katalógusa Betegek és szövetminták
Ezt a vizsgálatot végeztünk jóváhagyását követően etikai bizottság a pekingi egyetem Cancer Kórház. Beleegyezését adta a minden egyes beteg számára. Száz hetvenhat gyomorrákos betegeknél vizsgálták. 124 férfi és 53 nő (átlagéletkor 57 év; tartomány 26-80 év) diagnosztizált és sebészileg kezelt Peking University Hospital Cancer 1998 és 2004 között a mélység, a tumor invázió szövettani grade, nyirokcsomó áttét, a máj metasztázis, és a vaszkuláris invázió kaptuk klinikai és hisztopatológiai jelentéseket. Szakaszában gyomorrák sorolták szerint a 7. kiadás tumor áttét (TNM) besorolás által ajánlott American Joint Committee on Cancer. Egyik beteg kemoterápiában vagy sugárterápiában műtét előtt. Minden beteget követte ig 2010. január után gastrectomián egyik része reszekált példányt rögzített 10% -os formaiinban és feldolgozott rutinszerűen a patológiai vizsgálat, és egy másik volt lefagyasztottuk folyékony nitrogénben tároltuk -80 ° C-on az RNS kivonása. Ezen túlmenően, 30 párosított metasztatikus nyirokcsomókat is gyűjtöttünk ezeknél a betegeknél. Tíz esetben krónikus vakbélgyulladás szövetek fellángolásával biztosította az Általános Sebészeti Osztály, a kapcsolt kórházi Qingdao University Medical College. Katalógusa immunhisztokémia (IHC) hotelben Négy mikrométer metszetek formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetek voltak szerelve a poli-L-lizinnel bevont csúszdák, majd paraffint xilolban és rehidratált keresztül alkohol desztillált vízzel. Az endogén peroxidáz aktivitást blokkoltuk 3% -os hidrogén-peroxid 15 percen át szobahőmérsékleten keverjük. Ha a nyomás a főzés a lemezeket 10 mmol /l EDTA-t (pH = 8,0), 3 perc, a metszeteket 5% kecske szérummal, majd egy éjszakán át inkubáltuk 4 ° C-egér anti-S100A9 antitesttel (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Svájc), vagy az egér anti-S100A8 antitesttel (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), vagy az egér anti-S100A8 /A9 antitesttel (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Elsődleges ellenanyagokat egy kétlépéses EnVision rendszer (Dako, Glostrup, Dánia). Torma peroxidáz és diaminobenzedene hidroklorid (DAB) volt enzim és kromogén alkalmazott. Kifejeződése S100A9, S100A8 és S100A8 /A9 is kimutattak Cybrdi szöveti microarray diák (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, Kína), amely a krónikus gyomorhurut, metaplasia (57 eset) és a gyomor carcinoma szövetekben (23 eset). Tíz olyan krónikus vakbélgyulladás egyedek súlyosbodását arra szolgált pozitív kontrollként S100A8 /A9.
IHC értékelés és a cut-off meghatározás
S100A9 és S100A8 megfestettük a gyulladásos sejtek, például a makrofágok és neutrofilek infiltráló tumoros szövetekben. Pozitív sejtek mutatott különböző mértékű citoplazmatikus festődés. A képeket a Ariol képelemző rendszer (Applied Imaging, San Jose, CA, USA). A szkenner alapul Olympus BX61 mikroszkóp motorizált színpad és autófókusz ellátott kamera. A metszeteket szkennelt 200 × nagyítással. A mértéke monoklonális S100A9 vagy S100A8 antitest reaktivitás az egyes szövetek szakasz értékelték megszámoljuk a festett gyulladásos sejtek három 200 × nagyítással hatókörét. Ezt végezte két független patológusok segítségével automatikus mikroszkóp rendszer és a képfeldolgozó szoftver (lásd az árucsoport Kiegészítő fájl 1: Ábra S1). Cut-off értéket S100A9 festett gyulladásos sejtek előrejelzésére beteg patológiai stádium határoztuk vevő működési karakterisztika (ROC) görbe. Katalógusa lézer konfokális pásztázó katalógusa Vizsgálni co-lokalizációja S100A9 és dimerizációs partner S100A8, vagy az S100A8 /A9 heterodimert, a Cybrdi szövet mikroarray csúszdák (IC00-01-001) inkubáltunk 1,5 óra hosszat szobahőmérsékleten egér anti-S100A9 antitesttel (1: 200) előre jelzett a Zenon Alexa Fluor 647 egér IgG Labeling Kit (Z-25008, vörös fluoreszcencia), és vagy az anti-S100A8 antitesttel (1: 200), vagy anti-S100A8 /A9 antitesttel (1: 200) előre jelzett a Zenon Alexa Fluor 488 egér IgG Labeling Kit (Z-25002 zöld fluoreszcencia). Konfokális képeket szerezték a Leica TCS SP5 konfokális mikroszkóppal (Leica, Mannheim, Németország). Ezen túlmenően, a sejtmagok ellenfestjük DAPI-t (Vector, Burlingame, CA, USA), gerjesztés 358 nm-en.
Példányaira krónikus vakbélgyulladás szövetek súlyosbodásának inkubáltuk anti-S100A9 antitesttel (1: 200, piros fluoreszcencia jelölt), és anti-S100A8 /A9 antitesttel (1: 200, zöld fluoreszcencia jelölt), mint pozitív kontroll az adott S100A8 /A9 heterodimer kifejezést.
Sejtkultúra
Mindkét sejtvonal ebben a vizsgálatban korábban profilos által microarray elemzés és rendszeresen ellenőrizve STR analízis (short tandem repeat DNS-ujjlenyomat) [25]. A gyomorrák sejtvonal AGS-t az ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), és sejtvonal BGC-823-ben alakult Kínában és nyert Cell Research Institute, Shanghai, Kína. Rák sejteket rutinszerűen nőtt, mint egy egyrétegű RPMI-1640 tápközegben (Gibco BRL, Carlsbad, CA), kiegészítve 10% (v /v) magzati borjúszérumot (FCS, Gibco), és antibiotikumok, 37 ° C-on, nedvesített, 5% CO 2 atmoszférában. katalógusa Cell inváziós vizsgálati katalógusa CytoSelect 24 Well Cell Invasion vizsgálat kit vásárolt a Cell Biolabs, USA. S100A9 rekombináns fehérjét vásárolt BMA Biomedicals, Svájc. Sejtinvázióra vizsgálatokat végeztünk Transwell szúr, amely lehetővé teszi a sejtek vándorlását keresztül egy 8 jim pórusméretű polikarbonát membránszűrőn. A felső felülete a betét membrán bevonjuk egy egységes réteget szárítjuk alapmembrán mátrix megoldás. A sejteket újra szuszpendáljuk szérummentes tápközegben szélesztjük a felső kamrában az egyes Transwell sűrűségben 10 6 sejt /ml (200 pl /kamra). S100A9 rekombináns fehérjét adtunk a felső kamrába közegben, 0, 10, 20, 50, vagy 100 ng /ml. Az alsó kamra tele volt 500

• Azonosítása DNS metiláció változások kapcsolódó emberi gyomor cancer
• Jellemzése humán gyomorkarcinóma kapcsolatos metiláció 9 miR CpG-szigetek és az elnyomás azok kifejezések in vitro és in vivo körülmények között