La presenza di cellule infiammatorie S100A9-positivi nei tessuti tumorali si correla con un cancro della fase iniziale e una migliore prognosi nei pazienti con gastrica cancer

presenza di cellule infiammatorie S100A9-positivi nei tessuti tumorali correla con un cancro della fase iniziale e una migliore prognosi nei pazienti con cancro gastrico
Abstract
sfondo
S100A9 è stato scoperto come un fattore secreto dalle cellule infiammatorie. Recentemente, S100A9 venne trovata essere associata a diversi tumori umani. Lo scopo di questo studio è quello di indagare l'espressione S100A9 nel cancro gastrico ed esplorare il suo ruolo nella progressione del cancro
Metodi
espressione S100A9 in campioni di tessuto gastrico di 177 pazienti affetti da cancro gastrico è stata valutata mediante immunoistochimica.. L'espressione del suo partner dimerizzazione S100A8 e S100A8 eterodimero /A9 sono stati valutati anche con lo stesso metodo. L'effetto di S100A9 esogeno sulla motilità delle cellule tumorali gastriche AGS e BGC-823 è stato poi indagato.
Risultati
S100A9 è stato specificamente espresso dalle cellule infiammatorie come macrofagi e neutrofili nei tessuti tumorali e gastrite gastrico umano. L'analisi statistica ha dimostrato che un elevato numero di cellule S100A9 (> = 200) a 200x ingrandimento campo microscopico nei tessuti tumorali era predittiva di cancro gastrico stadio iniziale. conta delle cellule alta S100A9-positiva è stata negativamente correlata con metastasi linfonodali (P
= 0.009) e l'invasione del tumore (P = 0,011
). S100A9 è stata identificata come un predittore prognostico indipendente di sopravvivenza globale dei pazienti con cancro gastrico (P
= 0.04). I pazienti con conta delle cellule alta S100A9 erano con prognosi favorevole (P = 0,021
). Ulteriori indagini ha scoperto che la distribuzione S100A8 nei tessuti di cancro gastrico umano era simile a S100A9. Tuttavia, il numero di cellule S100A8-positive non correlava positivamente con la sopravvivenza del paziente. Le cellule infiammatorie infiltranti cancro erano S100A8 /A9 negativo, mentre quelli in gastrite sono risultati positivi. Inoltre, esogeno proteine ​​S100A9 inibito la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico.
Conclusioni
I nostri risultati suggeriscono cellule infiammatorie S100A9-positivi nei tessuti di cancro gastrico sono associati con stadio precoce del cancro gastrico e buona prognosi.
Parole chiave
cancro gastrico S100A9 cellule infiammatorie del tumore in scena sopravvivenza Sfondo
cancro gastrico è una delle principali cause di mortalità per cancro in tutto il mondo. Un totale di 989,600 nuovi casi di cancro allo stomaco e 738.000 decessi sono stati stimati che si sono verificati nel 2008, e oltre il 70% dei nuovi casi e dei decessi si verifica nei paesi in via di sviluppo come la Cina [1]. cancro gastrico è comunemente rilevato in fase avanzata, quando i risultati prognostici sono poveri. Quasi il 70-80% dei pazienti presenta coinvolgimento dei linfonodi regionali, che ha una profonda influenza sulla sopravvivenza [2, 3]. Pertanto, la scoperta di nuovi biomarcatori favoreggiamento nella diagnosi precoce e la previsione accurata del comportamento del tumore potrebbe migliorare la sopravvivenza dei pazienti [4-6].
Membri della famiglia di proteine ​​S100 stanno emergendo come biomarcatori in diversi tipi di tumori [7]. Il membro della famiglia S100 S100A9 è una proteina che contiene 13kD motivi strutturali conservati composti da due EF-mano Ca 2 domini + -Binding. Dopo il legame di calcio, S100A9 interagisce con un altro membro della famiglia S100 S100A8 per formare la eterodimero funzionale chiamato calprotectina [8, 9]. S100A9 è stato originariamente identificato come un fattore secreto dalle cellule infiammatorie come neutrofili e macrofagi in artrite reumatoide, malattia infiammatoria intestinale, e di altre malattie infiammatorie [10-14]. S100A9, S100A8, così come l'eterodimero calprotectina S100A8 /A9, sono sovraespressi durante la carcinogenesi infiammazione indotta [15]. espressione S100A9 è up-regolata nelle cellule tumorali del polmone [16], della prostata [17], e il cancro al seno [18, 19], mentre è down-regolata nelle cellule di cancro esofageo umane [20]. In campioni di tessuto cancro colorettale, tuttavia, la proteina S100A9 non è stato rilevato nelle cellule tumorali, ma piuttosto in cellule infiammatorie sparse in tutto il stroma tumorale [21]. Inoltre, S100A9 era significativamente più alta nei campioni di feci di pazienti affetti da cancro del colon-retto rispetto ai controlli [22]. Nel cancro gastrico, l'espressione genica e l'analisi proteomica ha dimostrato elevata espressione di S100A9 nel tessuto. [23, 24]. Tuttavia, la sua distribuzione all'interno del tessuto e l'associazione con le caratteristiche clinico-patologici non sono state pienamente dimostrate.
In questo studio, abbiamo utilizzato l'analisi di espressione genica per confrontare l'espressione S100A9 nei tessuti di cancro gastrico e nei tessuti, apparentemente normali adiacenti. La colorazione immunoistochimica ha rivelato S100A9 in cellule infiammatorie associati al tumore. Inoltre, abbiamo affrontato la correlazione tra il numero di cellule S100A9-positive nei tessuti tumorali e le caratteristiche clinicopatologiche. Abbiamo anche affrontato la co-localizzazione di S100A9 e S100A8, nonché la localizzazione del calprotectina dimero mediante immunofluorescenza. Infine, al fine di conoscere la funzione di S100A9 nelle cellule tumorali, abbiamo studiato l'effetto della proteina ricombinante S100A9 sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali gastriche AGS e BGC-823.
Metodi
Pazienti e campioni di tessuto
Questa indagine è stata eseguita dopo l'approvazione da parte del Comitato Etico dell'Università di Pechino Cancer Hospital. Il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente. Un centinaio di settantasei pazienti con cancro gastrico sono stati studiati. 124 maschi e 53 femmine (età media 57 anni, range 26-80 anni) sono stati diagnosticati e trattati chirurgicamente in Peking University Cancer Hospital tra il 1998 e il 2004. La profondità di invasione del tumore, grado istologico, metastasi linfonodali, metastasi epatiche, e l'invasione vascolare sono stati ottenuti da rapporti clinici ed istopatologici. Fase di cancro gastrico è stato classificato in base alla 7a edizione tumore metastasi linfonodali (TNM) classificazione proposta dal Joint Committee on Cancer. Nessuno dei pazienti ha ricevuto la chemioterapia o la radioterapia preoperatoria. Tutti i pazienti sono stati seguiti fino al gennaio 2010. Dopo gastrectomia, una parte del campione di resezione è stato fissato in formalina al 10% e trattati di routine per la valutazione patologica, e un altro è stato snap-congelato in azoto liquido conservati a -80 ° C per l'estrazione di RNA. Inoltre, 30 abbinati linfonodi metastatici sono stati raccolti anche da questi pazienti. Dieci casi di tessuti appendicite cronica con esacerbazione sono stati forniti dal Dipartimento di Chirurgia Generale, l'ospedale affiliato di Qingdao University Medical College.
Immunoistochimica (IHC)
sezioni Quattro-micrometriche dai tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina sono stati montati on poli-L-lisina rivestite diapositive e poi deparaffinizzati in xilene e reidratate con alcol all'acqua distillata. perossidasi endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo pressione cottura i vetrini in 10 mmol /L EDTA (pH 8,0) per 3 minuti, le sezioni sono state incubate con 5% di siero di capra, poi incubate overnight a 4 ° C con il mouse anticorpo anti-S100A9 (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Svizzera), o il mouse anti-S100A8 anticorpi (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), o il mouse anti-S100A8 /A9 anticorpi (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Gli anticorpi primari sono stati rilevati utilizzando un sistema EnVision due fasi (Dako, Glostrup, Danimarca). Perossidasi di rafano e diaminobenzedene cloridrato (DAB) erano enzima e cromogeno impiegati. Espressione di S100A9, S100A8 e S100A8 /A9 sono state rilevate anche in Cybrdi diapositive tessuto microarray (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, Cina) contenente gastrite cronica con metaplasia (57 casi) e tessuti di carcinoma gastrico (23 casi). Dieci casi di campioni appendicite cronica con esacerbazione sono stati serviti come controllo positivo per S100A8 /A9.
Valutazione IHC e cut-off Definizione di S100A9 e S100A8 erano macchiati nelle cellule infiammatorie quali macrofagi e neutrofili infiltranti tessuti tumorali. cellule positive hanno mostrato un grado variabile di colorazione citoplasmatica. Le immagini sono state acquisite utilizzando Ariol sistema di analisi di immagine (Applied Imaging, San Jose, CA, USA). Lo scanner si basa su un microscopio Olympus BX61 con motorizzati capacità di fase e autofocus dotato di una fotocamera. I vetrini sono stati scansionati a 200 × ingrandimento. Il grado di monoclonale S100A9 o S100A8 reattività anticorpale in ciascuna sezione di tessuto è stata valutata contando il numero di cellule infiammatorie colorati in tre 200 × ambiti ingrandimento. Questa è stata condotta da due patologi indipendenti con l'aiuto di un sistema di microscopio automatico e il software di elaborazione delle immagini (vedi file aggiuntivo 1: Figura S1). valore di cut-off di S100A9 macchiato cellule infiammatorie per la previsione del paziente, stadio patologico è stato determinato dal receiver operating characteristic (ROC) della curva.
laser confocale a scansione
di indagare la co-localizzazione di S100A9 e il suo partner dimerizzazione S100A8, o l'eterodimero S100A8 /A9, i Cybrdi diapositive tessuto microarray (IC00-01-001) sono stati incubati 1,5 ore a temperatura ambiente con il mouse anticorpo anti-S100A9 (1: 200) pre-etichettati con il kit Zenon Alexa Fluor 647 mouse IgG Labeling (Z-25008, fluorescenza rossa), e sia l'anticorpo anti-S100A8 (1: 200) o S100A8 anti-anticorpo /A9 (1: 200) pre-etichettati con il Zenon Alexa Fluor 488 mouse IgG Labeling Kit (Z-25002 , fluorescenza verde). immagini confocali sono state acquisite utilizzando la Leica TCS SP5 microscopio confocale (Leica, Mannheim, Germania). . Inoltre, i nuclei di contrasto con DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA), eccitazione a 358 nm
I campioni di tessuti appendicite cronica con esacerbazione sono state incubate con l'anticorpo anti-S100A9 (1: 200, fluorescenza rossa etichettato), e anti-S100A8 /anticorpo A9. (1: 200, fluorescenza verde etichettato) come controllo positivo per la specifica espressione eterodimero S100A8 /A9 cultura
cellulare
Entrambe le linee cellulari in questo studio sono stati in precedenza profilato da analisi di microarray e sono stati regolarmente verificata utilizzando l'analisi STR (short tandem repeat DNA fingerprinting) [25]. Gastrico linea di cellule di cancro AGS è stato ottenuto da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), e la linea di cellule BGC-823 è stato istituito in Cina e ottenuto da Cell Research Institute, Shanghai, Cina. Le cellule tumorali sono state sistematicamente coltivate come un monostrato in terreno RPMI-1640 (GIBCO BRL, Carlsbad, CA), supplementato con 10% (v /v) di vitello siero fetale (FCS, GIBCO) e antibiotici a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 atmosfera.
cellulare invasione saggio
CytoSelect 24-Well cellulare Invasion Assay kit è stato acquistato da cellulare Biolabs, Stati Uniti d'America. S100A9 proteina ricombinante è stato acquistato da BMA Biomedicals, Svizzera. saggi cellulari invasione sono stati eseguiti con Transwell inserti, che permette alle cellule di migrare attraverso una dimensione dei pori di membrana in policarbonato 8 micron. La superficie superiore della membrana inserto è stato rivestito con uno strato uniforme di seminterrato essiccato soluzione matrice membrana. Le cellule risospese in terreno privo di siero sono state piastrate nella camera superiore di ogni Transwell ad una densità di 10 6 cellule /mL (200μL /camera). S100A9 proteina ricombinante è stato aggiunto al mezzo camera superiore a 0, 10, 20, 50, o 100 ng /ml. La camera inferiore è stato riempito con il mezzo 500μL contenente 10% FCS. Le cellule sono stati autorizzati a migrare per 48 ore a 37 ° C. Le cellule che sono rimasti nella camera superiore sono stati rimossi con un batuffolo di cotone, e le cellule che erano penetrati al lato inferiore della membrana sono state colorate in Cell Stain soluzione per 15 minuti, e contate in nove campi microscopici scelti a caso (200 ×) per pozzetto . Ogni inserto è stato poi trasferito in un pozzo vuoto e incubate in 200μL di soluzione di estrazione. Dopo 10 minuti, 100ul di soluzione di ogni campione sono stati trasferiti ad una piastra microtitolo a 96 pozzetti e misurata in un lettore di piastre a OD560nm. Saggio di migrazione cellulare

mobilità cellulare è stata valutata utilizzando una guarigione delle ferite saggio. Le cellule sono state seminate in sei pozzetti piastre di coltura dei tessuti e colta fino confluenti per ottenere un monostrato cellulare, che è stato poi ferito con sterili 200 ml punte per pipette. Qualsiasi detriti cellulari è stato rimosso mediante lavaggio con PBS. La cella monostrato ferito fu poi incubate in mezzo con 100 ml proteina ricombinante ng /S100A9. Le cellule di controllo sono stati trattati con RPMI-1640 medium privo di siero. time-lapse immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito a 200 × ingrandimenti per 0, 24, e 48 ore. La capacità di migrazione delle cellule è stata valutata calcolando la distanza media migrazione delle cellule.
Analisi statistica
variabili clinico-patologiche sono stati estratti da rapporti clinici ed istopatologici. curve ROC sono stati utilizzati per determinare il valore di cut-off del numero di cellule infiammatorie S100A9-positivo nella valutazione stadio TNM patologico. L'associazione di conta delle cellule infiammatorie S100A9-positivi con diverse fasi TNM è stato fatto con il test di Wilcoxon rank-sum. Per ottenere associazioni tra S100A9 o S100A8 numero di celle e variabili clinico-patologiche, i dati sono stati incrociati tabulati e un χ
2 test è stato eseguito. la sopravvivenza cumulativa è stata stimata con il metodo di Kaplan-Meier, e il confronto tra i gruppi sono stati fatti con un log-rank test. La sopravvivenza globale è stata misurata a partire dalla data di intervento chirurgico iniziale alla data di morte, contando morte per qualsiasi causa, come il punto finale, o l'ultima data di informazioni come il punto finale se nessun evento è stato documentato. L'analisi multivariata del modello di regressione dei rischi proporzionali di Cox (indietro, graduale) è stato creato per valutare l'influenza di ciascuna variabile sulla sopravvivenza. Significatività è stato fissato a P
< 0.05
. Risultati
Espressione di S100A9 ad infiltrarsi cellule infiammatorie nel carcinoma gastrico e tessuti gastrite cronica
In una precedente analisi gene array, abbiamo trovato che i tessuti di cancro gastrico si distinguevano dalla mucosa cancerosa adiacente da differenze caratteristiche nella loro modelli di espressione genica [26]. La diversità dei modelli di espressione genica può riflettere variazione delle proprietà intrinseche delle cellule tumorali e normali sia variazione nella composizione cellulare di questi tessuti complessi. All'interno di questi geni, l'espressione S100A9 in tessuti di cancro gastrico era superiore a quello del corrispondente mucosa non tumorali adiacenti (P ​​=
0,00,241 mila, Figura 1A). Figura 1 L'espressione di S100A9 nel carcinoma gastrico e tessuti non tumorali adiacenti. (A) valore differente espressione di S100A9 in 72 tessuti di cancro gastrico e associato non-cancerose tessuti analizzando i dati da Illumina Sentrix BeadChip cDNA microarray. (B-E) La colorazione immunoistochimica di S100A9 nei tessuti di cancro gastrico (B) metastatici linfonodi (C), gastrite cronica (D), e adiacente mucosa gastrica non-cancerose (E). S100A9 localizzazione è stato rivelato come loci granulato marrone o rosso nel citoplasma di infiltrarsi cellule infiammatorie, in particolare in fagociti mononucleari e granulociti neutrofili. (Ingrandimento 200 ×).
Immunoistochimica di campioni provenienti da 177 pazienti affetti da cancro gastrico ha dimostrato che S100A9 è stato positivo in tutti i tessuti tumorali primarie con immunostaining trova esclusivamente nelle cellule infiammatorie quali macrofagi e neutrofili infiltranti tessuti tumorali primari (I diversi tipi di cellule in tessuti campioni sono stati identificati da due patologi indipendenti) (Figura 1B). Tutti i linfonodi metastatici esaminati (n = 30) sono stati anche positivi per S100A9 con immunostaining trova esclusivamente nelle cellule infiammatorie che circondano i tessuti tumorali metastatiche (Figura 1C). In mucosa non-cancerose adiacente, S100A9 è stato espresso in cellule infiammatorie infiltranti gastrite. mucosa gastrica aveva l'espressione S100A9 negativo o molto deboli (Figura 1D, E).
S100A9-positivo conta delle cellule infiammatorie nei tessuti tumorali è associata a stadio del cancro e paziente sopravvivenza
Per valutare il grado di espressione S100A9 in Cancro gastrico ambiente associati, il numero di cellule infiammatorie S100A9-positivi in ​​ogni tessuto tumorale è stata misurata la media dei conteggi delle cellule di tre campi (ingrandimento originale, 200 ×) nella zona con il maggior numero di cellule positive al sito di profonda invasione tumorale. Correlazione tra numero di celle e parametri clinico-patologici e la sopravvivenza del paziente è stato analizzato utilizzando rank-sum test Wilcoxon e il metodo di Kaplan-Meier. Come mostrato nella Figura 2A, graduale diminuzione del numero di cellule infiammatorie S100A9-positivi nei tessuti tumorali è stata associata con l'aumento del tumore stadio patologico da I a IV (Wilcoxon rank test somma per 4 tappe, P = 0,0265
). Figura conta delle cellule 2 High S100A9 nel tessuto del cancro indica risultato migliore nei pazienti affetti da cancro gastrico. (A) diagramma a dispersione di conteggio S100A9-positivo cellule infiammatorie in ogni stadio TNM patologico. La linea blu indica il livello di 200. (B) ROC curva della conta delle cellule S100A9 per la previsione dello stadio TNM patologico. Freccia indicato il punto di taglio circa 200. (C) analisi di Kaplan-Meier di sopravvivenza globale per ogni fase TNM patologico. (D) analisi di Kaplan-Meier di sopravvivenza globale per alta conta di cellule S100A9 (≥ 200) del gruppo e conta delle cellule basso S100A9 (< 200) del gruppo. (Solo 176 pazienti sono stati arruolati nell'analisi di un paziente perso al follow-up).
Poi abbiamo testato la potenza previsione della conta delle cellule S100A9 per la fase del tumore nel cancro gastrico. Sulla base di stadio TNM, i pazienti sono stati divisi in due gruppi, gruppo meno avanzata (fase I + II) e il gruppo avanzato (stadio III + IV). Area sotto la curva (AUC) ottenuto dal receiver operating curve caratteristiche (ROC) utilizzando le cellule infiammatorie S100A9-positivo conteggio era 0,623 per le fasi TNM patologici. Il valore di taglio era 198,5 (abbiamo usato 200 nel seguente analisi) per 200 campo × ingrandimenti con una sensibilità del 64,3% e il 61,9% di specificità per lo stadio del tumore previsione (Figura 2B). la linea di taglio del 200 può essere utilizzato per separare il gruppo meno avanzata dal gruppo avanzato. La differenza era significativa tra i due gruppi (Wilcoxon rank test somma per due gruppi, P = 0.017
, Figura 2A).
Poiché l'analisi di sopravvivenza ha mostrato la prognosi significativamente diverso per i malati di cancro gastrico in diversi stadi del cancro (Figura 2C) , abbiamo analizzato il rapporto tra cellule infiammatorie S100A9-positivo Conte e il tasso di sopravvivenza dei pazienti. I pazienti sono stati stratificati in base al valore di cutoff in alta conta di cellule S100A9 (≥ 200) del gruppo e numero di cellule a basso S100A9; gruppo (<200). tasso di sopravvivenza a 5 anni è stata del 44,6% nel gruppo elevato numero di cellule contro il 22,5% nel gruppo a basso numero di cellule (P = 0,021
, Figura 2D). tempo di sopravvivenza mediana è stata 35,1 ± 10,8 mesi per il gruppo elevato numero di cellule e 20,3 ± 3,0 mesi per il gruppo a basso numero di celle, rispettivamente. Nel loro insieme, conta delle cellule infiammatorie S100A9-positivo nel tessuto cancro gastrico può essere usato come un predittore di distinguere fase iniziale e carcinoma gastrico avanzato con il cut-off di 200 cellule positive /HPF. La presenza di cellule infiammatorie S100A9-positivi nei tessuti tumorali correla con una prognosi migliore nei pazienti con cancro gastrico.
Basso numero di cellule infiammatorie S100A9-positivi nei tessuti tumorali correla positivamente con stato trovato poveri caratteristiche clinico-patologiche
conta delle cellule Low S100A9 essere correlata con la profondità del tumore invasione (T stadio), metastasi linfonodali (N stadio), e lo stadio TNM clinica (P = 0,011
, 0,009 e 0,002, rispettivamente). Correlazione tra numero di cellule S100A9 e altre caratteristiche cliniche, come il sesso, l'età, localizzazione del tumore, metastasi epatiche (M stadio), invasione vascolare e la differenziazione non erano statisticamente significative (P tutti
> 0,05) (Tabella 1). Inoltre, l'analisi multivariata ha dimostrato N stadio (P = 0,006
), metastasi epatiche (P = 0.000
), e conta delle cellule S100A9 (P = 0,046
) da fattori indipendenti nel predire la sopravvivenza globale (Tabella 2 ) .table 1 Associazione di S100A9-positivo conteggio delle cellule infiammatorie nei tessuti tumorali con parametri clinico-patologici di pazienti di cancro gastrico
variabili
bassa S100A9 (cellule positive < 200)
alta S100A9 ( cellule positive > = 200)
P valore
Sex
0.125
Maschio
74
50
femminile
25
28
Età
0,089
< 50 | 32
18
50-59
24
12
60-69
33
33
> = 70 10
15
localizzazione del tumore
0,271
Cardia
26
15
non-cardias
73
63
Profondità tumore invasione **
0,011
T1 3
2
T2 7
19
T3
69
42
T4
20
15
metastasi linfonodali
0.009
N0
13
23
N1
32
30
N2
32
17
N3
22 Pagina 8
fegato metastasi
0,571
negativo
89
68
positivo
10 10
TNM fase
0.002
І 3
12
II
37
35
III
50 | 21
IV
9 10
invasione vascolare
0,742
negativo
38
31
positivo
58
43
Non registrato * 3
4
Differenziazione **
0,472
Bene
2 4
Moderatamente + scarsamente
82
66
Altri tipi
13
6
Non determinato Pagina 2 2
* dati incompleti.
** test esatto di Fisher.
Tabella 2 L'analisi multivariata dei fattori prognostici per la sopravvivenza totale dei pazienti di cancro gastrico
Variazioni
P
RR
CI (95%)
Sex
0,671
1.106
0,694-1,765
maschio contro femmina
Età
0,179
1.148
0,938-1,405
< 50 | 50-59
60-69
> = 70
Tumore posizione
0,545
0.864
0,538-1,387
Cardia vs
non-cardias
Differenziazione
0,301 0,751

0.437- 1.292
Bene contro moderatamente + mal
metastasi linfonodali
0.006
1.841
1,196-2,835
N0 + N1 contro N2 + N3
profondità di invasione tumorale
0.1
1.756
0,897-3,435
T1 + T2 rispetto al T3 + T4
metastasi epatiche
0
3.461
2,002-5,983
negativa rispetto positivo
vascolare invasione
0,107
1.452
0,922-2,285
negativa rispetto positivo
cellule infiammatorie S100A9-positivo conteggio
0,046 0,643

0,417-,991
< 200 contro > = 200
RR: rischio relativo; CI:. Intervallo di confidenza
Lo stato espressione di S100A8 e S100A8 eterodimero /A9 in gastrica tessuti tumorali e tessuti gastrite
Gastrite cronica è una lesione gastrica cronica, patologicamente caratterizzata da aspecifica infiammazione cronica della mucosa gastrica. Le cellule infiammatorie nella gastrite cronica sono morfologicamente simili a quelli infiltrazione tessuti di cancro gastrico primarie. In alcuni casi, gastrite cronica anche può portare al cancro allo stomaco. Successivamente, abbiamo esaminato ulteriormente l'espressione di S100A8, un parente stretto del S100A9 e la forma heterodimerization S100A8 /A9 in entrambi i tessuti di cancro gastrico e non tumorali tessuti gastrite cronica adiacenti in campioni di cancro gastrico eseguendo immunoistochimica. Analogamente al modello di S100A9, S100A8 è stata espressa esclusivamente nelle cellule infiammatorie infiltranti entrambi i tessuti tumorali e tessuti gastrite adiacenti. . S100A8 non è stato espresso in tutte le cellule di cancro gastrico e mucosa gastrica
Avanti, abbiamo quantificato il numero di cellule infiammatorie S100A8-positivi in ​​ogni tessuto tumorale come descritto in precedenza per S100A9 (file complementare 1: Figura S1). Sorprendentemente, conta delle cellule S100A8 nei tessuti di cancro gastrico non correlava con la maggior parte delle caratteristiche clinico-patologici (file aggiuntivo 2: Tabella S1) o la sopravvivenza del paziente (sui file 3: Figura S2). Inoltre, l'espressione della forma heterodimerization S100A8 /A9 non è stato rilevato in tutte le cellule infiammatorie infiltranti i tessuti di cancro gastrico, mentre alcune cellule positive S100A8 /A9 sono stati identificati nei tessuti gastrite cronica (dati non riportati). Questi dati hanno indicato che la distribuzione di S100A9, S100A8 e S100A8 /A9 potrebbe essere diverso nel cancro gastrico e tessuti umani gastrite cronica.
Per confermare questa ipotesi, abbiamo studiato ulteriormente il modello di localizzazione subcellulare di S100A9, S100A8 e S100A8 /A9 eterodimero espressione eseguendo immunofluorecence colorazione in un microarray di tessuto, tra cui 23 casi di cancro gastrico e 57 casi di gastrite cronica. Nei tessuti di cancro gastrico, sia S100A9 e S100A8 proteine ​​sono state rilevate nelle cellule infiammatorie tumore infiltrante (Figura 3A, B), mentre nessun eterodimero S100A8 /A9 è stato trovato in tutti i casi (Figura 3G). L'espressione di S100A8 e S100A9 in parte sovrapposto nel citoplasma delle cellule (Figura 3D, E). Inoltre, le proteine ​​S100A9 e S100A8 sono stati rilevati nelle cellule infiammatorie a gastrite cronica (Figura 3 K, L). Distribuzione di queste due proteine ​​anche parzialmente sovrapposti (Figura 3N, O). Coerentemente con i risultati di immunoistochimica, S100A8 /A9 non è stato espresso in tutte le cellule dei tessuti tumorali gastrica (figura 3G), mentre l'espressione di S100A8 /A9 parzialmente sovrapposta con la S100A9 in cellule infiammatorie di tessuti gastrite (Figura 3Q, S, T) . Non sorprende, l'espressione e la distribuzione di S100A8 /A9 nei tessuti appendicite cronica con esacerbazione (controllo positivo) erano molto simili quelli nei tessuti gastrite cronica (Figura 3U, V, X, Y). Nel loro insieme, l'espressione differenziale e la localizzazione subcellulare di S100A9, S100A8 e S100A8 /A9 in vari tessuti possono coinvolgere i loro diversi ruoli nel cancro gastrico o ambiente gastrite cronica. Figura 3 immagini di immunofluorescenza di S100A9, S100A8 e proteine ​​S100A8 /A9 in diapositive di tessuto microarray contenenti tessuti di cancro gastrico (A-J) e tessuti gastrite cronica (K-T), e tessuti appendicite cronica con esacerbazione (U-Y). S100A9 e S100A8 sono stati rilevati da un anticorpo monoclonale, prelabeled con la Fluor mouse IgG Labeling Kit Zenon Alexa (con fluorescenza verde e rosso, rispettivamente). Il nucleo era macchiato dal DAPI. eterodimeri S100A8 /A9 erano rilevabili utilizzando lo specifico anticorpo-dimero 27E10 da BMA Biomedicals prelabeled con fluorescenza verde. La co-localizzazione di S100A9 e S100A8 o S100A8 /A9 è stato mostrato in immagini fuse (D, I, N, S, X) e grandi immagini unite (E, J, O, T, Y). freccia bianca in 3 T mostra co-localizzazione di S100A9 e S100A8 /A9 in gastrite cronica. lunghezza della barra, 50 micron.
L'effetto inibitorio della proteina ricombinante S100A9 sulla migrazione e l'invasione delle linee di cellule di cancro gastrico in vitro
La proteina S100A9 è espresso in e secreti dalle cellule infiammatorie, che serve come mediatore in acuto e infiammazione cronica. Dal momento che il numero di cellule infiammatorie S100A9-positivo correlato con caratteristiche clinico-patologici meno aggressivi, abbiamo testato ulteriormente la funzione inibitoria diretta di ricombinante S100A9 sulla migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico. Per valutare la capacità invasiva delle cellule di cancro gastrico, transwell test è stato utilizzato. Due linee cellulari di cancro gastrico, AGS e BGC-823, sono stati trattati con media o terreno privo di siero contenente varie concentrazioni di S100A9 proteina ricombinante (10, 20, 50 e 100 ng /ml, rispettivamente). cellule invasive sono state contate in nove campi microscopici scelti a caso (200 ×). I risultati hanno mostrato che S100A9 proteina ricombinante leggermente inibito AGS invasione delle cellule (Figura 4A), mentre S100A9 significativamente inibito BGC-823 invasione in modo concentrazione-dipendente (P
< 0,05, Figura 4C). Per analizzare la capacità migrazione delle cellule di cancro gastrico, abbiamo eseguito la guarigione delle ferite test. Entrambe le linee cellulari sono state trattate con media o terreno privo di siero contenente 100 ng /ml S100A9 proteina ricombinante. I risultati hanno mostrato che S100A9 leggermente inibito la migrazione delle cellule AGS (figura 4B), mentre distanze di migrazione delle cellule di BGC-823 cellule trattate con S100A9 dopo 24 ore e 48 ore di incubazione erano significativamente più bassi rispetto a quelli di controllo (P
< 0,05, Figura 4D). Figura 4 Effetto di S100A9 proteina ricombinante sulla invasione e la migrazione delle linee di cellule di cancro gastrico. In transwell saggio, cellule AGS (A) e BGC-823 (C) sono stati trattati con terreno o terreno privo di siero contenente 10, 20, 50 o 100 ng /ml S100A9 proteina ricombinante. cellule invasive sono state contate in modo casuale nove campi microscopici selezionati (200 ×). In cicatrizzazione saggio, cellule AGS (B) e BGC-823 (D) sono stati trattati con media o medio RPMI-1640 privo di siero contenente 100 ng /ml S100A9 proteina ricombinante. Le foto sono state catturate da un microscopio a contrasto di fase invertito a 0 h, 24 ore e 48 ore dopo il ferimento. sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti. I risultati sono stati presentati come media ± S.D. di questi esperimenti indipendenti. P valore
rispetto al gruppo di controllo
.
Discussione
cancro umano è una malattia cronica che ha origine da cellule trasformate ospitano genetica, nonché alterazioni epigenetiche. Tuttavia, il cancro non è costituito soltanto da cellule tumorali. Il cancro del tessuto contiene altri tipi di cellule, tra cui fibroblasti e cellule epiteliali, cellule del sistema immunitario, e le cellule che formano i vasi sanguigni e vasi linfatici [27]. In questo complesso microambiente tumorale, mediatori infiammatori regolano diverse fasi di sviluppo del tumore, tra cui l'iniziazione, la promozione, l'invasione e metastasi [28].
S100A9, un membro della famiglia S100, è abbondante in granulociti, monociti e cheratinociti attivati ​​durante vari condizioni infiammatorie. In questo studio, abbiamo scoperto che S100A9 è stato specificamente trova nelle cellule infiammatorie infiltranti i tessuti di cancro gastrico e tessuti gastrite cronica, mentre tutte le cellule di cancro gastrico o cellule adiacenti di mucosa gastrica non hanno espresso S100A9. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

• Identificazione dei cambiamenti di metilazione del DNA associate a cancro gastrico umano
• Caratterizzazione di metilazione gastrica umana carcinoma correlati di 9 isole miR CPG e la repressione delle loro espressioni in vitro e in vivo