Läsnäolo S100A9-positiivisten tulehdussolujen syöpäkudoksiin korreloi varhaisessa vaiheessa syöpä ja parempaan ennusteeseen potilailla, joilla on mahalaukun cancer

läsnäolo S100A9-positiivisten tulehdussolujen syöpäkudoksiin korreloi varhaisessa vaiheessa syöpä ja parempaan ennusteeseen potilailla, joilla on mahasyövän
Abstract
tausta
S100A9 löydettiin alun perin tekijä erittyy tulehdussolujen. Äskettäin S100A9 todettiin liittyvän useisiin ihmisen syöpäsairauksia. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää S100A9 ilmentymistä mahasyövän ja tutkia sen roolia syövän etenemiseen. Tool Menetelmät
S100A9 ilmentymistä mahalaukun kudosnäytteitä 177 mahasyöpäpotilaista arvioitiin immunohistokemiallisesti. Ilmaisu sen dimerisaation kumppanin S100A8 ja S100A8 /A9-heterodimeeri arvioitiin myös samalla menetelmällä. Ulkoisten S100A9 annetun liikkuvuuteen mahalaukun syöpäsolujen AGS ja BGC-823 jälkeen tutkittiin.
Tulokset
S100A9 oli nimenomaan ilmaiseman tulehdussolujen, kuten makrofagien ja neutrofiilien ihmisen mahasyövän ja gastriitti kudoksiin. Tilastollinen analyysi osoitti, että suuri S100A9 solujen määrä (> = 200) per 200x suurennus mikroskooppisen kentän syöpä kudoksiin oli ennustava alkuvaiheen mahasyöpä. Korkea S100A9-positiivisten solujen määrä oli negatiivinen korrelaatio imusolmuke etäpesäke (P
= 0,009) ja kasvaimen invaasio (P
= 0,011). S100A9 todettiin itsenäisenä ennustetekijöiden ennustaja eloonjäämisaste potilaiden mahalaukun syöpä (P
= 0,04). Potilaat, joilla on korkea S100A9 solumäärä oli suotuisa ennusteeseen (P
= 0,021). Lisäksi tutkimuksessa havaittiin, että S100A8 jakelua ihmisen mahasyövän kudosten oli samanlainen S100A9. Kuitenkin määrä S100A8-positiivisten solujen ei positiivisesti korreloi potilaan selviytymistä. Tulehdussolujen soluttautua syöpä olivat S100A8 /A9 negatiivinen, kun taas ne, gastriitti olivat positiivisia. Lisäksi eksogeeninen S100A9 proteiini esti muuttoliike ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja.
Johtopäätökset
Tuloksemme ehdotti S100A9-positiivisten tulehdussolujen mahasyövän kudoksissa liittyy alkuvaiheessa mahasyövän ja hyvää ennustetta.
Avainsanat
Mahasyöpää S100A9 Tulehdussolut tuumorin luokitus Survival Background
Mahalaukun syöpä on yksi johtavista syistä syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa. Yhteensä 989600 uutta mahalaukun syöpätapausta ja 738000 kuolemantapausta arvioitiin tapahtuneen vuonna 2008, ja yli 70% uusista tapauksista ja kuolemista tapahtuu kehitysmaissa, kuten Kiinassa [1]. Mahalaukun syöpä on yleisesti havaitaan myöhemmissä vaiheissa, kun ennustetekijöitä tulokset ovat huonoja. Lähes 70-80% potilaista on osallistuminen paikallisiin imusolmukkeisiin joka on syvällinen vaikutus eloonjäämiseen [2, 3]. Siksi löytäneet uusia biomarkkereita avustaisivat varhainen havaitseminen ja tarkan ennusteen kasvaimen käyttäytymisen voisi parantaa potilaan selviytymistä [4-6].
Jäsenet S100 perheen proteiinien ovat nousemassa biomarkkereita useita kasvaimia [7]. S100 perheenjäsen S100A9 on 13kd proteiini, joka sisältää konservoituneita rakenteellisia motiiveja, jotka koostuvat kahdesta EF-käden Ca 2 +: aa sitova verkkotunnuksia. Sen jälkeen kalsiumia sitova, S100A9 vuorovaikutuksessa toisen S100 perheenjäsenen S100A8 muodostaa toiminnallisen heterodimeerin nimeltään kalprotektiinin [8, 9]. S100A9 tunnistettiin alun perin erittämän sellaisen tekijän tulehdussolujen, kuten neutrofiilien ja makrofagien nivelreuma, tulehduksellinen suolistosairaus ja muut tulehdussairaudet [10-14]. S100A9, S100A8, sekä S100A8 /A9-heterodimeeri kalprotektiinin, yli-ilmennetään tulehduksen aikana aiheuttaman syövän synty [15]. S100A9 ilme on säädelty tuumorisoluissa keuhkojen [16], eturauhas- [17], ja rintasyövän [18, 19], kun se on alassäädetty ihmisen ruokatorven syöpä soluja [20]. Kolorektaalisyövässä kudosnäytteiden kuitenkin S100A9 proteiinia ei havaittu syöpäsoluja, vaan tulehdussolujen hajallaan tuumorin strooman [21]. Lisäksi S100A9 oli merkitsevästi korkeampi ulostenäytteissä paksusuolisyövän potilaiden kuin verrokeilla [22]. Mahasyövän, geenien ilmentyminen ja proteomiikka-analyysi osoitti korkean ilmentymisen S100A9 kudoksessa. [23, 24]. Kuitenkin niiden hajaantumista kudoksen ja yhdessä kliinis eivät täysin osoitettu.
Tässä tutkimuksessa käytimme geeniekspressioanalyysissä vertailla S100A9 ilmentymisen mahasyövän kudosten ja viereisessä, näennäisesti normaaleissa kudoksissa. Immunohistokemiallinen värjäys paljasti S100A9 in kasvaimeen liittyvien tulehdussolujen. Lisäksi olemme osoitettu korrelaatio määrä S100A9-positiivisten solujen kasvainkudoksissa ja kliinis. Käsittelimme myös yhteistyössä lokalisointi S100A9 ja S100A8 sekä lokalisoinnin dimeerin kalprotektiinin immunofluoresenssilla. Lopuksi perehtyä funktio S100A9 syöpäsoluissa, tutkimme vaikutus rekombinantin S100A9 proteiinia maahanmuutosta ja invaasion mahasyövän solujen AGS ja BGC-823. Tool Menetelmät
Potilaat ja kudosnäytteet
tutkimus suoritettiin hyväksyttyä eettisen komitean Pekingin yliopiston Cancer sairaala. Tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Sata kuusikahdeksattakymmentä potilailla mahalaukun syövän tutkittiin. 124 urosta ja 53 naarasta (keski-ikä, 57 vuotta alueella, 26-80 vuotta) diagnosoitiin ja kirurgisesti käsitelty Peking University Cancer sairaalan vuodesta 1998 vuoteen 2004. syvyys kasvaimen invaasio, histologinen luokka, imusolmuke etäpesäke, maksa etäpesäke, ja verisuonten invaasio saatiin kliinisistä ja histopatologisia raportteja. Vaihe mahasyöpä oli luokiteltu 7. painos kasvaimen etäpesäke (TNM) luokitus suosittelemaa American sekakomitean Cancer. Kukaan potilaista ei saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Kaikki potilaat seurattiin vasta tammikuussa 2010. Sen jälkeen gastrectomy, yksi osa resektoitiin näyte kiinnitettiin 10% formaliinilla ja käsitellään rutiininomaisesti patologisen arvioinnin, ja toinen oli snap-jäädytetty nestemäisessä typessä säilytettiin -80 ° C: ssa RNA. Lisäksi 30 Hyväksytty metastasoitunut imusolmukkeet kerättiin myös näillä potilailla. Kymmenen kroonista umpilisäke kudosten pahenemista toimittivat osasto General Surgery, turvattu sairaala Qingdao University Medical College.
Immunohistokemia (IHC) B Neljän mikrometrin osastoja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset kiinnitettiin poly-L-lysiinillä päällystettyihin dioja ja sitten parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin läpi alkoholin tislattua vettä. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin 3% vetyperoksidia 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen, kun paine kypsennyksen levyt 10 mmol /l EDTA: a (pH 8,0), 3 minuuttia, leikkeitä inkuboitiin 5% vuohen seerumia, sitten niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren anti-S100A9-vasta-ainetta (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Sveitsi), tai hiiren anti-S100A8 vasta-ainetta (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), tai hiiren anti-S100A8 /A9-aineella (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Ensisijainen vasta-aineet havaittiin käyttämällä kaksivaiheista EnVision System (Dako, Glostrup, Tanska). Piparjuuriperoksidaasi ja diaminobenzedene hydrokloridi (DAB) olivat entsyymiä ja kromogeenilla palveluksessa. Expression of S100A9, S100A8 ja S100A8 /A9 havaittiin myös Cybrdi kudosten microarray dioja (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, Kiina), joka sisältää krooninen gastriitti metaplasiaa (57 tapausta) ja mahalaukun karsinooma kudosten (23 tapausta). Kymmenen kroonista umpilisäke yksilöiden kanssa pahenemista oli toimi positiivisena kontrollina S100A8 /A9.
IHC arviointi ja katkaisun määrittely
S100A9 ja S100A8 värjättiin tulehdussolujen, kuten makrofagien ja neutrofiilien soluttautua tuumorikudoksia. Positiiviset solut osoittivat eriasteisia sytoplasmista värjäytymistä. Kuvat otettiin käyttäen Ariol kuva-analyysi-järjestelmän (Applied Imaging, San Jose, CA, USA). Skanneri perustuu Olympus BX61 mikroskooppi moottoroidulla vaiheessa ja automaattitarkennus ominaisuudet varustettu kameralla. Dioja skannattiin 200 x suurennus. Aste monoklonaalinen S100A9 tai S100A8-vasta-aineen reaktiivisuus kussakin kudoksessa osassa arvioitiin laskemalla värjäytyneiden tulehdussolujen kolme 200-kertaisella suurennuksella putkilla. Tämä suoritettiin kaksi riippumatonta patologia avulla automaattisen mikroskoopin järjestelmän ja kuvankäsittelyohjelmisto (katso Additional tiedosto 1: Kuva S1). Cut-off-arvo S100A9 värjättyä tulehdussolujen ennustamiseen potilaan patologinen vaiheessa määritettiin vastaanotin toimii (ROC) käyrä.
Laser konfokaalinen skannauksen
tutkimiseksi kolokalisaation S100A9 ja sen dimerisaatio kumppani S100A8, tai heterodimeeri S100A8 /A9, The Cybrdi kudoksen mikrosiru kalvot (IC00-01-001) inkuboitiin 1,5 tuntia huoneenlämpötilassa, jossa hiiren anti-S100A9-vasta-ainetta (1: 200) pre-leimattu Zenon Alexa Fluor 647 hiiri-lgG Labeling Kit (Z-25008, punainen fluoresenssi), ja joko anti-S100A8 vasta-ainetta (1: 200) tai anti-S100A8 /A9-aineella (1: 200) ennalta merkitty Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG Labeling Kit (Z-25002 , vihreä fluoresenssi). Konfokaaliset kuvat hankittiin käyttäen Leica TCS SP5 -konfokaalimikroskoopilla (Leica, Mannheim, Saksa). Lisäksi ytimet vastavärjättiin DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA), viritys 358 nm: ssä.
Näytteet krooninen umpilisäke kudosten pahenemista inkuboitiin anti-S100A9-vasta-ainetta (1: 200, punaisen fluoresenssin leimattu), ja anti-S100A8 /A9-aineella (1: 200, vihreä fluoresenssi leimattu) positiivisena kontrollina erityisten S100A8 /A9-heterodimeeri ilme.
Soluviljely
Molemmat solulinjat tässä tutkimuksessa aiemmin profiloidaan mikrosiruanalyysillä ja olivat säännöllisesti todentaa STR analyysiä (lyhyt tandem repeat DNA-sormenjälkien) [25]. Mahalaukun tasyöpäsolulinja AGS saatiin ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), ja solulinjaa BGC-823 perustettiin Kiinassa ja saadut Cell Research Institute, Shanghai, Kiina. Syöpäsolut kasvatettiin rutiininomaisesti yhtenä kerroksena RPMI-1640-väliaineessa (GIBCO BRL, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% (v /v) vasikan sikiön seerumia (FCS, Gibco) ja antibiootteja 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO 2 ilmakehässä.
Cell invaasiomääritys
CytoSelect 24-Well Cell invaasiomääritys pakki hankittiin Cell Biolabs, USA. S100A9 rekombinanttiproteiini hankittiin BMA Biomedicals, Sveitsi. Soluinvaasion määritykset suoritettiin Transwell lisäosien, joka sallii solujen kulkeutumaan 8 um huokoskoon polykarbonaattikalvon. Yläpinnan insertin kalvo päällystettiin yhtenäinen kerros kuivattiin tyvikalvon matriisin ratkaisu. Solut suspendoitiin uudelleen seerumia levytettiin ylemmässä kammiossa kunkin Transwell tiheydellä 10 6 solua /ml (200 ui /kammio). S100A9 rekombinanttiproteiinia lisättiin ylempään kammioon liuoksessa 0, 10, 20, 50 tai 100 ng /ml. Alaosaan täytettiin 500 pl elatusainetta, joka sisälsi 10% FCS: ää. Solujen annettiin kulkeutua 48 h 37 ° C: ssa. Solut, jotka pysyivät ylemmässä kammiossa poistettiin vanupuikolla, ja solut, jotka oli tunkeutunut pohjaan membraanin värjättiin Cell Stain Solution 15 minuuttia, ja laskettiin yhdeksässä satunnaisesti valitun mikroskooppikentäs- (200 x) kuoppaa kohti . Kukin insertti siirrettiin sitten tyhjään hyvin ja inkuboitiin 200 ui uuttoliuosta. 10 minuutin kuluttua, 100 ui liuosta kustakin näytteestä siirrettiin 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle ja mitattiin levynlukijalla OD560nm.
Cell migraatiokokeessa
Cell liikkuvuus arvioitiin käyttämällä haavan paranemista määrityksessä. Solut ympättiin kuuden kuoppaisiin kudosviljelymaljoihin ja viljeltiin, kunnes konfluentteja saada yksisolukerros, joka sitten haavoittuneen käyttämällä steriiliä 200 ui pipetin kärkiä. Mikä tahansa solujäte poistettiin pesemällä PBS: llä. Haavoittuneen yksikerroksista solu inkuboitiin sitten väliaineessa 100 ng /ml S100A9 rekombinanttiproteiini. Ohjaus soluja käsiteltiin seerumittomalla RPMI-1640-väliaine. Time-lapse kuvia otettiin käyttäen käänteisen faasikontrastimikroskoopissa 200 x suurennus 0, 24, ja 48 h. Solujen liike- kyky arvioitiin laskemalla keskimääräinen solumigraatiota päässä.
Tilastollinen analyysi
ennusteeseen viittaavia muuttujia uutettiin kliinisten ja histopatologisten raportteja. ROC käyrät käytetty määritettäessä cut-off-arvo S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrän arvioinnissa patologinen TNM vaiheessa. Yhdistys S100A9-positiivisten tulehduksellisten solujen määrä eri TNM vaiheisiin tehtiin Wilcoxonin rank-sum test. Saadakseen yhdistysten välillä S100A9 tai S100A8 solujen määrän ja ennusteeseen viittaavia muuttujien osalta tiedot ristiintaulukoida ja χ
2 suoritettiin. Kumulatiivinen eloonjäänti arvioitiin Kaplan-Meier menetelmää, ja vertailun ryhmien tehtiin log-rank-testi. Kokonaiselossaoloaika mitattiin kuluessa alkuperäisestä leikkaus kuolinpäivä, laskenta kuolema mistä tahansa syystä päätepisteeksi, tai viimeinen tieto päätepisteeksi jos tapahtuma dokumentoitiin. Monimuuttujafunktiokehitettiin analyysi Coxin suhteellisen vaarat regressiomallia (taaksepäin, vaiheittainen) luotiin arvioimaan vaikutuksen kunkin muuttujan eloonjäämiseen. Merkitys asetettiin P
< 0,05.
Tulokset
ilmentäminen S100A9 tunkeutumisen tulehdussolujen mahasyövän ja krooninen gastriitti kudosten
edellisen geenin erilaisia ​​analyysi, havaittiin, että mahalaukun syövän kudokset erottaa viereisten noncancerous limakalvon ominaisuus eroista niiden geeniekspressiomalleja [26]. Monimuotoisuutta geeniekspressiomalleja voi heijastaa vaihtelua luontaiset ominaisuudet kasvainsolujen ja normaalien solujen sekä vaihtelua solukoostumus näiden monimutkaisten kudosten. Näiden geenien ilmentymisen S100A9 mahasyövän kudoksissa oli korkeampi kuin täsmäsi vierekkäisten noncancerous limakalvon (P
= 0,00241, kuvio 1A). Kuva 1 ilmentäminen S100A9 mahasyövän ja viereisen ei-syöpä kudoksiin. (A) Eri ilmaus arvo S100A9 72 mahasyövässä kudosten ja pariksi ei-syöpäkudokset analysoimalla tietoja Illumina Sentrix BeadChip cDNA microarray. (B-E) immunohistokemiallinen värjäys S100A9 mahasyövän kudoksissa (B) metastaattinen imusolmukkeiden (C), krooninen gastriitti (D), ja viereisen ei-syöpä mahan limakalvon (E). S100A9 lokalisointi paljastui ruskea tai punainen rakeisia lokusten sytoplasmassa tunkeutuvien tulehdussolujen, erityisesti mononukleaarisissa fagosyyteissä ja neutrofiilien granulosyyttien. (Suurennus 200 x).
Immunohistokemia yksilöitä 177 mahasyöpäpotilaista osoitti S100A9 myönteisesti kaikilla ensisijainen syövän kudoksiin immuunivärjäystä yksinomaan sijaitsee tulehdussolujen, kuten makrofagien ja neutrofiilien soluttautuminen primaarikasvaimen kudosten (eri solutyyppejä kudoksessa näytteet tunnistettiin kaksi riippumatonta patologit) (kuvio 1 B). Kaikki tarkastellut metastaattinen imusolmukkeiden (n = 30) olivat myös positiivisia S100A9 kanssa immuunivärjäystä yksinomaan sijaitsee tulehdussolujen ympäröivä metastaattinen kudoksiin (kuvio 1 C). Viereisissä ei-syöpä limakalvon, S100A9 ilmentyi tulehdussolujen soluttautua gastriitti. Mahalaukun limakalvo oli negatiivinen tai hyvin heikko S100A9 ilmaisu (kuvio 1 D, E).
S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrä syövän kudoksissa liittyy syöpään vaihe ja potilaan eloonjäämisen
arvioimiseksi laajuuden S100A9 ilmaisun mahalaukun syöpää liittyvä ympäristö, määrä S100A9-positiivisten tulehdussolujen kussakin kasvainkudoksessa mitattiin laskemalla keskiarvo solumäärät kolmesta kentästä (alkuperäinen suurennos, 200 x) alueen kanssa eniten positiivisten solujen paikalla syvin kasvaimen invaasion. Korrelaatio solumäärä ja kliinis parametrit ja potilaan eloonjääminen analysoitiin Wilcoxonin-sum test ja Kaplan-Meier-menetelmällä. Kuten kuviossa 2A, asteittaisen vähentämisen S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrä syövän kudoksissa liittyi kasvu kasvaimen patologisten vaiheessa I-IV (Wilcoxonin summa testi 4 vaihetta, P
= 0,0265). Kuva 2 Korkea S100A9 solumäärien syöpäkudoksen osoittaa parempaan lopputulokseen mahalaukun syöpäpotilailla. (A) Scatter käyrä S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrä kussakin patologinen TNM vaiheessa. Sininen viiva osoittaa tason 200. (B) ROC-käyrän S100A9 solumäärän ennustamiseen patologisen TNM vaiheessa. Arrow osoitti cutoff pisteen noin 200. (C) Kaplan-Meier kokonaiselinajan analyysiin kunkin patologisen TNM vaiheessa. (D) Kaplan-Meier-analyysi kokonaiselinaika korkean S100A9 solujen määrä (≥ 200) ryhmä ja alhainen S100A9 solumäärä (< 200) ryhmässä. (Vain 176 potilasta otettiin analyysiin yhden potilaan hävisi seuranta).
Sitten testasimme ennustaminen voima S100A9 solumäärän kasvainten vaiheessa syöpään. Perustuen TNM vaiheessa potilaat jaettiin kahteen ryhmään, vähemmän kehittyneiden ryhmä (vaihe I + II) ja kehittyneiden ryhmä (vaihe III + IV). Alapuolinen alue (AUC) saatu vastaanottimen toimivien (ROC) käyrät käyttäen S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrä oli 0,623 patologiset TNM vaiheissa. Kynnysarvo oli 198,5 (käytimme 200 seuraavassa analyysissä) per 200 kertainen suurennus kentän 64,3% herkkyys ja 61,9% spesifisyys kasvaimen vaiheen ennustuksen (kuvio 2B). Sulku rivi 200 voidaan käyttää erottamaan vähemmän kehittyneiden ryhmä kehittynyt ryhmästä. Ero oli merkitsevä kahden ryhmän välillä (Wilcoxonin summa testi kaksi ryhmää, P
= 0,017, kuvio 2A).
Koska eloonjääminen analyysi osoitti merkitsevästi erilainen ennuste mahasyöpäpotilaista eri syövän vaiheissa (kuvio 2C) , olemme analysoineet suhdetta S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrä ja elossaololuku. Potilaat ositettiin kynnysarvon osaksi korkea S100A9 solujen määrä (≥ 200) ryhmä ja alhainen S100A9 solumäärä (< 200) ryhmässä. 5 vuoden pysyvyys oli 44,6% suuren solumäärän ryhmässä vs. 22,5% alhaisen solumäärä ryhmä (P
= 0,021, kuvio 2D). Keskimääräinen elinaika oli 35,1 ± 10,8 kuukautta korkea solumäärä ryhmässä ja 20,3 ± 3,0 kuukautta matalan solumäärä ryhmä, vastaavasti. Yhdessä S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrä mahasyövän kudosta voidaan käyttää ennustaja erottaa alkuvaiheessa ja edennyt mahasyöpä kanssa cutoff 200 positiivisten solujen /HPF. Läsnäolo S100A9-positiivisten tulehdussolujen syöpäkudoksiin korreloi paremmin ennusteeseen potilailla, joilla on mahalaukun syövän.
Alhainen määrä S100A9-positiivisten tulehdussolujen syövän kudoksissa positiivisesti korreloi huonon kliinis-
Low S100A9 solujen määrää todettiin korreloivan kasvaimen invaasio syvyys (T vaihe), imusolmuke etäpesäke (N vaihe), ja kliininen TNM (P
= 0,011, 0,009 ja 0,002, tässä järjestyksessä). Korrelaatio S100A9 solujen määrän ja muita kliinisiä piirteitä, kuten sukupuoli, ikä, kasvaimen sijainti, maksa etäpesäke (M vaihe), verisuonten invaasio ja erilaistumista eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (kaikki P
> 0,05) (taulukko 1). Lisäksi monimuuttuja-analyysi osoitti N vaiheessa (P
= 0,006), maksan etäpesäke (P
= 0,000), ja S100A9 solujen määrä (P
= 0,046) olevan riippumaton tekijöitä ennustettaessa kokonaiselinaikaa (Taulukko 2 ) .table 1 liitto S100A9-positiivisten tulehdussolujen määrä syövän kudoksissa kanssa kliinis parametrit mahasyöpäpotilaista
muuttujat
Low S100A9 (positiivisia soluja < 200)
korkea S100A9 ( positiiviset solut > = 200)
P
arvo
Sex
0,125
Mies
74
50
Nainen
25
28
Ikä
0,089
< 50
32
18
50-59
24
12
60-69
33
33
> = 70
10
15
Kasvain sijainti
0,271
Cardia
26
15
Non-cardia
73
63
syvyys kasvain invaasio **
0,011
T1
3
2
T2
7
19
T3
69
42
T4
20
15
Imusolmuke etäpesäke
0,009
N0
13
23
N1
32
30
N2
32
17
N3
22
8
Maksan etäpesäkkeiden
0,571
Negative
89
68
Positiivinen
10
10
TNM
0,002
І
3
12
II
37
35
III
50
21
IV
9
10
Vascular invaasio
0,742
Negative
38
31
Positiivinen
58
43
Tietueita *
3
4
eriyttäminen **
0,472
No
2
4
Kohtalaisen + Huonosti
82
66
Muunlaiset
13
6
Ei määritetty
2
2
* tiedot puutteellisia.
** Fisherin testiä.
Taulukko 2 monimuuttuja-analyysi ennustavat tekijät eloonjäämisaste mahasyöpäpotilaista
Variations
P
RR
CI (95%)
Sex
0,671
1.106
,694-+1,765
Male vs. nainen
Ikä
0,179
1,148
0,938-1,405
< 50
50-59
60-69
> = 70
Kasvain sijainti
0,545
0,864
0,538-1,387
Cardia vs.
Non-cardia
erilaistuminen
0,301
0,751
0.437- 1.292
No versus kohtalaisen + huonosti
Imusolmuke etäpesäke
0,006
1,841
1,196-2,835
N0 + N1 versus N2 + N3
syvyys kasvaimen invaasion
0,1
1,756
0,897-3,435
T1 + T2 vs. T3 + T4
Maksan etäpesäkkeiden
0
3,461
2,002-5,983
Negative versus Positiivinen
Vascular invaasio
0,107
1,452
0,922-2,285
Negative versus positiivinen
S100A9-positiivisten tulehduksellisten solujen määrä
0,046
0,643
0,417-,991
< 200 versus > = 200
RR: suhteellinen riski; CI: n luottamusväli.
Ilmentymisen tila S100A8 ja S100A8 /A9-heterodimeeri mahasyövän kudoksissa ja gastriitti kudosten
Krooninen gastriitti on krooninen mahalaukun vaurio, patologisesti tunnusomaista epäspesifinen krooninen tulehdus mahalaukun limakalvon. Tulehdussolut krooninen gastriitti ovat morfologisesti kaltaisia ​​soluttautua ensisijainen mahasyövän kudoksiin. Joissakin tapauksissa, krooninen gastriitti edes voi johtaa mahasyöpä. Seuraavaksi tarkastellaan lähemmin ilmaisua S100A8, läheinen perheenjäsen S100A9 ja hetero- muoto S100A8 /A9 sekä mahasyövän kudosten ja viereisen ei-kasvain krooninen gastriitti kudosten mahasyövän yksilöt suorittamalla immunohistokemiallisesti. Samoin kuin kuvio S100A9, S100A8 ilmentyi yksinomaan tulehdussolujen tunkeutumisatmosfäärin sekä kasvainkudoksissa ja viereisten gastriitti kudoksiin. S100A8 ei ilmaistu kaikissa mahasyövässä solujen ja normaali mahan limakalvoa.
Seuraavaksi määrällisesti määrä S100A8-positiivisten tulehdussolujen kussakin kasvainkudoksessa aiemmin kuvatulla varten S100A9 (Additional tiedosto 1: Kuva S1). Yllättäen S100A8 solumäärien mahasyövän kudoksissa ei korreloinut useimmat kliinis-(Additional tiedosto 2: Taulukko S1) tai elossaololuku (Additional tiedosto 3: Kuva S2). Lisäksi ilmaus hetero- muodossa S100A8 /A9 ei havaittu missään tulehdussolujen tunkeutumisatmosfäärin mahasyövän kudoksissa, kun taas jotkut S100A8 /A9-positiiviset solut, jotka mainitaan krooninen gastriitti kudokset (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittivat, että jakelu S100A9, S100A8 ja S100A8 /A9 saattaa olla erilainen ihmisen mahasyövän ja krooninen gastriitti kudoksissa.
Vahvista Tämän hypoteesin, me tutki tarkemmin solunosasijaintia mallia S100A9, S100A8 ja S100A8 /A9-heterodimeeri ilmaisu suorittamalla immunofluorecence värjäys kudoksessa microarray lukien 23 tapausta mahasyövän ja 57 kroonista gastriitti. Mahasyövän kudoksissa, sekä S100A9 ja S100A8 proteiinit havaittiin kasvaimeen infiltroivien tulehdussolujen (kuvio 3A, B), kun taas mitään S100A8 /A9-heterodimeeri havaittiin missään tapauksessa (kuvio 3G). Expression of S100A8 ja S100A9 osittain limittäin solujen sytoplasmassa (kuvio 3D, E). Lisäksi S100A9 ja S100A8 proteiinit havaittiin tulehdussolujen kroonisen gastriitti (kuvio 3K, L). Jakautuminen näiden kahden proteiinin myös osittain limittäin (kuva 3 N, O). Yhdenmukainen tulokset Immunohistokemian S100A8 /A9 ei ollut esitetty mitään soluissa mahasyövän kudoksiin (kuvio 3G), kun taas ilmaus S100A8 /A9 osittain päällekkäinen S100A9 tulehdussolujen gastriitti kudosten (kuvio 3Q, S, T) . Ei ole yllättävää, ilmaisun ja jakelu S100A8 /A9 kroonisessa umpilisäke kudoksiin pahenemisen (positiivinen kontrolli) olivat paljon samanlaisia ​​kuin krooninen gastriitti kudoksissa (kuvio 3U, V, X, Y). Yhteenvetona todettakoon, että ero ilmaisun ja solunosasijaintia S100A9, S100A8 ja S100A8 /A9 eri kudoksissa voi sotkea niiden erilaisia ​​rooleja mahasyövän tai krooninen gastriitti ympäristössä. Kuva 3 Immunofluoresenssikoe kuvia S100A9, S100A8 ja S100A8 /A9 proteiineja kudosten microarray dioja sisältävä mahasyövän kudoksia (A-J) ja krooninen gastriitti kudoksissa (K-T), ja krooninen umpilisäke kudosten pahenemista (U-Y). S100A9 ja S100A8 havaittiin monoklonaalisella vasta-aineella, esimerkittyyn kanssa Zenon Alexa Fluor Mouse IgG Labeling Kit (jossa vihreä ja punainen fluoresenssi vastaavasti). Tuma värjättiin DAPI. S100A8 /A9 heterodimeerejä olivat havaittavissa käyttäen dimeeri-spesifistä vasta-ainetta 27E10 välillä BMA Biomedicalsin esimerkittyyn vihreillä fluoresenssi. Yhteistyössä lokalisointi S100A9 ja S100A8 tai S100A8 /A9 oli osoitti sulautunut kuvia (D, I, N, S, X) ja suurempien sulautunut kuvia (E, J, O, T, Y). Valkoinen nuoli 3 T osoittaa kolokalisaation S100A9 ja S100A8 /A9 krooninen gastriitti. Bar pituus, 50 pm.
Estovaikutus S100A9 rekombinanttiproteiinin maahanmuutosta ja hyökkäys mahasyövän solulinjojen in vitro
S100A9 proteiini ilmentyy ja erittävät tulehdussolujen, toimii välittäjänä akuutti ja krooninen tulehdus. Koska S100A9-positiivisten tulehduksellisten solujen määrä korreloi vähemmän aggressiivisia kliinis ominaisuudet, testasimme lisäksi suora estävä toiminto yhdistelmä-S100A9 maahanmuutto- ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja. Arvioidaan invasiivisia kyky mahalaukun syöpäsoluja, siirtokuoppaan määrityksiä käytettiin. Kaksi mahasyöpä solulinjoissa, AGS ja BGC-823, käsiteltiin seerumia tai väliaineessa, joka sisältää erilaisia ​​pitoisuuksia S100A9 rekombinanttiproteiinin (10, 20, 50 ja 100 ng /ml, vastaavasti). Invasiivisia solut laskettiin yhdeksällä satunnaisesti valitun mikroskooppikentäs- (200 x). Tulokset osoittivat, että S100A9 rekombinanttiproteiini hieman esti AGS soluinvaasiota (kuvio 4A), kun taas S100A9 estivät merkittävästi BGC-823 invaasio pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (P
< 0,05, kuvio 4C). Analysoida migrate kyky mahalaukun syövän solujen, suoritimme haavan paranemista määrityksessä. Molemmat solulinjat käsiteltiin seerumia tai alustassa, joka sisältää 100 ng /ml S100A9 rekombinanttiproteiini. Tulokset osoittivat, että S100A9 hieman esti AGS solujen vaeltamiseen (kuvio 4B), kun taas solu liikkumisetäisyyksiä BGC-823 soluja käsiteltiin S100A9 jälkeen 24 tunnin ja 48 tunnin inkuboinnin olivat merkittävästi alhaisemmat kuin kontrolli (P
< 0,05, Kuva 4D). Kuva 4 Vaikutus S100A9 rekombinanttiproteiinin hyökkäystä ja migraatio mahasyövän solulinjoissa. Vuonna transwell määrityksessä, AGS (A) ja BGC-823 (C) Soluja käsiteltiin seerumia tai alustassa, joka sisälsi 10, 20, 50 tai 100 ng /ml S100A9 rekombinanttiproteiini. Invasiivisia solut laskettiin sattumanvaraisesti yhdeksän valittujen mikroskooppikentäs- (200 x). Haavan paranemista määrityksessä, AGS (B) ja BGC-823 (D) soluja käsiteltiin seerumittomalla RPMI-1640-alustassa tai alustassa, joka sisältää 100 ng /ml S100A9 rekombinanttiproteiini. Kuvat otettiin vangiksi käänteisen faasikontrastimikroskoopissa 0 h, 24 h ja 48 h jälkeen haavoittaen. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± S.D. Näiden riippumattoman kokeen. P
arvo vs.
kontrolliryhmään.
Keskustelu
Ihmisen syöpä on krooninen sairaus, joka on peräisin transformoiduista soluista kätkeminen geneettinen sekä epigeneettiset muutokset. Kuitenkin, syöpä ei koostu pelkästään syöpäsoluja. Syöpäkudoksessa sisältää muita solutyyppejä, kuten fibroblasteja ja epiteelisoluja, immuunijärjestelmän solut ja solut, jotka muodostavat verisuonet ja imusuoniston [27]. Tässä monimutkaisessa kasvain microenvironment, tulehdusvälittäjiä säädellä eri kasvaimen kehitystä ja aloittamista, edistäminen, invaasio, ja etäpesäkkeiden [28].
S100A9, jäsen S100 perhe, on runsaasti granulosyytit, monosyytit ja aktivoitu keratinosyyttien aikana eri tulehdustiloja. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että S100A9 oli nimenomaan sijaitsee tulehdussolujen soluttautua mahasyövässä kudosten ja krooninen gastriitti kudoksissa, kun taas kaikki mahasyöpä soluja tai viereisten solujen mahan limakalvon ei ilmaissut S100A9. Tuloksemme samaa mieltä aikaisempien tutkimusten osoittavat korkea ilmentyminen S100A9 infiltroituvissa immuunisolujen eri syöpätyyppejä, mukaan lukien peräsuolen syöpä [21] ja haimasyövän [29]. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Tunnistaminen DNA metylaatiomuutokset liittyvät ihmisen mahasyöpä
• Karakterisointi ihmisen mahakarsinooman liittyviä metylaatio 9 miR CpG-saarekkeiden ja tukahduttaminen niiden ilmaisuja in vitro ja in vivo