Tilstedeværelse af S100A9-positive inflammatoriske celler i cancervæv korrelerer med en tidlig fase kræft og en bedre prognose hos patienter med gastrisk cancer

Tilstedeværelse af S100A9-positive inflammatoriske celler i cancervæv korrelerer med en tidlig fase kræft og en bedre prognose hos patienter med mavekræft
Abstract
Baggrund
S100A9 blev oprindelig opdaget som en faktor, der udskilles af inflammatoriske celler. For nylig blev S100A9 fundet at være associeret med adskillige humane maligniteter. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge S100A9 udtryk i mavekræft og udforske sin rolle i cancer progression.
Metoder
S100A9 udtryk i gastrisk vævsprøver fra 177 mavecancerpatienter blev vurderet ved immunhistokemi. Ekspressionen af ​​dens dimerisering partner S100A8 og S100A8 /A9 heterodimer blev også vurderet ved den samme metode. Effekten af ​​eksogen S100A9 på motilitet af mavekræft celler AGS og BGC-823 blev derefter undersøgt.
Resultater
S100A9 specifikt udtrykt af inflammatoriske celler såsom makrofager og neutrofiler i humane gastrisk kræft og gastritis væv. Statistisk analyse viste, at en høj S100A9 celletal (> = 200) pr 200x forstørrelse mikroskopisk felt i kræft væv var prædiktiv for tidligt mavekræft. Høj S100A9-positive celletal var negativt korreleret med lymfeknude metastaser (P
= 0,009) og tumor invasion (P
= 0,011). S100A9 blev identificeret som en selvstændig prognostisk indikator for samlet overlevelse af patienter med gastrisk cancer (P
= 0,04). Patienter med højt S100A9 celletal var med gunstige prognose (P
= 0,021). Yderligere undersøgelser viste, at S100A8 fordeling i humane mavekræft væv lignede S100A9. Men antallet af S100A8-positive celler ikke positivt korrelerer med patientens overlevelse. De inflammatoriske celler infiltrerer kræft var S100A8 /A9 negativ, mens de i gastritis var positive. Desuden eksogene S100A9 protein hæmmede migration og invasion af gastriske kræftceller.
Konklusioner
Vores resultater foreslog S100A9-positive inflammatoriske celler i mavens kræft væv er forbundet med tidlig fase af mavekræft og god prognose.
Keywords
mavekræft S100A9 Inflammatoriske celler Tumor mellemstationer Survival Baggrund
mavekræft er en af ​​hovedårsagerne til dødelighed af kræft på verdensplan. blev anslået i alt 989,600 nye tilfælde mavekræft og 738.000 dødsfald at have fundet sted i 2008, og over 70% af nye tilfælde og dødsfald sker i udviklingslande som Kina [1]. Mavekræft er almindeligt opdages på fremskredne stadier, når prognostiske udfald er fattige. Næsten 70-80% af patienterne har inddragelse af regionale lymfeknuder, som har en stor indflydelse på overlevelse [2, 3]. Derfor opdagelsen af ​​nye biomarkører medvirken i tidlig opsporing og nøjagtig forudsigelse af tumor adfærd kunne forbedre patientens overlevelse [4-6].
Medlemmer af S100 familie af proteiner dukker op som biomarkører i flere typer af tumorer [7]. Den S100 familiemedlem S100A9 er en 13kd protein, der indeholder bevarede strukturelle motiver, der består af to EF-hand Ca 2 + -bindende domæner. Efter calciumbindende, S100A9 interagerer med en anden S100 familiemedlem S100A8 at danne den funktionelle heterodimer kaldet calprotectin [8, 9]. S100A9 blev oprindeligt identificeret som en faktor, der udskilles af inflammatoriske celler, såsom neutrofiler og makrofager i reumatoid arthritis, inflammatorisk tarmsygdom og andre inflammatoriske sygdomme [10-14]. S100A9, S100A8, samt S100A8 /A9 heterodimer calprotectin, overudtrykkes under inflammation-induceret carcinogenese [15]. S100A9 ekspression opreguleres i tumorceller i lungen [16], prostata [17], og brystcancer [18, 19], mens den er nedreguleret i humane esophageal cancer celler [20]. I kolorektale cancer vævsprøver imidlertid S100A9 proteinet blev ikke påvist i cancerceller, men snarere i inflammatoriske celler spredt i hele tumoren stroma [21]. Desuden S100A9 var signifikant højere i afføringsprøver af kolorektal kræftpatienter end hos kontroller [22]. I mavekræft, genekspression og proteomisk analyse viste høj ekspression af S100A9 i vævet. [23, 24]. Men dens fordeling i vævet og samarbejde med klinisk-patologiske funktioner blev ikke fuldt demonstreret.
I denne undersøgelse brugte vi genekspression analyse at sammenligne S100A9 udtryk i gastrisk kræft væv og i de tilstødende, angiveligt normale væv. Immunohistokemisk farvning afslørede S100A9 i tumorassocierede inflammatoriske celler. Desuden har vi rettet sammenhængen mellem antallet af S100A9-positive celler i tumorvæv og klinisk-patologiske træk. Vi drøftede også co-lokalisering af S100A9 og S100A8 samt lokaliseringen af ​​dimer calprotectin ved immunfluorescens. Endelig, for at få indsigt i funktionen af ​​S100A9 i kræftceller, undersøgte vi effekten af ​​det rekombinante S100A9 protein om migration og invasion af mavekræft celler AGS og BGC-823.
Metoder
Patienter og vævsprøver
Denne undersøgelse blev udført efter godkendelse fra etisk Komité Peking University Cancer Hospital. Informeret samtykke blev opnået fra hver patient. Et hundrede syvtiseks patienter med gastrisk cancer blev undersøgt. 124 mænd og 53 kvinder (gennemsnitsalder, 57 år, interval, 26-80 år) blev diagnosticeret og kirurgisk behandlet i Peking University Cancer Hospital mellem 1998 og 2004. Dybden af ​​tumor invasion, histologisk klasse, lymfeknude metastaser, levermetastaser, og vaskulær invasion blev indhentet fra kliniske og histopatologiske rapporter. Stage af mavekræft blev klassificeret i henhold til den 7. udgave tumor-node metastase (TNM) klassificering anbefales af amerikanske Blandede kræft. Ingen af ​​patienterne modtog kemoterapi eller strålebehandling præoperativt. Alle patienter blev fulgt op til januar 2010. Efter gastrektomi, blev en del af resektion prøve fikseret i 10% formalin og bearbejdes rutinemæssigt til patologisk vurdering, og en anden var lynfrosset i flydende nitrogen lagret ved -80 ° C i RNA-ekstraktion. Desuden blev 30 matchede metastatiske lymfeknuder også indsamlet fra disse patienter. Ti tilfælde af kronisk blindtarmsbetændelse væv med forværring blev leveret af Institut for Almen Kirurgi, blev den tilknyttede hospital Qingdao University Medical College.
Immunhistokemi (IHC)
Fire-mikrometer sektioner fra formalin-fikseret paraffinindstøbte væv monteret på poly-L-lysin-coatede objektglas og derefter afparaffiniseret i xylen og rehydreret gennem alkohol til destilleret vand. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter trykkogning objektglassene i 10 mmol /l EDTA (pH 8,0) i 3 minutter, blev sektionerne inkuberet med 5% gedeserum, derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med muse-anti-S100A9 antistof (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Schweiz), eller muse-anti-S100A8 antistof (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), eller muse-anti-S100A8 /A9-antistof (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Primære antistoffer blev påvist under anvendelse af en to-trins EnVision System (Dako, Glostrup, Danmark). Peberrodsperoxidase og diaminobenzedene hydrochlorid (DAB) var enzym og kromogen anvendes. Angivelse af S100A9, S100A8 og S100A8 /A9 blev også påvist i Cybrdi væv microarray dias (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, Kina), der indeholder kronisk gastritis med metaplasi (57 tilfælde) og gastrisk karcinom væv (23 tilfælde). Ti tilfælde af kronisk blindtarmsbetændelse prøver med eksacerbation blev serveret som positiv kontrol for S100A8 /A9.
IHC vurdering og cut-off definition
S100A9 og S100A8 blev farvet i de inflammatoriske celler, såsom makrofager og neutrofiler infiltrerer tumorvæv. Positive celler viste en variabel grad af cytoplasmatisk farvning. Billeder blev erhvervet ved hjælp ARIOL billedanalysesystem (Applied Imaging, San Jose, CA, USA). Scanneren er baseret på et Olympus BX61 mikroskop med en motoriseret scene og autofokus kapaciteter er udstyret med et kamera. Slides blev scannet ved 200 × forstørrelse. Graden af ​​monoklonalt S100A9 eller S100A8 antistofreaktivitet i hvert vævssnit blev vurderet ved at tælle antallet af farvede inflammatoriske celler i tre 200 × forstørrelse scopes. Dette blev udført af to uafhængige patologer ved hjælp af et automatisk mikroskop systemet og billedbehandling software (se Yderligere fil 1: Figur S1). Cut-off værdien af ​​S100A9 farvede inflammatoriske celler til forudsigelse af patientens patologisk etape blev bestemt ved modtageren opererer karakteristik (ROC) kurve.
Laser konfokal scanning
At undersøge co-lokalisering af S100A9 og dens dimerisering partner S100A8, eller heterodimeren S100A8 /A9, de Cybrdi tissue microarray slides (IC00-01-001) blev inkuberet 1,5 timer ved stuetemperatur med muse-anti-S100A9 antistof (1: 200) pre-mærket med Zenon Alexa Fluor 647 Mouse IgG Labeling Kit (Z-25008, rød fluorescens), og enten anti-S100A8 antistof (1: 200) eller anti-S100A8 /A9-antistof (1: 200) pre-mærket med Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG Labeling Kit (Z-25002 , grøn fluorescens). Konfokal billeder blev erhvervet ved hjælp af Leica TCS SP5 konfokal mikroskop (Leica, Mannheim, Tyskland). . Desuden blev kernerne modfarvet med DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA), excitation ved 358 nm
Enheder af kroniske blindtarmsbetændelse væv med forværring inkuberet med anti-S100A9 antistof (1: 200, rød fluorescens mærket), og anti-S100A8 /A9 antistof. (1: 200, mærket grøn fluorescens) som en positiv kontrol for det specifikke S100A8 /A9 heterodimer ekspression
Cellekultur
Begge cellelinier i denne undersøgelse er tidligere profileret ved microarray analyse og blev regelmæssigt kontrolleres ved hjælp af STR-analyse (kort tandem repeat DNA fingeraftryk) [25]. Gastrisk cancer cellelinje AGS blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), og cellelinie BGC-823 blev etableret i Kina og fremstillet af Cell Research Institute, Shanghai, Kina. Cancerceller blev rutinemæssigt dyrket som et monolag i RPMI-1640 medium (GIBCO BRL, Carlsbad, CA), suppleret med 10% (v /v) føtalt kalveserum (FCS, GIBCO) og antibiotika ved 37 ° C i en befugtet 5% CO 2 atmosfære.
Cell invasion assay
CytoSelect 24-Well Cell invasion assay kit blev købt fra Cell Biolabs, USA. S100A9 rekombinant protein blev købt fra BMA Biomedicals, Schweiz. Celleinvasion assays blev udført med Transwell skær, som tillader celler at migrere gennem en 8 um porestørrelse polycarbonatmembran. Den øvre overflade af indsatsen membran blev belagt med et ensartet lag af tørret basalmembranmatrix opløsning. Cellerne blev resuspenderet i serum-frit medium blev udpladet i det øvre kammer af hver Transwell med en tæthed på 10 6 celler /ml (200 pl /kammer). S100A9 rekombinant protein blev tilsat til det øvre kammer medium ved 0, 10, 20, 50 eller 100 ng /ml. Den nederste kammer blev fyldt med 500 pi medium indeholdende 10% FCS. Cellerne fik lov til at migrere i 48 timer ved 37 ° C. Celler, der forblev i det øvre kammer blev fjernet med en vatpind, og celler, der var trængt til undersiden af ​​membranen blev farvet i Cell farveopløsning i 15 minutter og talt i ni tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter (200 ×) per brønd . Hver insert blev derefter overført til en tom brønd og inkuberet i 200 gi Extraction Solution. Efter 10 minutter blev 100 pi opløsning fra hver prøve overført til en 96-brønds mikrotiterplade og målt i en pladelæser ved OD560nm.
Cellemigrationsassay
Cell mobilitet blev vurderet ved anvendelse af en sårhelende assay. Celler blev podet i seks-brønds vævskulturskåle og dyrkes indtil sammenflydning at få et cellemonolag, der derefter blev såret anvendelse af sterile 200 pi pipettespidser. Enhver cellerester blev fjernet ved vask med PBS. De sårede monolag Cellen blev derefter inkuberet i medium med 100 ng /ml S100A9 rekombinant protein. Kontrolceller blev behandlet med serum-frit RPMI-1640 medium. Time-lapse billeder blev taget med et omvendt fase-kontrast mikroskop ved 200 × forstørrelse for 0, 24, og 48 timer. Cellen migration evne blev vurderet ved at beregne den gennemsnitlige afstand celle migration.
Statistisk analyse
Clinicopathologic variabler blev udvundet fra kliniske og histopatologiske rapporter. ROC kurver blev anvendt til fastsættelse af cut-off værdi af S100A9-positive inflammatorisk celletal evaluere patologisk TNM stadie. Foreningen af ​​S100A9-positive inflammatorisk celletal med forskellige TNM stadier blev udført med Wilcoxon rank-sum test. For at opnå associationer mellem S100A9 eller S100A8 celletal og clinicopathologic variabler, data var cross-tabelform og en χ
2 test blev udført. Kumulativ overlevelse blev estimeret med Kaplan-Meier-metoden, og sammenligninger mellem grupper blev udført med en log-rank test. Samlet overlevelse blev målt fra tidspunktet for den første operation til dødsdato, tælle død uanset årsag som slutpunktet, eller den sidste dag af oplysninger som slutpunktet, hvis ingen omstændigheder blev dokumenteret. En multivariat analyse af Cox proportional hazards regressionsmodellen (bagud, trinvis) blev oprettet for at vurdere indflydelsen af ​​hver variabel på overlevelse. Signifikans blev fastsat til P
< 0.05.
Resultater
Ekspression af S100A9 i infiltrerende inflammatoriske celler i mavekræft og kronisk gastritis væv
I en tidligere gen array analyse, fandt vi, at mavekræft væv blev adskilt fra tilstødende noncancerous slimhinde ved karakteristiske forskelle i deres genekspressionsmønstre [26]. Mangfoldigheden af ​​genekspressionsmønstre kan afspejle variationen i de iboende egenskaber i tumorceller og normale celler samt variation i den cellulære sammensætning af disse komplekse væv. Inden for disse gener, ekspressionen af ​​S100A9 i gastrisk cancer væv var højere end for matchede hosliggende noncancerous mucosa (P
= 0,00241, figur 1A). Figur 1 Ekspression af S100A9 i gastrisk cancer og tilstødende ikke-kræft væv. (A) Forskellige udtryk værdi S100A9 i 72 mavekræft væv og parret ikke-kræft væv ved at analysere data fra Illumina Sentrix BeadChip cDNA microarray. (B-E) immunhistokemisk farvning af S100A9 i gastrisk cancer væv (B) metastatiske lymfeknuder (C), kronisk gastritis (D), og tilstødende ikke-kræft gastrisk mucosa (E). S100A9 lokalisering blev afsløret som brun eller rød granulerede loci i cytoplasmaet i infiltrerende inflammatoriske celler, især i mononukleære fagocytter og neutrofile granulocytter. (Forstørrelse 200 ×).
Immunhistokemi af prøver fra 177 mavecancerpatienter viste, at S100A9 var positiv i alle primære kræft væv med immunfarvning eksklusivt beliggende i inflammatoriske celler, såsom makrofager og neutrofiler infiltrerer primære tumorvæv (De forskellige celletyper i væv prøver blev identificeret ved to uafhængige patologer) (figur 1B). Alle undersøgte metastatiske lymfeknuder (n = 30) var også positive for S100A9 med immunfarvning eksklusivt beliggende i inflammatoriske celler omgiver metastatisk kræft væv (Figur 1C). I tilstødende ikke-kræft mucosa, blev S100A9 udtrykt i inflammatoriske celler infiltrerer gastritis. Maveslimhinden havde negativ eller meget svag S100A9 udtryk (figur 1D, E).
S100A9-positive inflammatorisk celletal i cancer væv er forbundet med kræft scene og patient overlevelse
For at vurdere omfanget af S100A9 udtryk gastrisk kræft- associeret miljø, blev antallet af S100A9-positive inflammatoriske celler i hver tumorvæv målt ved midling af celletal på tre felter (oprindelig forstørrelse, 200 ×) i området med det største antal positive celler på stedet for dybeste tumorinvasion. Sammenhæng mellem celletal og klinisk-patologiske parametre og patient overlevelse blev analyseret ved hjælp af Wilcoxon rank-sum test og Kaplan-Meier-metoden. Som vist i figur 2A, gradvis nedsættelse af S100A9-positive inflammatorisk celletal i cancer væv var forbundet med stigningen i tumor patologisk etape fra I-IV (Wilcoxon rank sum test for 4 faser, P
= 0,0265). Figur 2 High S100A9 celletal i kræftvæv indikerer bedre resultat i gastrisk kræftpatienter. (A) Scatter plot af S100A9-positive inflammatorisk celletal i hvert patologisk TNM stadie. Den blå linje angiver niveauet af 200. (B) ROC kurve af S100A9 celletal til forudsigelse af patologisk TNM stadie. Pil angivet cutoff punkt om 200. (C) Kaplan-Meier analyse af den samlede overlevelse for hver patologisk TNM stadie. (D) Kaplan-Meier analyse af den samlede overlevelse for høj S100A9 celletal (≥ 200) gruppe og lav S100A9 celletal (< 200) gruppe. (Kun 176 patienter blev inkluderet i analysen for én patient tabte til opfølgning).
Derefter testede vi forudsigelse magt S100A9 celletal for tumor etape i mavekræft. Baseret på TNM stadie, blev patienterne inddelt i to grupper, mindre avanceret gruppe (stadium I + II) og avancerede gruppe (fase III + IV). Areal under kurven (AUC) opnået fra modtageren driver karakteristiske (ROC) kurver ved hjælp af S100A9-positive inflammatoriske celler tæller var 0,623 for patologiske TNM etaper. Cutoff-værdien var 198,5 (vi brugte 200 i den følgende analyse) pr 200 × forstørrelse felt med 64,3% følsomhed og 61,9% specificitet for tumor fase forudsigelse (figur 2B). Cutoff linje 200 kan anvendes til at adskille mindre avanceret gruppe fra den avancerede gruppe. Forskellen var signifikant mellem de to grupper (Wilcoxon rank sum test for to grupper, P
= 0,017, figur 2A).
Eftersom overlevelse analyse viste signifikant forskellig prognose for mavecancerpatienter i forskellige kræft faser (figur 2C) vi analyserede forholdet mellem S100A9-positive inflammatoriske celler tæller og patient overlevelsesrate. Patienterne blev stratificeret efter cutoff værdi i høj S100A9 celletal (≥ 200) gruppe og lav S100A9 celletal (< 200) gruppe. 5-årige overlevelsesrate var 44,6% i høj celletal versus 22,5% i lav celletal (P
= 0,021, figur 2D). Median overlevelsestid var 35,1 ± 10,8 måneder til den høje celletal gruppe og 20,3 ± 3,0 måneder for den lave celletal-gruppen. Tilsammen kan S100A9-positive inflammatorisk celletal i gastrisk cancer væv anvendes som en indikator for at skelne tidligt stadium og fremskreden mavekræft med afskæring på 200 positive celler /HPF. Tilstedeværelse af S100A9-positive inflammatoriske celler i kræft væv korrelerer med en bedre prognose hos patienter med mavekræft.
Lavt antal S100A9-positive inflammatoriske celler i kræft væv positivt korrelerer med dårlige klinisk-patologiske træk
Low S100A9 celletal blev fundet at være korreleret med tumor invasion dybde (T etape), lymfeknude metastaser (N etape), og klinisk TNM stadie (P
= 0,011, 0,009, og 0,002 henholdsvis). Sammenhæng mellem S100A9 celletal og andre kliniske funktioner såsom køn, alder, tumor placering, levermetastaser (M etape), vaskulær invasion og differentiering var ikke statistisk signifikant (alle P
> 0,05) (tabel 1). Derudover multivariat analyse demonstrerede N etape (P
= 0,006), levermetastaser (P
= 0,000), og S100A9 celletal (P
= 0,046) til at være uafhængige faktorer forudsige samlet overlevelse (tabel 2 ) .table en sammenslutning af S100A9-positive inflammatorisk celletal i kræft væv med klinisk-patologiske parametre i gastrisk kræftpatienter
Variabler
Low S100A9 (positive celler < 200)
High S100A9 ( positive celler > = 200)
P Drømmeholdet værdi
Sex
0,125
Mand
74
50
Female
25
28
Age
0,089
< 50
32
18
50-59
24
12
60-69
33
33
> = 70
10
15
Tumor placering
0,271
Cardia
26
15
Ikke-mavemunden
73
63
dybde tumor invasion **
0,011
T1
3
2
T2
7
19
T3
69
42
T4
20
15
lymfeknudemetastase
0,009
n0
13
23
N1
32
30
N2
32
17
N3
22
8
levermetastaser
0,571
Negativ
89
68
Positiv
10
10
TNM stadie
0,002
І
3
12
II
37
35
III
50
21
IV
9
10
Vaskulær invasion
0,742
Negativ
38
31
Positiv
58
43
Ikke registreret *
3
4
Differentiering **
0,472
Nå
2
4
Moderat + Dårligt
82
66
Andre typer
13
6
Ikke bestemt
2
2
* Dataene ufuldstændig.
** Fishers eksakte test.
tabel 2 Multivariate analyse af prognostiske faktorer for samlet overlevelse af gastriske kræftpatienters
Variationer
P
RR
CI (95%)
Sex
0,671
1,106
0,694-1,765
Mand versus kvindelige
Alder
0,179
1,148
0,938-1,405
< 50
50-59
60-69
> = 70
Tumor placering
0,545
0,864
0,538-1,387
Cardia vs.
Ikke-mavemunden
Differentiering
0,301
0,751
0.437- 1,292
Nå versus moderat + dårligt
Lymfeknude metastaser
0,006
1,841
1,196-2,835
n0 + N1 versus N2 + N3
Dybde tumor invasion
0,1
1,756
0,897-3,435
T1 + T2 versus T3 + T4
levermetastaser
0
3,461
2,002-5,983
Negativ versus Positiv
Vaskulær invasion
0,107
1,452
0,922-2,285
Negativ versus positiv
S100A9-positive inflammatorisk celletal
0,046
0,643
0,417-,991
< 200 versus > = 200
RR: relativ risiko; CI:. Konfidensinterval
Ekspressionen status S100A8 og S100A8 /A9 heterodimer i gastrisk cancer væv og gastritis væv
Kronisk gastritis er en kronisk gastrisk læsion, patologisk karakteriseret ved ikke-specifik kronisk inflammation af mavens slimhinde. De inflammatoriske celler i kronisk gastritis er morfologisk som dem infiltrerer primære mavekræft væv. I nogle tilfælde, kronisk gastritis selv kan føre til mavekræft. Dernæst vi yderligere undersøgt ekspressionen af ​​S100A8, et nært familiemedlem af S100A9 og heterodimeriseringen formularen S100A8 /A9 i både gastrisk kræft væv og tilstødende ikke-tumor kronisk gastritis væv i mavens kræft prøver ved at udføre immunhistokemi. I lighed med mønstret af S100A9 blev S100A8 udelukkende udtrykt i inflammatoriske celler infiltrerer både tumorvæv og tilstødende gastritis væv. . S100A8 blev ikke udtrykkes i alle gastriske kræftceller og normale maveslimhinden
Dernæst vi kvantificeret antallet af S100A8-positive inflammatoriske celler i hver tumorvæv som beskrevet tidligere for S100A9 (Yderligere fil 1: Figur S1). Overraskende, havde S100A8 celletal i mavekræft væv ikke korrelerer med de fleste af klinisk-patologiske træk (Yderligere fil 2: Tabel S1) eller patient overlevelse (Yderligere fil 3: Figur S2). Endvidere ekspression af heterodimerisering formular S100A8 /A9 blev ikke påvist i nogen inflammatoriske celler infiltrerer gastrisk cancer væv, mens nogle S100A8 /A9-positive celler blev identificeret i de kronisk gastritis væv (data ikke vist). Disse data viste, at fordelingen af ​​S100A9, S100A8 og S100A8 /A9 kan være forskellige i human gastrisk cancer og kroniske gastritis væv.
At bekræfte denne hypotese, vi yderligere undersøgt subcellulære lokalisering mønster af S100A9, S100A8 og S100A8 /A9 heterodimer udtryk ved at udføre immunofluorecence farvning i et væv microarray herunder 23 tilfælde af mavekræft og 57 tilfælde af kronisk gastritis. I mavekræft væv, blev både S100A9 og S100A8 proteiner påvist i tumorinfiltrerende inflammatoriske celler (figur 3A, B), medens ingen S100A8 /A9 heterodimer blev fundet i nogen tilfælde (figur 3G). Ekspression af S100A8 og S100A9 delvist overlappet i cellers cytoplasma (fig 3D, E). Derudover blev S100A9 og S100A8 proteiner detekteret i inflammatoriske celler i kronisk gastritis (figur 3K, L). Fordelingen af ​​disse to proteiner også delvist overlappet (Figur 3N, O). I overensstemmelse med resultaterne af immunhistokemi blev S100A8 /A9 ikke udtrykkes i nogen celler af gastrisk cancer væv (figur 3G), mens ekspression af S100A8 /A9 delvist overlappet med S100A9 i inflammatoriske celler af gastritis væv (figur 3Q, S, T) . Overraskende, ekspression og distribution af S100A8 /A9 i kroniske blindtarmsbetændelse væv med eksacerbation (den positive kontrol) var meget ens dem i kronisk gastritis væv (figur 3U, V, X, Y). Tilsammen kan differentialet udtryk og subcellulære lokalisering af S100A9, S100A8 og S100A8 /A9 i forskellige væv inddrage deres forskellige roller i gastrisk kræft eller kronisk gastritis miljø. Figur 3 Immunofluorescens billeder af S100A9, S100A8 og S100A8 /A9 proteiner i væv microarray objektglas indeholdende gastrisk cancer væv (A-J) og kronisk gastritis væv (K-T), og kroniske blindtarmsbetændelse væv med eksacerbation (U-Y). S100A9 og S100A8 blev påvist ved monoklonalt antistof, prelabeled med Zenon Alexa Fluor Mouse IgG Labeling Kit (med grøn og rød fluorescens henholdsvis). Kernen blev farvet med DAPI. S100A8 /A9 heterodimerer var påviselige ved hjælp af dimer-specifikt antistof 27E10 fra BMA Biomedicals prelabeled med grøn fluorescens. Den co-lokalisering af S100A9 og S100A8 eller S100A8 /A9 blev vist i flettede billeder (D, I, N, S, X) og større fusionerede billeder (E, J, O, T, Y). Hvid pil i tre T viser co-lokalisering af S100A9 og S100A8 /A9 i kronisk gastritis. Bar længde, 50 um.
Hæmmende effekt af S100A9 rekombinant protein om migration og invasion af gastrisk kræft cellelinjer in vitro
S100A9 protein udtrykt i og udskilles af inflammatoriske celler, der tjener som mægler i akutte og kronisk inflammation. Siden S100A9-positive inflammatorisk celletal korreleret med mindre aggressive klinisk-patologiske karakteristika, vi yderligere testet den direkte hæmmende funktion af rekombinant S100A9 på migration og invasion af gastriske kræftceller. Til bedømmelse invasiv evne gastriske cancerceller, blev transwell assays anvendes. To gastriske cancercellelinjer, AGS og BGC-823, blev behandlet med serumfrit medium eller medium indeholdende forskellige koncentrationer af S100A9 rekombinant protein (10, 20, 50 og 100 ng /ml). Invasive celler blev talt i ni tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter (200 ×). Resultaterne viste, at S100A9 rekombinant protein let inhiberet AGS celleinvasion (figur 4A), mens S100A9 signifikant hæmmet BGC-823 invasion i en koncentrationsafhængig måde (P
< 0,05, figur 4C). For at analysere migrate evne gastriske cancerceller, udførte vi den sårhelende assay. Begge cellelinier blev behandlet med serumfrit medium eller medium indeholdende 100 ng /ml S100A9 rekombinant protein. Resultaterne viste, at S100A9 lidt inhiberede AGS cellevandring (figur 4B), mens cellemigration afstande på BGC-823 celler behandlet med S100A9 efter 24 timer og 48 timers inkubation var signifikant lavere end kontrol (P
< 0,05, figur 4D). Figur 4 Virkning af S100A9 rekombinant protein på invasion og migration af gastriske cancercellelinier. I Transwell assay blev AGS (A) og BGC-823 (C) -celler behandlet med serumfrit medium eller medium indeholdende 10, 20, 50 eller 100 ng /ml S100A9 rekombinant protein. Invasive celler blev talt i tilfældigt ni udvalgte mikroskopiske felter (200 ×). Ved sårheling assay blev AGS (B) og BGC-823 (D) celler behandlet med serum-frit RPMI-1640 medium eller medium indeholdende 100 ng /ml S100A9 rekombinant protein. Billeder blev taget til fange af en inverteret fasekontrastmikroskop ved 0 t, 24 timer og 48 timer efter sårede. Der blev udført tre uafhængige forsøg. Resultater blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. af disse uafhængige forsøg. P Drømmeholdet værdi vs.
kontrolgruppen.
Diskussion
menneskelige kræft er en kronisk sygdom, der stammer fra transformerede celler huser genetiske såvel som epigenetiske ændringer. Imidlertid er kræft ikke udelukkende består af cancerceller. Kræftvæv indeholder andre celletyper, herunder fibroblaster og epitelceller, immunceller og celler danner blodkar og lymfatiske kar [27]. I denne komplekse tumor mikromiljø, inflammatoriske mediatorer regulerer forskellige stadier af tumor udvikling, herunder initiering, promotion, invasion, og metastase [28].
S100A9, et medlem af S100 familie, er rigeligt i granulocytter, monocytter og aktiverede keratinocytter under forskellige inflammatoriske tilstande. I denne undersøgelse fandt vi, at S100A9 specifikt var placeret i inflammatoriske celler infiltrerer gastrisk cancer væv og kronisk gastritis væv, mens alle gastriske cancerceller eller tilstødende celler af maveslimhinden ikke udtrykte S100A9. Vores resultater er enig med tidligere undersøgelser viser høj ekspression af S100A9 i infiltrerende immunceller i forskellige cancertyper, herunder kolorektal cancer [21] og bugspytkirtelkræft [29]. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Identifikation af DNA methylering ændringer forbundet med human gastrisk cancer
• Karakterisering af human gastrisk karcinom-relaterede methylering af 9 miR CpG øer og undertrykkelse af deres udtryk in vitro og in vivo