Vorhandensein von S100A9-positive Entzündungszellen in Krebsgewebe korreliert mit einem frühen Stadium von Krebs und einer besseren Prognose bei Patienten mit Magenkrebs

Vorhandensein von S100A9-positive Entzündungszellen in Krebsgewebe korreliert mit einem frühen Stadium von Krebs und einer besseren Prognose bei Patienten mit Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
S100A9 wurde ursprünglich als ein Faktor von Entzündungszellen sezerniert entdeckt. Kürzlich wurde gefunden, S100A9 mit einigen menschlichen Malignitäten assoziiert. Das Ziel dieser Studie ist S100A9 Ausdruck bei Magenkrebs und erforschen ihre Rolle bei der Krebsprogression.
Methoden
S100A9 Expression im Magen-Gewebeproben von 177 Patienten mit Magenkrebs durch Immunhistochemie bewertet wurde, zu untersuchen. Der Ausdruck seiner Dimerisierungspartner S100A8 und S100A8 die /A9 Heterodimer wurden ebenfalls nach dem gleichen Verfahren bewertet. Die Wirkung von exogenen S100A9 auf die Motilität des Magen-Krebszellen AGS und BGC-823 wurde dann untersucht.
Ergebnisse
S100A9 spezifisch von Entzündungszellen wie Makrophagen und Neutrophilen in menschlichen Magenkrebs und Gastritis Geweben exprimiert wurde. Die statistische Analyse zeigte, dass eine hohe S100A9-Zellzahl (> = 200) pro 200-facher Vergrößerung mikroskopisch kleinen Bereich in Krebsgewebe war prädiktiv für frühen Stadium Magenkrebs. Hohe S100A9-positive Zellzahl wurde negativ mit Lymphknotenmetastasen (P
= 0,009) und Tumorinvasion (P
= 0,011) korreliert. S100A9 wurde als unabhängiger prognostischer Prädiktor für das Gesamtüberleben von Patienten mit Magenkrebs (P
= 0,04) identifiziert. Patienten mit hohem S100A9-Zellzahl waren mit günstiger Prognose (P
= 0,021). Weitere Untersuchungen haben festgestellt, dass S100A8 Verteilung in menschlichen Magenkrebsgewebe war ähnlich wie S100A9. Allerdings hat die Zahl der S100A8-positiven Zellen nicht positiv mit dem Überleben der Patienten korrelieren. Die Entzündungszellen Krebs infiltriert waren S100A8 /A9 negativ, während die in Gastritis positiv waren. Darüber hinaus exogene Protein S100A9 gehemmt Migration und Invasion von Magenkrebszellen.
Schlussfolgerungen
Unsere Ergebnisse lassen vermuten, S100A9-positive Entzündungszellen in Magenkrebsgewebe mit frühen Stadium von Magenkrebs und eine gute Prognose assoziiert sind.
Keywords
Magenkrebs S100A9 Tumor Entzündungszellen Überleben hintergrund und Magenkrebs Staging ist eine der führenden Ursachen von Krebssterblichkeit weltweit. Insgesamt 989.600 neue Magenkrebsfälle und 738.000 Todesfälle geschätzt wurden im Jahr 2008 stattgefunden haben, und über 70% der neuen Fälle und Todesfälle ereignen sich in Entwicklungsländern wie China [1]. Magenkrebs ist im fortgeschrittenen Stadium häufig erkannt, wenn sie prognostische Ergebnisse schlecht sind. Fast 70-80% der Patienten haben Beteiligung der regionalen Lymphknoten, die einen starken Einfluss auf das Überleben hat [2, 3]. Daher Entdeckung neuer Biomarker bei der Früherkennung und genaue Vorhersage des Tumorverhaltens Unterstützung könnte das Überleben der Patienten zu verbessern [4-6].
Mitglieder der S100-Familie von Proteinen als Biomarker in verschiedenen Arten von Tumoren entstehen [7]. Das S100 Familienmitglied S100A9 ist ein 13 kD Protein, das konservierten Strukturmotive enthält, bestehend aus zwei EF-Hand Ca 2 + -bindende Domänen. Nach der Calciumbindung interagiert S100A9 mit einem anderen Familienmitglied S100 S100A8 die funktionelle Heterodimer genannt Calprotectin zu bilden [8, 9]. S100A9 wurde ursprünglich als ein Faktor sezerniert durch Entzündungszellen, wie Neutrophilen und Makrophagen in rheumatoider Arthritis, entzündlicher Darmerkrankung identifiziert und andere Entzündungserkrankungen [10-14]. S100A9, S100A8, sowie die S100A8 /A9 Heterodimer Calprotectin werden während der Entzündung induzierten Karzinogenese überexprimiert [15]. S100A9 Expression hochreguliert wird in Tumorzellen in der Lunge [16], der Prostata [17], und Brustkrebs [18, 19], während es nach unten reguliert in menschlichen Zellen Speiseröhrenkrebs [20]. In Kolorektalkrebs Gewebeproben, jedoch wurde die S100A9-Protein nicht in Krebszellen detektiert, sondern in Entzündungszellen im ganzen Tumorstroma gestreut [21]. Zusätzlich wurde S100A9 signifikant höher in Stuhlproben von Darmkrebs-Patienten als in der Kontrollgruppe [22]. In Magenkrebs, Genexpression und Proteomik-Analyse zeigte eine hohe Expression von S100A9 im Gewebe. [23, 24]. ihre Verteilung innerhalb des Gewebes und die Assoziation mit klinisch-pathologischen Eigenschaften wurden jedoch nicht in vollem Umfang nachgewiesen. In dieser Studie
verwendeten wir die Genexpressionsanalyse S100A9 Expression in Magenkrebsgewebe und in den benachbarten, angeblich normalen Geweben zu vergleichen. Immunhistochemische Färbung S100A9 in Tumor-assoziierten Entzündungszellen offenbart. Außerdem haben wir uns die Korrelation zwischen der Anzahl von S100A9-positive Zellen in Tumorgewebe und der klinisch-pathologischen Funktionen. Wir richten auch die Co-Lokalisation von S100A9 und S100A8 sowie die Lokalisierung des Dimers Calprotectin durch Immunofluoreszenz. Schließlich Einblick in die Funktion von S100A9 in Krebszellen zu gewinnen, wir die Wirkung des rekombinanten Protein S100A9 auf Migration und Invasion von Magenkrebszellen AGS und BGC-823 untersucht.
Methoden
Patienten und Gewebeproben
wurde nach der Genehmigung durch Ethikkommission der Universität Peking Cancer Hospital durchgeführt. Informierte Zustimmung wurde von jedem Patienten erhalten. Einhundert sechsundsiebzig Patienten mit Magenkrebs wurden untersucht. 124 Männer und 53 Frauen (mittleres Alter, 57 Jahre, Bereich, 26-80 Jahre) wurden diagnostiziert und operativ in Peking University Cancer Hospital zwischen 1998 und 2004. Die Tiefe der Tumorinvasion, histologischen Grad, Lymphknotenmetastasen, Lebermetastasen behandelt, und Gefäßinvasion wurden aus klinischen und histopathologischen Berichte erhalten. Stadium von Magenkrebs wurde nach dem von der American Joint Committee on Cancer empfohlen 7. Auflage Tumor-Knoten Metastasen (TNM) Klassifizierung eingestuft. Keiner der Patienten erhielten eine Chemotherapie oder Strahlentherapie präoperativ. Alle Patienten wurden bis Januar 2010 nach Gastrektomie, ein Teil des resezierten Probe wurde in 10% Formalin fixiert und verarbeitet routinemäßig für die pathologische Beurteilung und ein anderer war schockgefroren in flüssigem Stickstoff gelagert bei -80 ° C für die RNA-Extraktion weiterverfolgt. Zudem 30 angepaßt metastatischen Lymphknoten wurden auch von diesen Patienten gesammelt. Zehn Fälle von chronischer Appendizitis Gewebe mit Exazerbation von der Abteilung für Allgemeine Chirurgie zur Verfügung gestellt wurden, die verbundenen Krankenhaus von Qingdao University Medical College.
Immunhistochemie (IHC)
Vier-Mikrometer-Abschnitte von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden montiert auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger und dann in Xylol und rehydratisiert durch Alkohol zu destilliertem Wasser entparaffiniert. Endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3% Wasserstoffperoxid für 15 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Nach dem Druck Kochen Sie die Folien in 10 mmol /l EDTA (pH 8,0) für 3 Minuten wurden die Schnitte mit 5% Ziegenserum inkubiert, dann wurden anti-S100A9 Antikörper über Nacht bei 4 ° C mit Maus inkubiert (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Schweiz) oder Maus-anti-S100A8-Antikörper (1: 200, T1031, BMA Biomedicals) oder Maus-anti-S100A8 /A9-Antikörper (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Primäre Antikörper wurden unter Verwendung eines zweistufigen EnVision-System (Dako, Glostrup, Dänemark) nachgewiesen. Meerrettichperoxidase und diaminobenzedene-Hydrochlorid (DAB) wurden Enzym und Chromogen eingesetzt. Die Expression von S100A9, S100A8 und S100A8 /A9 wurden auch in Cybrdi Gewebe Microarray-Slides (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, China), die chronische Gastritis mit Metaplasie (57 Fälle) und Magenkarzinom Gewebe (23 Fälle) nachgewiesen. Zehn Fälle von chronischer Appendizitis Proben mit Exazerbation wurden als positive Kontrolle für S100A8 /A9 serviert.
Beurteilung IHC und Cut-off Definition
S100A9 und S100A8 wurden in den Entzündungszellen wie Makrophagen und Neutrophilen infiltriert Tumorgewebe gefärbt. Positive Zellen zeigten eine variable Grad der zytoplasmatische Färbung. Die Bilder wurden erworben mit Ariol Bildanalysesystem (Applied Imaging, San Jose, CA, USA). Der Scanner wird auf der Basis eines Olympus BX61-Mikroskop mit einer Motortisch und Autofokus-Funktionen mit einer Kamera ausgestattet. Die Objektträger wurden bei 200-facher Vergrößerung gescannt. Der Grad der monoklonalen S100A9 oder S100A8 Antikörperreaktivität in jeder Gewebeschnitt wurde durch Zählen der Anzahl von gefärbten Entzündungszellen in drei 200-facher Vergrößerung Bereiche beurteilt. Dies wird durch zwei unabhängige Pathologen mit Hilfe eines automatischen Mikroskopsystems und der Bildverarbeitungssoftware durchgeführt wurde (siehe Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1). Cut-off-Wert von S100A9 gefärbten Entzündungszellen zur Vorhersage der Patienten pathologische Phase wurde durch receiver operating characteristic (ROC) Kurve bestimmt.
Laser konfokalen Scan
die Co-Lokalisation von S100A9 und seine Dimerisierungspartner S100A8 Um zu untersuchen, oder das Heterodimer S100A8 /A9, die Cybrdi Gewebemikroarray-Objektträger (IC00-01-001) 1,5 Stunden anti-S100A9-Antikörper bei Raumtemperatur mit Maus (1: 200) inkubiert wurden mit dem Zenon Alexa Fluor 647-Maus IgG Labeling Kit vormarkiert (Z-25008, rote Fluoreszenz), und entweder der anti-S100A8-Antikörper (1: 200) oder anti-S100A8 /A9-Antikörper (1: 200) mit dem Zenon Alexa vormarkiert Fluor 488-Maus IgG Labeling Kit (Z-25002 , grüne Fluoreszenz). Konfokale Bilder wurden unter Verwendung des Leica TCS SP5 konfokalen Mikroskop (Leica, Mannheim, Deutschland) erworben. . Darüber hinaus ist die mit DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA) counterstained Kerne, Anregung bei 358 nm
Proben von chronischen Appendizitis Gewebe mit Exazerbation mit Anti-S100A9-Antikörper wurden (1: 200, rote Fluoreszenz markiert), und Anti-S100A8 /A9-Antikörper. (1: 200, grün fluoreszenzmarkierten) als positive Kontrolle für die spezifische S100A8 /A9 Heterodimer Expression
Zellkultur
beiden Zelllinien in dieser Studie wurden zuvor durch Mikroarray-Analyse profiliert und regelmäßig wurden unter Verwendung von STR-Analyse (short tandem repeat DNA-Fingerprinting) [25] bestätigt. Magenkrebs-Zelllinie AGS wurde erhalten von der ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) und Zelllinie BGC-823 wurde in China gegründet und von Cell Research Institute, Shanghai, China erhalten. Krebszellen wurden als Monolayer in RPMI-1640-Medium (GIBCO BRL, Carlsbad, CA), ergänzt mit 10% (v /v) fötalem Kälberserum (FCS, GIBCO) und Antibiotika, bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% routinemßig gezüchtet CO 2 Atmosphäre.
Zellinvasion Assay
CytoSelect 24-Well Zellinvasion Assay-Kit wurde von der Zelle Biolabs, USA erworben. S100A9 rekombinante Protein wurde von BMA Biomedicals, der Schweiz gekauft. Zellinvasion Assays wurden mit Transwell-Einsätze durchgeführt, die Zellen durch ein 8 &mgr; m Porengröße Polycarbonatmembran wandern können. Die obere Oberfläche des Einsatzes Membran wurde mit einer gleichförmigen Schicht getrockneten Basalmembranmatrix Lösung beschichtet. Zellen in einem serumfreien Medium resuspendiert wurden in der oberen Kammer jedes Transwell mit einer Dichte von 10 6 Zellen /ml (200 ul /Kammer) plattiert. S100A9 wurde rekombinantes Protein bei 0 in die obere Kammer Medium zugesetzt, 10, 20, 50 oder 100 ng /ml. Die untere Kammer wurde mit 500 ul Medium, enthaltend 10% FCS gefüllt. Zellen wurden für 48 h bei 37 ° C zu migrieren gelassen. Zellen, die in der oberen Kammer blieben, wurden mit einem Baumwolltupfer entfernt und Zellen, die für 15 Minuten in Cell Stain-Lösung auf die Unterseite der Membran wurden gefärbt eingedrungen war, und in neun zufällig ausgewählte mikroskopische Felder (200 x) pro Vertiefung gezählt . Jeder Einsatz wurde dann in ein leeres Loch eingebracht, in 200 ul Extraktionslösung inkubiert. Nach 10 Minuten wurden auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen transferiert 100 ul Lösung aus jeder Probe und in einem Plattenleser bei OD560nm gemessen.
Zellmigrationsassay
Zellmobilität wurde mittels eines Wundheilungstest beurteilt. Die Zellen wurden in Sechs-Well-Gewebekulturschalen ausgesät und kultiviert, bis konfluenten eine Zellschicht zu erhalten, die dann steril 200 ul Pipettenspitzen verwundet wurde. Jede Zelltrümmer wurde durch Waschen mit PBS entfernt. Die verwundeten einschichtigen Zelle wurde dann in Medium mit 100 ng /ml S100A9 rekombinantes Protein inkubiert. Kontrollzellen wurden mit serumfreiem RPMI-1640-Medium behandelt. Zeitraffer-Bilder wurden unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop für 0, 24 und 48 h bei 200-facher Vergrößerung aufgenommenen. Die Zellmigrationsfähigkeit wurde durch Berechnung des durchschnittlichen Zellmigrationsdistanz ausgewertet.
Statistical analysis
Clinicopathologic Variablen aus klinischen und histopathologischen Berichte extrahiert. ROC-Kurven wurden bei der Bestimmung der cut-off-Wert des S100A9-positive Entzündungszellzahl bei der Bewertung pathologischer TNM-Stadium eingesetzt. Der Verband der S100A9-positive Entzündungszellzahl mit unterschiedlichen TNM Stadien wurde mit dem Wilcoxon-Rangsummentest durchgeführt. Zur Erzielung Assoziationen zwischen S100A9 oder S100A8-Zellzahl und klinisch-pathologische Variablen, war die Daten Kreuztabellierung und ein χ
2-Test durchgeführt wurde. Kumulative Überleben wurde mit der Kaplan-Meier-Methode geschätzt, und Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit einem Log-Rank-Test durchgeführt. Das Gesamtüberleben wurde ab dem Tag der ersten Operation zu Todesdatum gemessen, wenn kein Ereignis dokumentiert wurde Tod jeglicher Ursache als Endpunkt oder dem letzten Tag der Informationen als Endpunkt zu zählen. Eine multivariate Analyse der Cox-Proportional-Hazards-Regressionsmodell (rückwärts, schrittweise) wurde geschaffen, um den Einfluss der einzelnen Variablen auf das Überleben zu bewerten. Die Signifikanz wurde bei P <
gesetzt; 0.05.
Ergebnisse
von S100A9 Expression Entzündungszellen im Magen-Krebs und chronische Gastritis Gewebe infiltrieren
In einer früheren Gen-Array-Analyse haben wir festgestellt, dass Magen-Krebsgewebe von benachbarten noncancerous Schleimhaut durch charakteristische Unterschiede zu unterscheiden waren in ihrer Genexpressionsmuster [26]. Die Vielfalt von Genexpressionsmustern kann Variation in den intrinsischen Eigenschaften von Tumorzellen und normalen Zellen sowie Variation in der zellulären Zusammensetzung dieser komplexen Geweben reflektieren. Innerhalb dieser Gene war die Expression von S100A9 in Magenkrebsgewebe höher als die der angepaßten benachbarten noncancerous Schleimhaut (P
= 0,00241, 1A). Abbildung 1: Expression von S100A9 in Magenkrebs und benachbarten nicht-Krebsgewebe. (A) Unterschiedliche Ausdruckswert von S100A9 in 72 Magenkrebsgewebe und gepaart No-Krebsgewebe von Daten aus illumina Sentrix BeadChip cDNA-Microarray Analyse. (B-E) Immunhistochemische Färbung von S100A9 in Magenkrebsgewebe (B) metastatische Lymphknoten (C), chronische Gastritis (D) und benachbarten nicht kanzerösen Magenschleimhaut (E). S100A9 Lokalisation wurde als braun oder rot granulierten Loci im Zytoplasma von infiltrierenden Entzündungszellen, insbesondere in mononukleären Phagozyten und neutrophilen Granulozyten offenbart. (Vergrößerung 200 ×).
Immunhistochemie von Proben von 177 Patienten Magenkrebs zeigte, daß S100A9 positiv war in allen primären Krebsgewebe mit Immunanfärbung in Entzündungszellen ausschließlich befindet wie Makrophagen und Neutrophilen infiltriert primären Tumorgeweben (die verschiedenen Zelltypen in Gewebe Proben wurden von zwei unabhängigen Pathologen identifiziert) (1B). Alle untersuchten Lymphknotenmetastasen (n = 30) waren auch positiv für S100A9 mit Immunfärbung ausschließlich in Entzündungszellen angeordnet, um die metastatischen Krebsgewebe (1C) umgibt. In benachbarten Nicht-Krebs-Schleimhaut wurde S100A9 bei Entzündungszellen exprimiert infiltrieren Gastritis. Magenschleimhaut hatten negative oder sehr schwach S100A9 Ausdruck (1D, E).
S100A9-positive Entzündungszellzahl in Krebsgewebe mit Krebsstadium und das Überleben der Patienten assoziiert
Um das Ausmaß der S100A9 Expression im Magen-Krebs- bewerten assoziiert Umgebung wurde die Anzahl von S100A9-positive Entzündungszellen in jeder Tumorgewebe durch Mittelung der Zellzahlen von drei Feldern (ursprüngliche Vergrößerung 200 ×) in dem Bereich mit der größten Anzahl der positiven Zellen an der Stelle des tiefsten Tumorinvasion gemessen. Die Korrelation zwischen Zellzahl und klinischen Parametern und das Überleben der Patienten wurde mit Wilcoxon Rangsummentest und Kaplan-Meier-Methode analysiert. Wie in 2A, graduelle Abnahme des S100A9-positive Entzündungszellzahl in Krebsgewebe mit der Zunahme des Tumor pathologischen Stadium I bis IV (Wilcoxon-Rangsummentest für 4 Stufen, P
= 0,0265) zugeordnet wurde gezeigt. Abbildung 2 Hoch S100A9-Zellzahl in Krebsgewebe zeigt eine bessere Ergebnisse bei Patienten mit Magenkrebs. (A) Streudiagramm von S100A9-positive Entzündungszellzahl in jeder pathologischen TNM-Stadium. Die blaue Linie zeigt den Pegel von 200 (B) ROC-Kurve von S100A9-Zellzahl für die Vorhersage des pathologischen TNM-Stadium. Pfeil zeigte auf den Cutoff-Punkt etwa 200. (C) Kaplan-Meier-Analyse der Gesamtüberlebenszeit für jeden pathologischen TNM-Stadium. (D) Kaplan-Meier-Analyse der Gesamtüberlebenszeit für hohe S100A9-Zellzahl (≥ 200) Gruppe und niedrige S100A9-Zellzahl (< 200) Gruppe. (Nur 176 Patienten wurden in die Analyse eingeschrieben für einen Patienten Follow-up verloren).
Dann testeten wir die Vorhersage Leistung des S100A9-Zellzahl für Tumorstadium bei Magenkrebs. Basierend auf TNM-Stadium wurden die Patienten in zwei Gruppen eingeteilt, weniger fortgeschrittene Gruppe (Stufe I + II) und Fortgeschrittenen-Gruppe (Stadium III + IV). Fläche unter der Kurve (AUC) von dem Empfänger erhalten operating characteristic (ROC) Kurven mit den S100A9-positiven Entzündungszellen zählen war 0,623 für pathologische TNM Stadien. Der Cutoff-Wert war 198,5 (wir haben 200 in der folgenden Analyse) pro 200-facher Vergrößerung Feld mit 64,3% Sensitivität und 61,9% Spezifität für Tumorstadium Vorhersage (2B). Abschneidelinie 200 kann verwendet werden, um den weniger fortgeschrittenen Gruppe der Fortgeschrittenen-Gruppe zu trennen. Der Unterschied war signifikant zwischen den beiden Gruppen (Wilcoxon-Rangsummentest für zwei Gruppen, P
= 0,017, 2A).
Da die Überlebensanalyse zeigte signifikant unterschiedliche Prognose für Patienten mit Magenkrebs in verschiedenen Krebsstadien (2C) , wir die Beziehung zwischen S100A9-positiven Entzündungszellen analysiert zählen und Patientenüberlebensrate. Die Patienten wurden mit Cutoff-Wert in Hoch S100A9 Zellzahl (≥ 200) Gruppe und niedrige S100A9 Zellzahl geschichtet (< 200) Gruppe. 5-Jahres-Überlebensrate betrug 44,6% in der hohen Zellzahl Gruppe im Vergleich zu 22,5% in niedrigen Zellzahl-Gruppe (p = 0,021
, 2D). Die mediane Überlebenszeit betrug 35,1 ± 10,8 Monate für die hohe Zellzahl-Gruppe und 20,3 ± 3,0 Monate für die niedrige Zellzahl-Gruppe. Zusammengenommen können S100A9-positive Entzündungszellzahl bei Magenkrebs Gewebe als Indikator verwendet werden, um frühzeitig zu erkennen und mit fortgeschrittenem Magenkrebs mit der Cutoff von 200 positiven Zellen /HPF unterscheiden. Vorhandensein von S100A9-positive Entzündungszellen in Krebsgewebe korreliert mit einer besseren Prognose bei Patienten mit Magenkrebs.
Geringe Anzahl von S100A9-positive Entzündungszellen in Krebsgewebe positiv korreliert mit einer schlechten klinisch-pathologischen Eigenschaften
Low S100A9 Zellzahl gefunden wurde korreliert mit der Tumorinvasionstiefe (T-Stadium), Lymphknotenmetastasen (N-Stadium) und klinische TNM-Stadium (P
= 0,011, 0,009 und 0,002, jeweils) zu werden. Die Korrelation zwischen S100A9-Zellzahl und andere klinische Merkmale wie Geschlecht, Alter, Tumorlokalisation, Lebermetastasen (M-Stadium), vaskuläre Invasion und Differenzierung waren statistisch nicht signifikant (alle P
> 0,05) (Tabelle 1). Zusätzlich zeigten multivariate Analyse N-Stadium (p = 0,006
), Lebermetastasen (P
= 0,000) und S100A9-Zellzahl (P
= 0,046) unabhängige Faktoren zu sein, das Gesamtüberleben in der Vorhersage (Tabelle 2 ) .Tabelle 1 Verband der S100A9-positive Entzündungszellzahl mit klinischen Parametern in Krebsgewebe in Magenkrebs-Patienten
Variablen
Low S100A9 (positive Zellen < 200)
Hohe S100A9 ( positive Zellen > = 200)
P
Wert
Sex
0,125
männlich
74
50
Weiblich
25

28
Alter
0.089
< 50
32
18
50-59
24
12
60-69
33
33
> = 70 10
15
Tumor Lage
0.271
Cardia 26
15
Non-Cardia
73
63
Tiefe Tumorinvasion **
0,011
T1
3 2
T2
7
19
T3
69
42
T4
20
15
Lymphknotenmetastase
0,009
13
N0
23
N1
32
30
N2
32
17
N3
22
8 Lebermetastasen
0.571
Negative
89
68
Positive
10 10
TNM-Stadium
0.002
І
3
12
II
37
35
III
50
21
IV
9 10
Gefäßinvasion
0.742
Negative
38
31
Positive
58
43
Nicht erfasst *
3
4
Differenzierung **
0.472
Well of 2
4 Mäßig + Unzureichend
82
66
Andere Arten
13
6
Nicht bestimmt
2
2 * Daten unvollständig.
** Fisher-Test.
Tabelle 2 Multivariate Analyse der prognostische Faktoren für das Gesamtüberleben von Patienten mit Magenkrebs
Variationen
P
RR
CI (95%)
Sex
0.671
1.106
0,694-1,765
Male im Vergleich zu weiblich
Alter
0.179
1.148
0,938-1,405
< 50
50-59
60-69
> = 70
Tumor Lage
0.545
0.864
0,538-1,387
Cardia gegen
Nicht Cardia
Differenzierung
0.301
0.751
0.437- 1.292
Well mäßig im Vergleich zu + schlecht
Lymphknotenmetastase
0,006
1,841
1,196-2,835
N0 + N1 im Vergleich zu N2 + N3
Tiefe der Tumorinvasion
0,1
1.756
0,897-3,435
T1 + T2 im Vergleich zu T3 + T4
Lebermetastasen
0
3,461
2,002-5,983
Negative gegen Positive
Gefäßinvasion
0.107
1.452
0,922-2,285
Negative gegen positive
S100A9-positive Entzündungszellzahl
0,046
0.643
0,417-,991
< 200 im Vergleich zu > = 200
RR: relative Risiko; CI:. Konfidenzintervall
Der Ausdruck Status von S100A8 und S100A8 die /A9-Heterodimer bei Magenkrebs Gewebe und Gastritis Gewebe
Chronische Gastritis eine chronische Magen-Läsion ist, pathologisch gekennzeichnet durch unspezifische chronische Entzündung der Magenschleimhaut. Die Entzündungszellen bei chronischen Gastritis sind morphologisch wie die primären Magenkrebs Gewebe infiltriert. In einigen Fällen können chronische Gastritis sogar zu Magenkrebs führen. Als nächstes untersuchten wir weiter die Expression von S100A8, einem engen Familienmitglied von S100A9 und die Heterodimerisierung Form in S100A8 /A9 beide Magenkrebsgewebe und angrenzenden Nicht-Tumor chronische Gastritis Gewebe in den Magenkrebs Proben durch Immunhistochemie durchgeführt wird. Ähnlich wie bei dem Muster von S100A9, S100A8 wurde ausgedrückt ausschließlich in Entzündungszellen sowohl Tumorgeweben und benachbarte Gewebe infiltriert Gastritis. . S100A8 wurde nicht in allen Magenkrebszellen und normale Magenschleimhaut ausgedrückt
nächstes quantifizierten wir die Anzahl von S100A8-positive Entzündungszellen in jedem Gewebe Tumor wie zuvor beschrieben für S100A9 (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1). oder das Überleben der Patienten (Weitere Datei 3: Abbildung S2): Überraschenderweise hat S100A8-Zellzahl in Geweben Magenkrebs nicht mit den meisten klinisch-pathologischen Eigenschaften (Tabelle S1 Weitere Datei 2) korrelieren. Außerdem wird die Expression der Heterodimerisierung Form S100A8 /A9 in keiner Entzündungszellen infiltrierenden Magenkrebsgewebe gefunden wurde, während einige S100A8 /A9-positiven Zellen bei der chronischen Gastritis Geweben identifiziert wurden (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigten, dass die Verteilung von S100A9, S100A8 und S100A8 /A9 könnte Magenkrebs und chronische Gastritis Gewebe im menschlichen unterschiedlich sein.
Um diese Hypothese zu bestätigen, untersuchten wir weiter die subzelluläre Lokalisation Muster von S100A9, S100A8 und S100A8 /A9 Heterodimer Expression durch immunofluorecence Färbung in einem Gewebe-Mikroarray einschließlich 23 Fälle von Magenkrebs und 57 Fälle von chronischer Gastritis durchführen. In Magenkrebsgewebe sowohl S100A9 und S100A8-Proteine ​​wurden in den Tumor-infiltrierenden Entzündungszellen (3A, B) erfaßt, während kein S100A8 /A9-Heterodimer wurde in allen Fällen (Figur 3G) gefunden. Expression von S100A8 und S100A9 teilweise im Cytoplasma von Zellen (3D, E) überlappen. Darüber hinaus S100A9 und S100A8-Proteine ​​wurden in Entzündungszellen bei chronischen Gastritis (Abbildung 3 K, L) nachgewiesen. Verteilung dieser beiden Proteine ​​auch teilweise überlappen (Abbildung 3 N, O). Übereinstimmend mit den Ergebnissen der Immunhistochemie, S100A8 /A9 wurde nicht in irgendwelchen Zellen von Magenkrebsgewebe (Figur 3G) exprimiert, während die Expression von S100A8 /A9 teilweise mit dem S100A9 in Entzündungszellen von Gastritis Gewebe (Abbildung 3Q, S, T) überlappend . Wenig überraschend, Expression und Verteilung von S100A8 /A9 bei chronischen Appendizitis Gewebe mit Exazerbation (die positive Kontrolle) waren sehr ähnlich denen bei chronischer Gastritis Gewebe (Abbildung 3U, V, X, Y). Zusammengenommen die unterschiedliche Expression und subzelluläre Lokalisation von S100A9, S100A8 und S100A8 /A9 in verschiedenen Geweben können ihre verschiedenen Rollen bei Magenkrebs oder chronische Gastritis Umwelt verwickeln. Figur 3 Immunofluorescence Bilder von S100A9, S100A8 und S100A8 /A9-Proteinen in Gewebemikroarray-Objektträger Magenkrebsgewebe (A-J) und chronische Gastritis Gewebe (K-T), und chronischer Appendizitis Gewebe mit Exazerbation (U-Y) enthält. S100A9 und S100A8 wurden durch den monoklonalen Antikörper erkannt wird, vormarkiert mit dem Zenon Alexa Fluor-Maus IgG Labeling Kit (mit grünen und roten Fluoreszenz respectively). Der Kern wurde von DAPI gefärbt. S100A8 /A9 Heterodimere waren nachweisbar mit dem Dimer-spezifischen Antikörper 27E10 von BMA Biomedicals mit grünen Fluoreszenz vormarkiert. Die Co-Lokalisierung von S100A9 und S100A8 oder S100A8 /A9 wurde in fusionierten Bilder (D, I, N, S, X) und größer fusionierten Bilder (E, J, O, T, Y) zeigte. Weißer Pfeil in 3 T zeigt Co-Lokalisation von S100A9 und S100A8 /A9 bei chronischer Gastritis. Stablänge, 50 &mgr; m.
Die hemmende Wirkung des rekombinanten Proteins S100A9 auf Migration und Invasion von Magenkrebs-Zelllinien in vitro
Das S100A9 Protein exprimiert in und abgesondert von Entzündungszellen und dient als Vermittler bei akuten und chronische Entzündung. Da die S100A9-positive Entzündungszellzahl mit weniger aggressiven klinisch-pathologischen Eigenschaften korreliert sind, testeten wir weiter die direkte hemmende Funktion von rekombinanten S100A9 auf die Migration und Invasion von Magenkrebszellen. Um invasive Fähigkeit von Magenkrebszellen zu bewerten, wurde Transwell-Assays verwendet. Zwei Magenkrebszelllinien, AGS und BGC-823, wurden mit serumfreiem Medium oder Medium, das verschiedene Konzentrationen von rekombinantem Protein S100A9 (10, 20, 50 und 100 ng /ml, jeweils). Invasiver Zellen wurden in neun zufällig ausgewählte mikroskopische Felder (200 x) gezählt. Ergebnisse zeigten, dass rekombinante Protein S100A9 leicht AGS Zellinvasion (4A) gehemmt, während S100A9 signifikant BGC-823 invasion in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert (P
< 0,05, 4C). Um die Migrate Fähigkeit von Magenkrebszellen zu analysieren, führten wir den Wundheilungstest. Beide Zelllinien wurden mit serumfreiem Medium oder Medium, das 100 ng /ml rekombinantes S100A9-Protein. Ergebnisse zeigten, dass S100A9 leicht inhibierten AGS Zellmigration (4B), während die Zellmigration Entfernungen von BGC-823 mit S100A9 nach 24 h behandelten Zellen und 48 h Inkubation als diejenigen der Kontrolle waren signifikant niedriger (P
< 0,05, Figur 4D). Abbildung 4 Wirkung von S100A9-Protein auf rekombinantem Invasion und Wanderung von Magenkrebs-Zelllinien. In Transwell-Assay, AGS (A) und BGC-823 (C) Zellen wurden mit serumfreiem Medium oder Medium, das 10, 20, 50 oder 100 ng /ml rekombinantes S100A9-Protein. Invasive Zellen wurden in zufällig neun ausgewählte mikroskopische Felder (200 ×) gezählt. In Wundheilungs Assay, AGS (B) und BGC-823 (D) Zellen wurden mit serumfreiem RPMI-1640-Medium oder Medium, das 100 ng /ml rekombinantes Protein S100A9 behandelt. Fotos wurden von einem invertierten Phasenkontrastmikroskop bei 0 h, 24 h und 48 h nach der Verwundung erfasst. Drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Mittel ± S. D. dieser unabhängigen Experimenten. P
Wert vs.
Kontrollgruppe.
Diskussion
Krebs beim Menschen ist eine chronische Krankheit, die aus transformierten Zellen stammt genetische beherbergen sowie epigenetische Veränderungen. Allerdings ist Krebs nicht nur von Krebszellen zusammengesetzt. Krebsgewebe enthält andere Zelltypen, einschließlich Fibroblasten und Epithelzellen, Immunzellen und bilden Zellen die Blutgefäße und Lymphgefäßen [27]. In diesem komplexen Tumor-Mikroumgebung, regulieren Entzündungsmediatoren verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung, einschließlich der Initiierung, Promotion, Invasion und Metastasierung [28].
S100A9, ein Mitglied der S100-Familie, ist reichlich in Granulozyten, Monozyten und aktivierten Keratinozyten während der verschiedenen entzündlichen Erkrankungen. In dieser Studie haben wir festgestellt, daß S100A9 die speziell in Entzündungszellen entfernt wurde Magenkrebsgewebe und chronischen Gastritis Gewebe infiltrieren, während alle Magenkrebszellen oder benachbarten Zellen der Magenschleimhaut S100A9 nicht exprimieren. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Studien eine hohe Expression von S100A9 demonstrieren in Immunzellen in verschiedenen Krebsarten wie Darmkrebs infiltrieren [21] und Bauchspeicheldrüsenkrebs [29]. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

• Identifizierung von mit menschlichen Magen cancer
• Charakterisierung von menschlichen Magenkarzinom bezogenen Methylierung von 9 miR CpG-Inseln und Unterdrückung ihrer Ausdrücke in vitro und in vivo