Aanwezigheid van S100A9-positieve ontstekingscellen in kankerweefsel correleert met een vroeg stadium van kanker en een betere prognose bij patiënten met maagkanker

Aanwezigheid van S100A9-positieve ontstekingscellen bij kanker weefsels correleert met een vroeg stadium van kanker en een betere prognose bij patiënten met maagkanker
Abstracte achtergrond
S100A9 werd oorspronkelijk ontdekt als een factor uitgescheiden door ontstekingscellen. Onlangs S100A9 werd in verband gebracht met een aantal menselijke maligniteiten. Het doel van deze studie is om S100A9 expressie bij maagkanker te onderzoeken en verkennen haar rol in de progressie van kanker.
Methods
S100A9 meningsuiting in de maag weefselmonsters van 177 maagkankerpatiënten werd beoordeeld door immunohistochemie. De expressie van zijn dimerisatiepartner S100A8 en de S100A8 /A9 heterodimeer werden ook beoordeeld volgens dezelfde werkwijze. Het effect van exogene S100A9 op de beweeglijkheid van maagkanker cellen AGS en BGC-823 werd vervolgens onderzocht.
Resultaten
S100A9 specifiek door ontstekingscellen zoals macrofagen en neutrofielen in menselijke maagkanker en gastritis weefsels werd uitgedrukt. Statistische analyse toonde aan dat een hoge S100A9 celgetal (> = 200) per 200x vergroting microscopisch veld bij kanker weefsels was voorspellende van beginnende maagkanker. High S100A9-positieve cellen was negatief gecorreleerd met de lymfeklier metastase (P
= 0,009) en tumorinvasie (P
= 0,011). S100A9 werd geïdentificeerd als een onafhankelijke prognostische predictor van de totale overleving van patiënten met maagkanker (P
= 0,04). Patiënten met hoge S100A9 celgetal waren met een gunstige prognose (P
= 0,021). Nader onderzoek bleek dat S100A8 distributie in menselijke maagkanker weefsel was vergelijkbaar met S100A9. Echter, het aantal S100A8-positieve cellen niet positief gecorreleerd met de patiënt te overleven. De ontstekingscellen infiltreren kanker waren S100A8 /A9 negatief, terwijl die in gastritis positief waren. Bovendien exogene S100A9 eiwit remde migratie en invasie van maagkanker cellen.
Conclusies
Onze resultaten suggereren S100A9-positieve ontstekingscellen bij maagkanker weefsels worden geassocieerd met een vroeg stadium van maagkanker en een goede prognose.
Trefwoorden
Maagkanker S100A9 Inflammatoire cellen Tumor staging Survival Achtergrond
Maagkanker is een van de belangrijkste oorzaken van sterfte aan kanker wereldwijd. Een totaal van 989.600 nieuwe maagkanker gevallen en 738.000 sterfgevallen werden geschat te hebben plaatsgevonden in 2008, en meer dan 70% van de nieuwe gevallen en sterfgevallen in ontwikkelingslanden zoals China [1]. Maagkanker wordt meestal ontdekt op een vergevorderd stadium, wanneer prognostische uitkomsten zijn arm. Bijna 70-80% van de patiënten hebben de betrokkenheid van de regionale lymfklieren, die een grote invloed op de overleving [2, 3] heeft. Daarom ontdekking van nieuwe biomarkers hulp in vroege opsporing en nauwkeurige voorspelling van het gedrag van de tumor kan de patiënt te overleven [4-6] te verbeteren.
Leden van de S100 familie van eiwitten zijn in opkomst als biomarkers in meerdere typen tumoren [7]. De S100 familielid S100A9 is een 13kd eiwit dat geconserveerde structurele motieven bestaande uit twee EF hand Ca 2 + bindende domeinen bevat. Na calcium binding, S100A9 wisselwerking met andere S100 familielid S100A8 de functionele heterodimeer genaamd calprotectin vormen [8, 9]. S100A9 werd oorspronkelijk geïdentificeerd als een factor uitgescheiden door ontstekingscellen zoals neutrofielen en macrofagen in reumatoïde artritis, inflammatoire darmziekte en andere ontstekingsziekten [10-14]. S100A9, S100A8, evenals de S100A8 /A9 heterodimeer calprotectin, tot overexpressie worden gebracht tijdens inflammatie-geïnduceerde carcinogenese [15]. S100A9 expressie is opgereguleerd in tumorcellen in de long [16], prostate [17], en borstkanker [18, 19], terwijl het neerwaarts gereguleerd in menselijke slokdarmkanker cellen [20]. Colorectaal kanker weefselmonsters echter de S100A9 eiwit werd niet gedetecteerd in kankercellen, maar in ontstekingscellen verspreid over de tumor stroma [21]. Bovendien S100A9 was fecesmonsters van colorectale kanker patiënten significant hoger dan bij controle [22]. In maagkanker, genexpressie en proteomics analyse toonde hoge expressie van S100A9 in het weefsel. [23, 24]. Echter, de verdeling in het weefsel en associatie met klinische en pathologische kenmerken niet volledig aangetoond.
In deze studie hebben we gebruik genexpressie analyse S100A9 expressie vergelijken maagkanker weefsels en in de aangrenzende, ogenschijnlijk normale weefsels. Immunohistochemische kleuring toonde S100A9 in tumor-geassocieerde ontstekingscellen. Verder geadresseerd we het verband tussen het aantal S100A9-positieve cellen in tumorweefsels en de klinische en pathologische kenmerken. Ook in op de co-lokalisatie van S100A9 en S100A8 en de lokalisatie van het dimeer calprotectin van immunofluorescentie. Tot slot, om inzicht te krijgen in de functie van S100A9 in kankercellen, we het effect van het recombinant eiwit S100A9 onderzocht over migratie en invasie van maagkanker cellen AGS en BGC-823.
Methoden
Patiënten en weefselmonsters
Dit onderzoek werd uitgevoerd na goedkeuring door ethische commissie van de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt. Honderd zesenzeventig patiënten met maagkanker bestudeerd. 124 mannen en 53 vrouwen (gemiddelde leeftijd, 57 jaar, range, 26-80 jaar) werden gediagnosticeerd en chirurgisch behandeld in de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis tussen 1998 en 2004. De diepte van de tumor invasie, histologische graad, lymfeklier metastase, lever metastase, en vasculaire invasie werden verkregen van klinische en histopathologische rapporten. Stadium van maagkanker werd geclassificeerd volgens de 7e editie tumor-node metastase (TNM) indeling aanbevolen door het American Joint Committee on Cancer. Geen van de patiënten chemotherapie of bestraling preoperatief. Alle patiënten werden gevolgd tot januari 2010. Na gastrectomie, een deel van resectiepreparaat werd gefixeerd in 10% formaline en routinematig verwerkt voor pathologische evaluatie en ander werd snel bevroren in vloeibare stikstof bewaard bij -80 ° C voor RNA-extractie. Daarnaast werden 30 gekoppeld metastatische lymfeknopen ook vanuit deze patiënten. Tien gevallen van chronische appendicitis weefsels met exacerbatie werden verstrekt door het ministerie van Algemene Heelkunde, de aangesloten ziekenhuis van Qingdao University Medical College.
Immunohistochemie (IHC)
Four-micrometer secties van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels werden gemonteerd op poly-L-lysine beklede objectglaasjes en paraffine ontdaan in xyleen en gerehydrateerd tot alcohol gedistilleerd water. Endogene peroxidase activiteit werd geblokkeerd met 3% waterstofperoxide gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Onder druk koken van de objectglaasjes in 10 mmol /L EDTA (pH 8,0) gedurende 3 minuten werden de secties geïncubeerd met 5% geit serum, vervolgens gedurende de nacht geïncubeerd bij 4 ° C met muizen anti-S100A9 antilichaam (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Zwitserland), of de muis anti-S100A8 antilichaam (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), of de muis anti-S100A8 /A9 antilichaam (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Primaire antilichamen werden gedetecteerd met een tweestaps EnVision System (Dako, Glostrup, Denemarken). Mierikswortel peroxidase en diaminobenzedene hydrochloride (DAB) waren enzym en chromogeen toegepast. Expressie van S100A9, S100A8 en S100A8 /A9 werden ook gedetecteerd in Cybrdi weefsel microarray dia's (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, China) met chronische gastritis met metaplasie (57 gevallen) en maagcarcinoom weefsels (23 gevallen). Tien gevallen van chronische appendicitis exemplaren met exacerbatie werden dienden als positieve controle voor S100A8 /A9.
IHC assessment en cut-off Definitie van S100A9 en S100A8 in de ontstekingscellen werden gekleurd zoals macrofagen en neutrofielen infiltreren in tumor weefsels. Positieve cellen vertoonden een variabele mate van cytoplasmatische kleuring. Beelden werden verkregen met behulp van Ariol beeldanalyse-systeem (Applied Imaging, San Jose, CA, USA). De scanner is gebaseerd op een Olympus BX61 microscoop met een gemotoriseerde fase en autofocusmogelijkheden voorzien van een camera. De objectglaasjes werden gescand op 200 x vergroting. De mate van monoklonale S100A9 of S100A8 antilichaamreactiviteit Iedere weefselsectie werd vastgesteld door tellen van het aantal gekleurde ontstekingscellen in drie 200 x vergroting scopes. Dit werd uitgevoerd door twee onafhankelijke pathologen met behulp van een automatische microscoop systeem en het beeld processing software (zie Extra file 1: figuur S1). Cut-off waarde van S100A9 gekleurd ontstekingscellen voor het voorspellen van de patiënt pathologisch stadium werd bepaald door de ontvanger operating characteristic (ROC) curve.
Laser confocale scanning Belgique Om de co-lokalisatie van S100A9 en zijn dimerisatiepartner S100A8 te onderzoeken, of het heterodimeer S100A8 /A9, de Cybrdi tissue microarray dia (IC00-01-001) werden gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur met muizen anti-S100A9 antilichaam (1: 200) gelabelde met Zenon Alexa Fluor 647 Mouse IgG Labeling Kit (Z-25.008, rode fluorescentie), en ofwel anti-S100A8 antilichaam (1: 200) of anti-S100A8 /A9 antilichaam (1: 200) gelabelde met Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG Labeling Kit (Z-25002 , groene fluorescentie). Confocale beelden werden verkregen met behulp van de Leica TCS SP5 confocale microscoop (Leica, Mannheim, Duitsland). . Bovendien, de kernen tegengekleurd met DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA), excitatie bij 358 nm
Exemplaren van chronische appendicitis weefsels exacerbatie werden geïncubeerd met anti-S100A9 antilichaam (1: 200, rode fluorescentie gelabeld), en anti-S100A8 /A9 antilichaam. (1: 200, groen fluorescentie gelabeld) als een positieve controle voor de specifieke S100A8 /A9 heterodimeer expressie
Celkweek
Beide cellijnen bij dit onderzoek werden voorheen geprofileerd door microarray analyse en werden regelmatig gecontroleerd met behulp van STR-analyse (short tandem repeat DNA-fingerprinting) [25]. Maagkanker cellijn AGS werd verkregen van ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), en cellijn BGC-823 werd opgericht in China en verkregen van Cell Research Institute, Shanghai, China. Kankercellen werden routinematig gekweekt als een monolaag in RPMI-1640 medium (GIBCO BRL, Carlsbad, CA), aangevuld met 10% (v /v) foetaal kalfsserum (FCS, GIBCO) en antibiotica bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 atmosfeer.
Cell invasie assay
CytoSelect 24-Well Cell Invasion assay kit werd gekocht van Cell Biolabs, USA. S100A9 recombinant eiwit werd gekocht van BMA Biomedicals, Zwitserland. Invasie assays werden uitgevoerd met Transwell Inserts, waardoor cellen migreren door een 8 urn poriegrootte polycarbonaatmembraan. Het bovenvlak van de insert membraan werd bekleed met een uniforme laag van gedroogde basismembraan matrixoplossing. Cellen opnieuw gesuspendeerd in serumvrij medium werden uitgeplaat in de bovenste kamer van elk Transwell bij een dichtheid van 10 6 cellen /ml (200 ui /kamer). S100A9 recombinant eiwit werd aan de bovenste kamer medium toegevoegd bij 0, 10, 20, 50 of 100 ng /ml. De onderste kamer werd gevuld met 500 pl medium dat 10% FCS. Men liet de cellen migreren gedurende 48 uur bij 37 ° C. Cellen die nog in de bovenkamer werden verwijderd met een wattenstaafje en de cellen die aan de onderzijde van het membraan hadden gepenetreerd werden gekleurd in Mobiele Stain oplossing gedurende 15 minuten en geteld in negen willekeurig gekozen microscopische velden (200 x) per putje . Elke insert werd vervolgens overgebracht naar een lege put en geïncubeerd in 200 ui extractievloeistof. Na 10 minuten, 100 pi van de oplossing van elk monster overgebracht naar een 96-puts microtiterplaat en gemeten in een plaatlezer bij OD560nm.
Celmigratie assay
Mobiliteitscel werd gemeten met een wondgenezende assay. Cellen werden gezaaid in zes-well weefselkweekplaten en gekweekt tot confluente monolaag een cel, die vervolgens werd verwond steriele 200 gl pipet tips. Elke celafval werd verwijderd door wassen met PBS. De gewonde monolaag cel werd vervolgens geïncubeerd in medium met 100 ng /ml S100A9 recombinant eiwit. Controle cellen werden behandeld met serumvrij RPMI-1640 medium. Time-lapse beelden werden gemaakt met een omgekeerde fase contrast microscoop bij 200 x vergroting voor 0, 24 en 48 uur. De cel migratie mogelijkheid werd geëvalueerd door het berekenen van de gemiddelde celmigratie afstand.
Statistische analyse
Clinicopathologische variabelen uit klinische en histopathologische rapporten werden geëxtraheerd. ROC curves werden gebruikt bij het bepalen van de cut-off waarde van de S100A9-positief inflammatoir celgetal in de evaluatie van pathologische TNM stadium. De associatie van S100A9-positief inflammatoir celgetal met verschillende TNM stadia werd gedaan met de Wilcoxon rank-sum-test. Om associaties tussen S100A9 of S100A8 celgetal en clinicopathologic variabelen te verkrijgen, de data was cross-tabel en een χ
2 test werd uitgevoerd. Cumulatieve overleving werd geschat met de Kaplan-Meier-methode, en vergelijkingen tussen groepen werden gedaan met een log-rank test. Totale overleving werd gemeten vanaf de datum van de eerste operatie om datum van overlijden, het tellen van overlijden door welke oorzaak als het eindpunt, of de laatste dag van informatie als het eindpunt als er geen evenement werd gedocumenteerd. Een multivariate analyse van het Cox proportional hazards regressiemodel (achteruit, stapsgewijze) werd gemaakt om de invloed van iedere variabele op overleving te beoordelen. Significantie werd vastgesteld op P Restaurant < 0,05.
Resultaten
Expressie van S100A9 infiltreren ontstekingscellen bij maagkanker en chronische gastritis weefsels
in een eerdere gen array analyse hebben we vastgesteld dat maagkanker weefsels werden onderscheiden van aangrenzende goedaardige mucosa door karakteristieke verschillen in hun genexpressiepatronen [26]. De diversiteit van genexpressie patronen kunnen variaties in de intrinsieke eigenschappen van de tumor en normale cellen en variatie in de cellulaire samenstelling van deze complexe weefsels weerspiegelt. Binnen deze genen, de expressie van S100A9 bij maagkanker weefsels hoger dan die van overeenkomende aangrenzende goedaardige mucosa (P = 0,00241
figuur 1A). Figuur 1 Expressie van S100A9 bij maagkanker en naburige niet-kankerachtige weefsels. (A) Verschillende expressie waarde van S100A9 in 72 maagkanker weefsels en gepaarde no-kankerweefsel door het analyseren van de gegevens van Illumina Sentrix BeadChip cDNA microarray. (B-E) Immunohistochemische kleuring van S100A9 bij maagkanker weefsels (B) metastatische lymfeknopen (C), chronische gastritis (D), en naburige niet-carcinomateuze maagslijmvlies (E). S100A9 lokalisatie werd geopenbaard als bruine of rode korrels loci in het cytoplasma van infiltrerende ontstekingscellen, vooral in mononucleaire fagocyten en neutrofiele granulocyten. (Vergroting 200 ×).
Immunohistochemie van monsters van 177 maagkanker patiënten toonde aan dat S100A9 was positief in alle primaire kanker weefsels met immunokleuring uitsluitend gelegen in ontstekingscellen zoals macrofagen en neutrofielen infiltreren primaire tumor weefsel (De verschillende celtypes in het weefsel monsters werden geïdentificeerd door twee onafhankelijke pathologen) (Figuur 1B). Alle onderzochte metastatische lymfeklieren (n = 30) waren ook positief voor S100A9 met immunokleuring uitsluitend gelegen in ontstekingscellen rondom de uitgezaaide kanker weefsels (figuur 1C). In aangrenzende goedaardige mucosa werd S100A9 uitgedrukt in ontstekingscellen infiltreren gastritis. Maagslijmvlies hadden negatief of zeer zwak S100A9 expressie (figuur 1D, E).
S100A9-positief inflammatoir celgetal in kanker weefsel wordt in verband gebracht met kanker podium en de patiënt te overleven Belgique Om de omvang van S100A9 uitdrukking uit te werken in de maag kanker- milieubelasting, het aantal S100A9-positieve ontstekingscellen in elk tumorweefsel werd gemeten door het gemiddelde van de celtellingen van drie velden (oorspronkelijke vergroting 200 x) in het gebied met het grootste aantal positieve cellen op de plaats van de diepste tumorinvasie. Correlatie tussen celgetal en clinicopathologische parameters en overleving van patiënten werd geanalyseerd met behulp van Wilcoxon rank-sum-test en Kaplan-Meier-methode. Zoals getoond in Figuur 2A, geleidelijke afname van S100A9-positief inflammatoir celtelling in kankerweefsel was geassocieerd met de toename van de tumor pathologisch stadium van I naar IV (Wilcoxon rank sum test voor 4 trappen, P
= 0,0265). Figuur 2 High S100A9 celgetal in kankerweefsel geeft beter resultaat bij maagkanker patiënten. (A) Scatter plot van S100A9-positief inflammatoir celgetal in elke pathologische TNM podium. De blauwe lijn geeft het niveau van 200. (B) ROC curve van S100A9 celgetal voor de voorspelling van pathologische TNM podium. Pijl aangegeven de cutoff punt van 200. (C) Kaplan-Meier-analyse van de totale overleving voor elke pathologische TNM podium. (D) Kaplan-Meier-analyse van de totale overleving voor hoge S100A9 celgetal (≥ 200) groep en een laag S100A9 celgetal (< 200) groep. (Alleen 176 patiënten werden ingeschreven in de analyse van de ene patiënt naar de follow-up verloren).
Vervolgens testten we de voorspelling kracht van de S100A9 celgetal voor tumor stadium bij maagkanker. Basis van TNM werden patiënten verdeeld in twee groepen, minder geavanceerde groep (stadium I + II) en geavanceerde groep (stadium III + IV). Gebied onder de curve (AUC) die bij de receiver operating characteristic (ROC) krommen met de S100A9-positieve ontstekingscellen tellen was 0,623 voor pathologische TNM stadia. De cutoff waarde was 198,5 (we gebruikten 200 in de volgende analyse) per 200 × vergroting veld met 64,3% sensitiviteit en 61,9% specificiteit voor tumorstadium voorspelling (Figuur 2B). Cutoff lijn 200 kan worden gebruikt om de minder ontwikkelde groep uit de gevorderde groep scheiden. Het verschil was significant tussen de twee groepen (Wilcoxon rank sum test voor twee groepen; p = 0,017
figuur 2A).
Aangezien overlevingsanalyse hebben zeer verschillende prognose van patiënten met maagkanker in verschillende stadia van kanker (figuur 2C) , analyseerden we de relatie tussen S100A9-positieve ontstekingscellen te tellen en de patiënt te overleven tarief. Patiënten werden gestratificeerd op cutoff waarde in de high S100A9 celgetal (≥ 200) groep en een laag S100A9 celgetal (< 200) groep. 5-jaarsoverleving was 44,6% in hoog celgetal groep versus 22,5% in laag celgetal (P = 0,021
, figuur 2D). De mediane overleving was 35,1 ± 10,8 maanden voor de hoge celgetal groep en 20,3 ± 3,0 maanden voor de laag celgetal groep, respectievelijk. Samengevat, kan S100A9-positief inflammatoir celtelling bij maagkanker weefsel worden gebruikt ter voorspelling vroeg stadium en gevorderde maagkanker onderscheiden door de cutoff van 200 positieve cellen /HPF. Aanwezigheid van S100A9-positieve ontstekingscellen bij kanker weefsels correleert met een betere prognose bij patiënten met maagkanker.
Laag aantal S100A9-positieve ontstekingscellen bij kanker weefsels positief correleert met een slechte klinische en pathologische kenmerken
Low S100A9 celgetal werd gevonden worden gecorreleerd met tumorinvasie diepte (T-stadium), lymfeklier (N-stadium), en klinische TNM (P
= 0,011, 0,009 en 0,002, respectievelijk). Correlatie tussen S100A9 celgetal en andere klinische kenmerken zoals geslacht, leeftijd, tumor locatie, lever metastase (M fase), vasculaire invasie en differentiatie waren niet statistisch significant (alle P Restaurant > 0,05) (tabel 1). Bovendien, multivariate analyse toonde N-stadium (P
= 0,006), lever metastase (P
= 0,000), en S100A9 celgetal (P
= 0,046) zijn onafhankelijke factoren in het voorspellen van de totale overleving (tabel 2 ) .table 1 Vereniging van S100A9-positief inflammatoir celgetal in kanker weefsels met clinicopathologische parameters bij maagkanker patiënten
Variabelen
Low S100A9 (positieve cellen < 200)
High S100A9 ( positieve cellen >
P
value = 200)
Sex
0,125
Man
74
50
Vrouw
25
28
Age
0,089 Restaurant < 50
32
18
50-59
24
12
60-69
33
33 Restaurant > = 70
10

• Identificatie van DNA methylatie veranderingen geassocieerd met menselijke maag cancer
• Karakterisering van menselijke maag-carcinoom verband methylatie van CpG eilanden 9 miR en onderdrukking van hun uitingen in vitro en in vivo