O efeito de redução de gene de perdas cromossômicas detectadas em cancros gástricos

O efeito de redução do gene de perdas cromossómicas detectadas em cancros gástricos
Resumo
fundo
O nível de perda de heterozigosidade (LOH), que reduz uma dose de genes e exerce um efeito adverso-célula é conhecida por ser um parâmetro para o estadiamento genético de câncer gástrico. Este estudo investigou se o efeito de células-adverso induzido com a redução gene foi um fator limitante da velocidade para os eventos LOH em dois tipos histológicos distintos de câncer gástrico, os diffuse- e intestinal-tipos.
Métodos
O patológica amostras obtidas de 145 pacientes com câncer gástrico foram examinados para o nível de LOH utilizando 40 marcadores microssatélites em oito cromossomos associados ao câncer (3p, 4p, 5q, 8p, 9p, 13q, 17p e 18q).

resultados da maioria dos cromossomos associados ao câncer foram encontrados para pertencer aos cromossomas de genes dos pobres e para conter alguns genes específicos do estômago que foram altamente expressos. A LOH-nível de base, envolvendo um ou nenhum cromossomo foi freqüente em cancros gástricos de tipo difuso. O cromossoma 17 contendo uma densidade relativamente elevada de genes foi normalmente perdida em cancros do tipo intestinal, mas não em cancros do tipo difuso. Um alto nível de LOH envolvendo quatro ou mais cromossomas tendem a ser frequente nos cânceres gástricos com diferenciação intestinal e misto. recidiva da doença era comum para câncer gástrico com LOH de alto nível, quer através do hematogênica (38%) e (36%) vias não-hematogênicas, e para os casos de nível de linha de base LOH através da rota não-hematogênica (67%).
Conclusões
o efeito de células-negativo da redução gene é mais tolerada em cancros gástricos do tipo intestinal do que em cancros do tipo difuso, ea perda de genes com altas doses está associada com metástase hematogênica.
Fundo
cancros gástricos submetidos hypermutations em sequências repetitivas simples e perdas cromossômicas desequilibradas, e essas alterações genéticas são detectadas como uma instabilidade de microssatélites (MSI) e perda de heterozigosidade (LOH), respectivamente, utilizando marcadores microssatélites altamente polimórficos [1-4]. O comportamento pathobiological e prognóstico de cancros gástricos têm sido associados com o nível de LOH e a presença de MSI [3-6]. A profundidade de invasão e metástase de nódulo linfático são consideravelmente avançada nos casos de cancros de pequenas dimensões com elevado nível-LOH, e estes parâmetros histológicos tende a ser linearmente relacionado com o tamanho do cancro para os casos de baixo nível LOH [7]. Uma vez que um único genótipo microssatélite é igualmente detectado em todo o tecido cirúrgico, bem como a amostra de biópsia endoscópica [3, 7], é possível prever a probabilidade de recidiva da doença e para decidir o procedimento ressecção apropriado com base na análise de microssatélites de um tecidos pré-tratamento de biópsia.
a hipótese de dois sucessos propôs que a perda cromossômica eo resultado ponto de mutação na inativação bialélico de genes supressores de tumor [8]. perdas cromossômicas que exercem um efeito deletério sobre o crescimento de células são muito menos tolerados do que os ganhos cromossômicas, e os dois acessos genéticos fornecem uma vantagem de crescimento poderia proteger células progenitoras câncer de eventos LOH letais [9, 10]. Além disso, estudos anteriores têm proposto que as regiões de controle de gene metiladas são cada vez menos metilado de um modo LOH-level-dependente em cancros gástricos [11, 12] através de um mecanismo de compensação de dosagem que sustenta uma dose gene ou transcrição durante os ciclos celulares subsequentes [9 ]. No que diz respeito ao mecanismo de compensação de dosagem, o ganho cromossómico e desmetilação LOH-associado pode resultar de respostas genéticas e epigenética de dose-compensatória para uma redução na dose cromossómico [11-14]. Portanto, os eventos LOH combinados com um efeito adverso-célula e uma resposta de dose-compensatória para além do tumor inactivação do gene supressor são susceptíveis de determinar o comportamento das células progenitoras pathobiological cancro.
Cancros gástricos foram classificados em dois tipos histológicos distintos , isto é, os diffuse- e intestinais-tipos [15, 16]. Difusa do tipo de câncer são comuns em pacientes jovens de idade que não têm uma lesão pré-cancerosa, enquanto que do tipo intestinal cancros são comuns em pacientes de idade de idade associados à metaplasia intestinal pré-cancerosa que se assemelham glândulas intestinais [17]. Supondo-se que as células-tronco derivadas da medula estão se adaptando ao tecido-ambiente do estômago [18], as células-tronco recém-fixados, que são potencialmente não-coeso e invasiva em indivíduos jovens, se transformar em câncer do tipo difuso. Do tipo intestinal cancros são frequentes entre os pacientes velhos-idade que têm a adaptação a longo prazo de células-tronco recém-fixadas para o meio ambiente tecido gástrico. A este respeito, um dado evento LOH pode afectar doses distintas de transcrição entre cancros diffuse- e intestinal do tipo gástricos que estabelecem os padrões de expressão de genes distintos.
Neste estudo, foram feitas correlações entre os eventos LOH e comportamento pathobiological de cancros gástricos em termos dos efeitos celulares-adversos da redução do gene. Os oito cromossomas associados ao cancro examinados tinha uma baixa densidade de genes e nenhum gene específico do estômago, o que poderia resultar em um efeito adverso célula-leve de LOH. Os eventos LOH eram frequentes em cancros gástricos do tipo intestinal, em que a perda de um cromossomo que afetam uma dose baixa de transcrição e exercem um efeito de células-adverso leve.
Métodos
seleção dos casos
Cem e quarenta e cinco pacientes com câncer gástrico submetidos a ressecção cirúrgica curativa entre fevereiro de 1996 e Junho de 2003, foram incluídos neste estudo. As informações clínico-patológica e radiológica foi obtida através da revisão dos registros detalhados dos pacientes. Cento e dezesseis casos foram previamente analisados ​​por exame genético multifocal dos locais tumorais heterogêneos [3]. Os restantes 29 pacientes foram examinados usando um único bloco de tecido de cada tumor.
As lâminas microscópicas foram revistos e, em seguida, um local do tumor que foi representante do recurso histológico foi escolhido. O tipo histológico de câncer gástrico foi definida como intestinal (glandular, coesa ou sólido), difuso e misturados de acordo com a classificação Lauren [15, 16], e o grau de diferenciação foi graduada de acordo com a classificação da OMS. As localizações de tumores considerados foram cárdia, corpo e antro. O estágio do tumor clínico-patológico foi determinada de acordo com os critérios do tumor-nódulo-metástase (TNM) [19]. A maioria dos pacientes com câncer gástrico (140 de 145, 97%) tinham sido submetidos a gastrectomia R0 e D2 ou linfadenectomia mais prolongado. Uma média geral de 28,6 (mediana: 33) gânglios linfáticos foram removidos juntamente com o espécime. Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia e radioterapia pré-operatória.
Follow-up dados sobre recorrência e sobrevivência
A terapia de combinação de mitomicina intravenosa, fluorouracil e citarabina (MFC), seguido por fluorouracil oral foi administrado como um padrão tratamento adjuvante pós-operatória de acordo com o julgamento do médico sobre o prognóstico de cada caso. Durante o período de acompanhamento, um exame físico, exames laboratoriais, radiografia de tórax, ultra-sonografia abdominal ou tomografia computadorizada, e gastrofiberscopy foram realizadas a cada 3 ou 6 meses e recidiva da doença foi confirmado histologicamente, se possível. Quando mais do que um local da recidiva foi detectado no primeiro momento da falha, as recorrências individuais foram contados separadamente. O site recorrência foi categorizada em metástase hematogênica envolvendo o pulmão, fígado ou outros órgãos distantes, e metástase não-hematogênica que incluiu envolvimento ganglionar e disseminação peritoneal. cancros gástricos remanescentes foram excluídos da análise padrão de recorrência.
O tempo de sobrevivência global foi calculado a partir da data de ressecção cirúrgica até que o dia do último contato de acompanhamento ou morte relacionada ao câncer. Os dados sobre os pacientes que morreram por outras causas foi censurada no momento da morte. A análise estatística foi realizada em abril de 2007. O período médio de acompanhamento de todos os pacientes sobreviventes foi de 40 meses (intervalo: 5 a 96 meses) e foi concluída em 98% dos pacientes inscritos. Durante a análise de sobrevivência, 50 pacientes haviam morrido como resultado de seus cânceres e 12 pacientes morreram de outras causas.
Microdissection tecido e amplificação de DNA
Cinco 7 seções mm de espessura de série de cada fixado em formalina parafina-embedded amostra de tecido foram desparafinados e brevemente corados com hematoxilina e eosina. Um único foco de células de tumor-rico foi escolhido por exame microscópico e uma área de tumor variando entre 5 mm a 7 mm de diâmetro foi dissecada manualmente sob um estereomicroscópio (ampliação, x 40) usando um bisturi cirúrgico. Os pedaços de tecido foram microdissecadas microscopicamente examinado se o conteúdo da célula do tumor foi > 70%, que tinha sido confirmada de modo a reflectir a diferença no conteúdo genético entre os tecidos normais e tumorais [3, 7].
Aproximadamente 1.000 células tumorais microdissecadas foram incubadas em 20 ul de tampão de extracção de ADN (0,5% de Tween-20 , 1 mM de EDTA pH 8,0, 50 mM de Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml de proteinase K) a 37 ° C durante 24 h. Fixadas em formalina de ADN de tecido embebido em parafina tende a ser mal amplificado por PCR em amostras mais velhas. A maioria dos ADNs foram extraídos dentro de cinco anos após a preparação das amostras patológicas, o que garante uma qualidade do ADN para a RCP. A quantidade de ADN, com qualidades variáveis, do lisado de tecido foi determinada com base na intensidade da banda de PCR com 5-10 ng /mL do ADN, o qual foi amplificado utilizando um conjunto iniciador de microssatélites, D19S226
(para a frente: 5 ' - CCA GCA GAT TTT GGT GTT GTC TA - 3 '; reversa: 5' - ACA GAG CCA GAG CCA GTA GGA GT - 3 '; tamanho amplicon: 164 bp). A amplificação por PCR foi realizada sob uma condição de arranque a quente com a utilização de um radioisótopo (α- 32P dCTP, PerkinElmer, Boston, MA, EUA) como descrito anteriormente [3, 7]. Em resumo, um total de 10 ul mistura de PCR foram submetidos a 32 ciclos de uma série de amplificação passo que consistia em 94 ° C durante 50 seg, uma temperatura de hibridação específica do iniciador durante 50 segundos, e 72 ° C durante 1 min. As sequências microssatélites marcados com radioisótopos foram separados num gel de poliacrilamida a 6% que continha ureia 7 M e eles foram visualizadas por exposição repetida de cada auto-radiograf ia e utilizando um scanner radioluminograph (BAS 2500, Fuji Photo Film Co., Ltd., Kanakawa, Japão) .
Análise de alelos microssatélites
as orientações para marcar o status de LOH e MSI foram detalhados em estudos anteriores que utilizaram o mesmo painel de marcadores microssatélites [7]. Como um tipo de referência dos alelos microssatélites, que recuperou os marcadores dinucleótido de repetição que variaram de 88 pb para 247 pb de tamanho amplicon e que tinha um freqüência de heterozigotos > 50%. Os marcadores microssatélites altamente polimórficos em 8 cromossomas associados ao cancro (3p, 4p, 5q, 8p, 9p, 13q, 17p e 18q), que frequentemente sofriam de LOH em cancro gástrico [3, 7, 20], foram utilizados para aumentar o número de alelos heterozigóticos em cada braço (Figura 1A). Os cinco marcadores microssatélites em cada braço cromossómico mostraram as bandas de PCR claras dos alelos heterozigóticos e calibrado de todo o comprimento dos oito cromossomas [3, 5]. Para garantir a redução cromossômica, a perda cromossômica foi atribuído quando o evento LOH envolveu mais de dois marcadores microssatélites em um braço cromossômico [13]. Quarenta pares de iniciadores microssatélites foram misturados em um total de 22 tubos de reacção e cada uma das quais continha um (4 misturas) ou dois (18 misturas) conjuntos de iniciadores que se estendeu amplicões de tamanhos diferentes às mesmas temperaturas de recozimento. As bandas de microssatélites inequívocas resultantes indicaram a alta especificidade da condição multiplex PCR, que foi útil para pequenas quantidades de tecidos patológicos microdissectados. Figura 1 A análise de microssatélites com base em PCR (A) e a classificação genética de cancros gástricos (B). autorradiografias representativas das amostras que foram analisadas por análise baseada em PCR microssatélite (A) e a classificação genética dos cancros gástricos intestinal-tipo e difusa do tipo com base em perda de heterozigosidade (LOH) e instabilidade de microssatélites (MSI) (B). (A) A electroforese em gel esquerda mostra-alta frequência MSI em mais de 40% dos 15 marcadores homozigóticos. A eletroforese em gel de direita mostra de alto nível LOH envolvendo cromossomos 3p, 4p, 5q, 9p, 13q, 17p e 18q. O normais (N) e os ADN do tumor correspondente (T) são indicados por cima de cada banda alélica. O asterisco indica MSI e LOH. O DNA genômico microdissectados a partir de tecido fixado em parafina embebidas em formol foi amplificado e marcado por [α-32P] dCTP na condição de início quente de multiplex PCR. Um total de 80 amplicões microssatélites de cada amostra foram executados simultaneamente em dois géis de sequenciação. (B) Usando um painel de 40 marcadores microssatélites em oito cromossomos associados ao câncer, LOH foi interpretada em marcadores de heterozigotos, se 40% ou menos dos marcadores homozigotos exibiu MSI. A extensão das perdas cromossómicas, como pontuados de acordo com o número de cromossomas LOH-positivos, foi dividido em perdas de alto nível (LOH-H) e de baixo nível (LOH-L) tanto para a intestinal e difuso tipos. Em casos de cancros gástricos tipo difuso, zero ou um cromossómico perda foi classificada para o nível de base (LOH-B).
Com base na mesma classificação dos genótipos microssatélites, que foi aplicado no estudo anterior (Figura 1B) [ ,,,0],7], os perfis alélicas dos marcadores microssatélites 40 foram analisadas para MSI em marcadores de homozigotos que mostraram uma sombra ou stutter poucas bandas num par de ADN normais e tumorais. Porque MSI obscurece o status alélicas heterozigotos, os perfis alélicas dos 40 sequências microssatélites foram inicialmente analisados ​​para MSI em marcadores de homozigotos. O estado LOH foi determinada com base na perda alélica do marcador heterozigótica (Figura 1B). A extensão das perdas cromossómicas em cada caso foi pontuada de acordo com o número de perdas que envolvem cromossómicas constitucionais alelo mais de um microssatélite.
Análise de in silico
dados para a densidade do gene e a transcrição de cromossomas individuais Um
total de 17.723 genes de referência identificados na base de dados pública (http:.. //genoma UCSC edu /, março de 2006 montagem) [21] foram analisados ​​para calcular o número de genes por 1 Mb segmento de nucleótidos. Análise serial da expressão gênica de dados (SAGE) da mucosa gástrica normal foi obtido a partir de uma base de dados pública (http:.... //www NCBI NLM nih gov /geo /", SAGE_Stomach_normal_B_antrum"). A actividade de transcrição de genes individuais foi calculada por combinação do mapa genético de referência e as marcas de gene expresso. Com base numa comparação dos dados de SAGE avaliando os perfis de expressão de genes de microarranjos e, o número de transcritos contados nos dados SAGE foi encontrado para estimar com precisão uma grande diferença na actividade do gene entre os genes específicos do estômago e genes housekeeping [21].
análise estatística
teste exato de Fisher e χ
2 testes foram utilizados para comparar as características clínico-patológicas com o genótipo de microssatélites dos cancros gástricos. As curvas foram calculadas de acordo com o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. A análise multivariada foi realizado pelo método de riscos proporcionais de Cox com o uso de procedimentos passo a passo. Os valores de probabilidade foram bicaudais, com um valor P
inferior a 0,05 sendo considerado estatisticamente significativo. O pacote de software estatístico SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para análise de dados.

Resultados da análise dos eventos LOH em cancros gástricos
A maioria dos cancros gástricos (116 de 145 casos) foram examinados em uma análise multifocal anterior sobre os locais de tumores heterogéneos a partir de um determinado cancro gástrico [3]. Noventa e cinco por cento dos cancros gástricos examinados foram encontrados para ter tanto um nível semelhante de LOH ou MSI comumente compartilhado por locais tumorais heterogêneos e, em seguida, cada câncer gástrico foi categorizado em um único genótipo de microssatélites, e não um genótipo misto. Os genótipos dos microssatélites 27 casos adicionais foram pontuados de acordo com o nível de LOH e a presença de MSI, que foram detectadas em uma única peça de tecido contendo um componente histológica representativa.
Cada perda cromossómica foi correlacionada com os parâmetros do clinicopatológicas cancros gástricos (quadro 1). A maioria das perdas cromossômicas (4p, 5q, 9p, 13q, 17p e 18q) foram associados com doença de início tardio (P Art < 0,05). Dois ou mais perdas cromossômicas foram simultaneamente relacionado com a localização antral (9p e 18Q perdas), o intestinal, ou de tipo misto histologia (5q, 17p e 18q perdas), e uma menor sobrevida (3p, 9p e 13q perdas) (P
< 0,05). A perda 17p foi mais frequente nos cancros do tipo intestinal (67%). A perda de 13q foi mais frequente nos cancros do tipo difuso (47%). Tabela 1 Relações das características clínico-patológicas e perda única cromossômica
Características

3p perda perda
4p
perda 5q perda
8p
9p perda
13q perda
17p perda perda
18q
No. dos pacientes
130
47
47
51
30
50
57
77
55
idade
média
60
61
63
63
63
64
63
63
63
± SD
± 12,60
± 10,18
± 10,49
± 9,28
± 10,24
± 10,28
± 10,43
± 10,94
± 11,20
P
0,290
0,029
0,014
0,102
0,003
0,030 Art < 0,0001
0,030 Sexo seguro
Masculino
86
37
34
36
18
37
42
52
36
Female
44
10
13
15
12
13
15
25
19
P
0,033
0,335
0,450
0.510
0,182
0,136
0,710
1.000
localização do tumor
Cardia
13 4
3
5
1

• O efeito da lactulose na tolerância da alimentação gástrica na UTI longo prazo patients
• expressão alterada de um marcador de células progenitoras putativo DCAMKL1 na mucosa gástrica do rato em regeneração, metaplasia e expressão dysplasia