L'effetto del gene-riduzione delle perdite cromosomiche rilevati nei tumori gastrici

L'effetto del gene-riduzione delle perdite cromosomiche rilevati nei tumori gastrici
Abstract
sfondo
Il livello di perdita di eterozigosi (LOH), che riduce la dose del gene ed esercita un effetto negativo cellule è noto per essere un parametro per la messa in scena genetica dei tumori gastrici. Questo studio ha esaminato se l'effetto delle cellule-negativo indotto con la riduzione gene è un fattore limitante per gli eventi LOH in due tipi istologici distinti di tumori gastrici, le diffuse- e intestinali-tipi.
Metodi
Il patologica campioni ottenuti da 145 pazienti affetti da cancro gastrico sono stati esaminati per il livello di LOH con 40 marcatori microsatelliti su otto cromosomi cancro-associata (3p, 4p, 5q, 8p, 9p, 13q, 17p e 18q).
Risultati
Most dei cromosomi cancro-associata sono risultati appartenere ai cromosomi gene-poveri e per contenere alcuni geni specifici di stomaco che sono stati altamente espresso. Un LOH-level della linea di base che coinvolge uno o nessun cromosoma era frequente nel diffuso tipo di cancro gastrico. Il cromosoma 17 contenente una densità relativamente elevata di geni era comunemente perso nel tipo intestinale tumori ma non in diffuse di tipo tumori. Un LOH di alto livello che coinvolgono quattro o più cromosomi tendeva ad essere frequente nei tumori gastrici con differenziazione intestinale e misto. Recidiva della malattia era comune per i tumori gastrici con alto livello LOH sia attraverso la ematogena (38%) e (36%) le rotte non-ematogene, e per i casi a livello della linea di base LOH attraverso il percorso non ematogena (67%).
Conclusioni
l'effetto delle cellule-negativo della riduzione del gene è più tollerato in intestinale di tipo tumori gastrici rispetto ai diffuso tipo di cancro, e la perdita di geni ad alto dosaggio è associato con metastasi ematogena.
Sfondo
cancro gastrico sottoposti ipermutazioni in semplici sequenze ripetute e le perdite cromosomiche squilibrate, e queste alterazioni genetiche vengono rilevati come instabilità dei microsatelliti (MSI) e la perdita di eterozigosi (LOH), rispettivamente, utilizzando marcatori microsatelliti altamente polimorfici [1-4]. Il comportamento patobiologico e la prognosi di tumori gastrici sono stati associati con il livello di LOH e la presenza di MSI [3-6]. La profondità di invasione e metastasi linfonodali sono considerevolmente avanzata nei casi di piccole dimensioni tumori con alto livello LOH, e questi parametri istologici tende ad essere linearmente correlata con la dimensione cancro per i casi di basso livello LOH [7]. Poiché un singolo genotipo microsatellite è analogamente rilevata in tutta chirurgica di tessuto così come il campione bioptico endoscopica [3, 7], è possibile prevedere la probabilità di malattia ricaduta e di decidere la procedura di resezione appropriata basata sull'analisi microsatellite di un pretrattamento biopsia del tessuto.
il due-hit ipotesi ha proposto che la perdita cromosomica e il risultato mutazione puntiforme nel inattivazione biallelica di geni oncosoppressori [8]. perdite cromosomiche che esercitano un effetto deleterio sulla crescita delle cellule sono molto meno tollerato rispetto guadagni cromosomiche, e le due colpi genetici forniscono un vantaggio di crescita potrebbe proteggere le cellule del cancro progenitrici da eventi LOH letali [9, 10]. Inoltre, studi precedenti hanno proposto che le regioni del gene di controllo metilato sono sempre meno metilato in maniera LOH-livello-dipendente cancro gastrico [11, 12] attraverso un meccanismo di compensazione del dosaggio che sostiene una dose gene o di trascrizione durante i successivi cicli cellulari [9 ]. Per quanto riguarda il meccanismo di compensazione del dosaggio, guadagno cromosomiche e demetilazione LOH-associati possono derivare da risposte genetiche ed epigenetiche dose compensativo ad una riduzione della dose cromosomico [11-14]. Pertanto, gli eventi LOH combinati con un effetto cellula-negativo e una risposta dose di compensazione in aggiunta al tumore gene soppressore inattivazione sono suscettibili di determinare il comportamento delle cellule tumorali patobiologico progenitrici.
Tumori gastrici sono stati classificati in due tipi istologici distinti , cioè i diffuse- e intestinali tipi [15, 16]. Diffuse tipo di cancro sono comuni nei pazienti giovani età che mancano di una lesione precancerosa, mentre intestinale-tipo di cancro sono comuni nei pazienti anziani età associati alla metaplasia intestinale precancerosa che assomigliano ghiandole intestinali [17]. Partendo dal presupposto che le cellule staminali derivate dal midollo stanno adattando allo stomaco tessuti-ambiente [18], le cellule staminali di nuova fisse, che sono potenzialmente non coeso e invasiva in individui giovani, si sviluppano in cancro diffuso tipo. Intestinale tipo di cancro sono frequenti tra i pazienti anziani età che hanno l'adattamento a lungo termine delle cellule staminali di nuova fissi per l'ambiente tessuto gastrico. A questo proposito, un dato evento LOH può influenzare dosi distinte di trascrizione tra tumori diffuse- e tipo intestinale gastrici che stabiliscono distinti modelli di espressione genica.
In questo studio, sono state fatte correlazioni tra gli eventi LOH e comportamento patobiologico di tumori gastrici in termini di effetti avversi cellulari di riduzione del gene. Gli otto cromosomi cancro associato che abbiamo esaminato hanno avuto una bassa densità di geni e non i geni specifici di stomaco, che potrebbe tradursi in un effetto di cellule avversi lieve di LOH. Gli eventi LOH erano frequenti in intestinale tipo di cancro gastrico, in cui la perdita di un cromosoma comprometterebbe una bassa dose di trascrizione e di esercitare un effetto negativo cellule mite.
Metodi
selezione dei casi
Cento e quarantacinque pazienti con cancro gastrico sottoposti a resezione chirurgica curativa tra il febbraio 1996 e il giugno 2003 sono stati arruolati in questo studio. Le informazioni clinico-patologica e radiologica è stato ottenuto esaminando le registrazioni dettagliate dei pazienti. Cento e sedici casi sono stati precedentemente analizzati mediante esame genetico multifocale i siti tumorali eterogenei [3]. I rimanenti 29 pazienti sono stati esaminati utilizzando un unico blocco di tessuto di ogni tumore.
I vetrini microscopici sono stati rivisti e poi è stato scelto un sito di tumore che era rappresentativo della caratteristica istologica. Il tipo istologico di cancro gastrico è stata definita come intestinale (ghiandolare, coesiva o solido), diffuso, e miscelato secondo la classificazione Lauren [15, 16] e il grado di differenziazione è stato valutato secondo la classificazione WHO. Le posizioni di tumore considerati sono stati il ​​cardias, corpo e dell'antro. Lo stadio del tumore clinicopathologic è stato determinato in base ai criteri [19] Tumor-Node-Metastasi (TNM). La maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico (140 su 145, il 97%) avevano subito R0 gastrectomia e D2 o linfoadenectomia più estesa. Una media complessiva di 28,6 (media: 33) linfonodi sono stati rimossi insieme al campione. Nessuno dei pazienti ha ricevuto chemioterapia e la radioterapia pre-operatoria.
Di follow-up dei dati sulla recidiva e la sopravvivenza
una terapia di combinazione di mitomicina endovenosa, fluorouracile, e citarabina (MFC), seguita da fluorouracile per via orale è stato somministrato come standard trattamento adiuvante post-operatoria in base al giudizio del medico sulla prognosi complessiva di ogni singolo caso. Durante il periodo di follow-up, un esame fisico, esami di laboratorio, radiografia del torace, ecografia addominale o la tomografia computerizzata, e gastrofiberscopy sono state effettuate ogni 3 o 6 mesi e la malattia recidiva è stata istologicamente confermata, se possibile. Quando più di un sito recidiva è stata rilevata per la prima volta di fallimento, le singole ricorrenze sono stati contati separatamente. Il sito di recidiva è stato classificato in metastasi ematogena che coinvolge il polmone, fegato o di altri organi distanti, e le metastasi non ematogena che comprendeva coinvolgimento linfonodale e la diffusione peritoneale. tumori gastrici rimanenti sono stati esclusi dall'analisi criterio di ricorrenza.
Il tempo di sopravvivenza globale è stato calcolato a partire dalla data di resezione chirurgica fino a quando il giorno dell'ultimo contatto di follow-up o di morte per cancro. I dati sui pazienti deceduti per altre cause è stato censurato al momento della morte. L'analisi statistica è stata effettuata nel mese di aprile 2007. Il periodo medio di follow-up di tutti i pazienti sopravvissuti è stato di 40 mesi (range: 5 a 96 mesi) ed è stato completato da 98% dei pazienti arruolati. Durante l'analisi di sopravvivenza, 50 pazienti erano morti a causa dei loro tumori e 12 pazienti erano morti per altre cause.
Tissue microdissezione e amplificazione del DNA
Cinque seriali 7 sezioni micron di spessore di ogni fissato in formalina e incluso in paraffina campione di tessuto sono stati deparaffinate e brevemente macchiato con ematossilina eosina. Un singolo fuoco cellule tumorali-ricco è stato scelto da esame microscopico e una zona tumorale varia da 5 mm a 7 mm di diametro è stato sezionato manualmente allo stereomicroscopio (ingrandimento, × 40) con un bisturi chirurgico. I pezzi di tessuto microdissezione sono stati esaminati al microscopio se il contenuto delle cellule tumorali è stato > 70%, che era stato confermato per riflettere una differenza nel contenuto genetica tra i normali e tumorali tessuti [3, 7].
Circa 1.000 cellule tumorali microdissezione sono state incubate in 20 ml di tampone di estrazione del DNA (0,5% Tween-20 , 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM Tris pH 8,0, 0,5 mg /ml proteinasi K) a 37 ° C per 24 ore. Fissati in formalina DNA del tessuto incluso in paraffina tende ad essere scarsamente amplificato mediante PCR negli esemplari più vecchi. La maggior parte dei DNA sono stati estratti entro cinque anni dopo la preparazione dei campioni patologici, che garantisce la qualità del DNA per la PCR. La quantità di DNA, con qualità diverse, del lisato tessuto è stato determinato sulla base della intensità della banda PCR con 5-10 ng /ml di DNA, che è stato amplificato utilizzando un set di primer microsatellite, D19S226
(avanti: 5 ' - CCA GCA GAT TTT GGT GTT GTC TA - 3 '; inverso: 5' - ACA GAG CCA CCA GAG GTA GGA GT - 3 '; dimensione amplicone: 164 bp). L'amplificazione PCR è stata eseguita in una condizione di hot-start con l'utilizzo di un radioisotopo (α- 32P dCTP, PerkinElmer, Boston, MA, USA), come descritto in precedenza [3, 7]. Brevemente, per un totale di 10 microlitri miscela PCR ha subito 32 cicli di una fase di amplificazione seriale che consisteva di 94 ° C per 50 sec, una temperatura di ricottura specifico primer per 50 sec e 72 ° C per 1 min. Le sequenze microsatelliti radioisotopo sono stati separati su un gel di poliacrilammide al 6% che conteneva 7 M urea e sono state visualizzate mediante ripetute esposizioni di ogni autoradiograph e utilizzando uno scanner radioluminograph (BAS 2500, Fuji Photo Film Co. Ltd., Kanakawa, Giappone) .
Analisi di alleli microsatellite
le linee guida per il punteggio lo status di LOH e MSI sono state dettagliate in studi precedenti che hanno utilizzato lo stesso panel di marcatori microsatelliti [7]. Come un tipo di riferimento degli alleli microsatelliti, abbiamo recuperato i marcatori dinucleotide repeat che andavano da 88 bp a 247 bp in termini di dimensioni amplicone e che ha avuto una frequenza eterozigote > 50%. I marcatori microsatelliti altamente polimorfici su 8 cromosomi cancro-associata (3p, 4p, 5q, 8p, 9p, 13q, 17p e 18q), che spesso sofferto di LOH nel cancro gastrico [3, 7, 20], sono stati usati per aumentare la numero di alleli eterozigoti su ogni braccio (Figura 1A). I cinque marcatori microsatelliti su ogni braccio cromosomico mostrato chiare bande PCR degli alleli eterozigoti e calibrati per l'intera lunghezza delle otto cromosomi [3, 5]. Per garantire la riduzione cromosomica, la perdita cromosomico è stato assegnato quando l'evento LOH coinvolto più di due marcatori microsatelliti su un braccio cromosomico [13]. Quaranta coppie di primers microsatelliti sono stati mescolati in un totale di 22 provette ciascuna delle quali conteneva uno (4 miscele) o due (18 miscele) set di primer che attraversava ampliconi di dimensioni diverse alle stesse temperature di ricottura. Le bande microsatellite inequivocabili risultanti indicano l'alta specificità della condizione di PCR multiplex, che era utile per le piccole quantità di tessuti patologici microdissezione. Figura 1 L'analisi microsatellite PCR-based (A) e la classificazione genetica dei tumori gastrici (B). autoradiografie rappresentative dei campioni che sono stati esaminati con l'analisi PCR-based microsatelliti (A) e la classificazione genetica dei intestinale-tipo e diffuso tipo di cancro gastrico sulla base di perdita di eterozigosi (LOH) e instabilità dei microsatelliti (MSI) (B). (A) Il gel elettroforesi sinistra mostra alta frequenza MSI per oltre il 40% dei 15 marcatori omozigote. L'elettroforesi su gel destra mostra di alto livello LOH coinvolgono cromosomi 3p, 4p, 5q, 9p, 13q, 17p e 18q. Il normale (N) e DNA corrispondente tumorale (T) sono indicate sopra ogni banda allelica. L'asterisco indica MSI e LOH. Il DNA genomico microdissezione da tessuto di paraffina fissati in formalina incorporato è stato amplificato ed etichettato con [α-32P] dCTP nella condizione di avviamento a caldo di multiplex PCR. Un totale di 80 ampliconi microsatelliti da ogni campione sono stati eseguiti contemporaneamente su due gel di sequenziamento. (B) utilizzando un pannello di 40 marcatori microsatelliti su otto cromosomi cancro-associata, LOH è stata interpretata presso i marcatori di eterozigoti se il 40% o meno dei marcatori omozigoti esposto MSI. L'entità delle perdite cromosomiche, come ottenuto secondo il numero di cromosomi LOH-positivi, è stato diviso in alto livello (LOH-H) e basso livello (LOH-L) perdite sia per il intestinale e diffusi tipi. Nei casi di tipo diffuso tumori gastrici, zero o uno cromosomica perdita è stato classificato nel livello della linea di base (LOH-B).
In base alla stessa classificazione dei genotipi microsatelliti che è stato applicato nello studio precedente (Figura 1B) [ ,,,0],7], i profili alleliche dei marcatori microsatelliti sono stati analizzati 40 per MSI presso i marcatori omozigoti che hanno mostrato un paio di ombre volanti o balbuzie in un paio di normali e tumorali DNA. Perché MSI oscura lo stato allelica eterozigote, i profili alleliche dei 40 sequenze microsatelliti sono stati inizialmente analizzati per MSI presso i marcatori omozigoti. Lo stato LOH è stato determinato sulla base della perdita allelica nel marcatore eterozigoti (Figura 1B). L'entità delle perdite cromosomiche in ogni caso è stato segnato in base al numero di perdite cromosomiche costituzionali che coinvolgono più di un microsatellite allele
. Analisi di in-silico
dati per la densità genica e la trascrizione dei singoli cromosomi
A totale di 17,723 geni di riferimento identificati in un database pubblico (http:.. //genoma UCSC edu /, marzo 2006 assemblaggio) [21] sono stati analizzati per calcolare il numero di geni per 1-Mb segmento nucleotidi. analisi seriale dell'espressione genica (SAGE) i dati di normale mucosa gastrica è stato ottenuto da una banca dati pubblica (http:.... //www NCBI nlm NIH gov /geo /, "SAGE_Stomach_normal_B_antrum"). L'attività trascrizionale di singoli geni è stata calcolata combinando la mappa genetica di riferimento e le etichette dei geni espressi. Sulla base di un confronto tra il microarray e dei dati SAGE valutare i profili di espressione genica, il numero di trascrizioni conteggiati nei dati SAGE è stato trovato per stimare con precisione una grande differenza nella attività del gene tra i geni specifici di stomaco e geni housekeeping [21].
analisi statistica
test esatto di Fisher e χ
2 test sono stati usati per confrontare le caratteristiche clinico-patologiche con il genotipo microsatellite dei tumori gastrici. curve di probabilità sono stati calcolati secondo il metodo di Kaplan-Meier e confrontate con il log-rank test. L'analisi multivariata è stata eseguita con il metodo dei rischi proporzionali di Cox la con l'utilizzo di procedure graduale. valori di probabilità erano a due code, con un valore di P
inferiore a 0,05 essere considerati statisticamente significativi. Il pacchetto software statistico SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per l'analisi dei dati.
Risultati
analisi degli eventi LOH in tumori gastrici
La maggior parte dei tumori gastrici (116 fuori 145 casi) sono stati esaminati in una precedente analisi multifocale sui siti tumorali eterogenei da un dato cancro gastrico [3]. Il novanta per cento dei tumori gastrici esaminati sono stati trovati ad avere sia un livello simile di LOH o MSI comunemente condivisa da siti tumorali eterogenei e quindi ogni cancro gastrico è stato classificato in un singolo genotipo microsatellite, e non un genotipo misto. I genotipi microsatellite dei 27 casi supplementari sono stati valutati in base al livello di LOH e la presenza di MSI, che sono stati rilevati in un pezzo di tessuto singolo contenente un componente istologica rappresentante.
Ogni perdita cromosomica è stata correlata con i parametri clinico-del tumori gastrici (Tabella 1). La maggior parte delle perdite cromosomiche (4p, 5q, 9p, 13q, 17p e 18q) sono stati associati con la malattia ad esordio tardivo (P
< 0,05). Due o più perdite cromosomiche sono stati contemporaneamente in relazione con la posizione antrale (9p e 18q perdite), il intestinale, o di tipo misto istologia (5q, 17p e 18q perdite), e una scarsa sopravvivenza (3p, 9p e 13q perdite) (P
< 0,05). La perdita 17p è più frequente nei tumori intestinali di tipo (67%). La perdita 13q era più frequente nei tumori diffusa di tipo (47%). Tabella 1 I rapporti delle caratteristiche clinico-patologiche e la perdita singolo cromosomica
Caratteristiche

3p perdita perdita
4p
perdita 5q perdita
8p
9p perdita
13q perdita
17p perdita
18q perdita
No. di
pazienti 130
47
47
51
30
50

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