Kombinert epitelial-mesenchymale overgang med kreftstamcelleliknende markør som predikator for tilbakefall etter radikal reseksjon for mage cancer

Kombinert epitel-mesenchymale overgang med kreftstamcelleliknende markør som predikator for tilbakefall etter radikal reseksjon for magekreft
Abstract
Bakgrunn
Målet med studien var å identifisere forekomsten og prediktorer for tilbakefall etter kurativ reseksjon og den kliniske betydningen av epitel-mesenchymale overgang (EMT) og stamcelleliknende fenotyper i magekreft.
Metoder
i totalt 1.463 pasienter som gjennomgikk kurativ reseksjon for magekreft mellom januar 2001 og januar 2008 kl Drum Tower Hospital, 402 (27,5%) opplevde tilbakefall. De ble delt inn i tidlig tilbakefall (innen to år) og sent tilbakefall (mer enn to år). De clinicopathological egenskaper, inkludert fem EMT-relaterte proteiner (Snail-1, ZEB-1, E-cadherin, vimentin, og β-catenin) og magekreft stamcellemarkører CD44 og CD54, terapeutiske modaliteter, overlevelse etter tilbakefall, og tilbakefall mønstre ble sammenlignet mellom de to gruppene.
Resultater
Tap av E-cadherin uttrykk og avvikende uttrykk for vimentin og den kjente magekreft stamcelletrakter CD44 var signifikant assosiert med aggressiv clinicopathologic funksjoner. Multivariat analyse viste at scenen III magekreftpasienter med tidlig tilbakefall hadde større svulster og mer lymfeknutemetastase, kombinert med avvikende uttrykk EMT og kreft stamcelle markør, enn pasienter med sent gjentakelse. Tidlig tilbakefall var assosiert med mer fjernmetastaser enn sent tilbakefall og pasienter hadde en tendens til å dø innen to år etter tilbakefall.
Konklusjoner
Kombinert EMT med kreft stamcelleliknende markør er en prediktor for tilbakefall etter radikal reseksjon for magekreft. Avansert TNM stadium var assosiert med tidlig kreft død etter tilbakefall.
Bakgrunn
Magekreft er den fjerde vanligste kreftformen i verden, og kirurgi er fortsatt den viktigste behandlingen, med kurativ hensikt. Selv etter gastrektomi og lymphadenectomy, hvert år mange pasienter dør av tilbakefall. Den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT), en utviklingsmessig prosess hvor epitelceller utvise redusert intercellulær adhesjon og erverve trekk fibrinoblast egenskaper, er ansett å være kritisk for invasive og metastatisk kreft progresjon i [1]. Prosessen med EMT er assosiert med nedregulering av epitel-markører, unormal translokasjon av β-catenin, og avvikende oppregulering av mesenchymale markører. Cancer stamceller er celler i en svulst som besitter selvfornyelse og tumor-initiering kapasiteter. I magekreft, ble CD44-positive tumorceller vist seg å ha kreft stamcelleegenskaper, inkludert tumor initiere evne [2], og Chen et al
. [3] viste at CD44 + CD54 + celler utvise kreftstamcelle evner i mage kreft vev. Disse tumor initiere celler gir et reservoar som kan forårsake svulst tilbakefall etter behandling [4].
Tidligere Ryu et al
. [5] viste at en kombinasjon av EMT og stamcelle-lignende fenotyper er en viktig indikator for aggressiv biologiske oppførsel av magekreft; men få studier har i dag undersøkt EMT med kreft stamcelleliknende markør i magekreft med tilbakefall og prognose. Målet med denne studien var å karakter tilbakefall mønstre, identifisere prediktorer tid av tilbakefall og innledende tilbakefall mønstre av magekreft med tidlig og sent tilbakefall, og finne risikofaktorer for å predikat tidlig tilbakefall etter radikal reseksjon for magekreft. Dette kan hjelpe i preoperativ vurdering av hensiktsmessige terapeutiske strategier og i å gi mer intensive og skreddersydd oppfølging strategier for høyrisikopasienter.
Metoder
Pasient utvalg
Mellom januar 2001 og januar 2008, med unntak av pasienter som ble ikke fulgt opp eller dårlig etterlevelse, totalt 1.463 pasienter gjennomgikk kurativ reseksjon for magekreft ved Drum Tower Hospital. Totalt 402 (27,5%) av disse pasientene opplevde tilbakefall og ble senere inkludert i studien; dermed tilbakefall i vår studie var 27,5%. Gjennomsnittsalderen for de 402 pasientene var 64,7 år (spredning: 26 til 91 år), med en mannlig: kvinne ratio på 1,87: 1. Medisinske diagrammer og patologirapporter ble gjennomgått for å registrere kliniske og patologiske data. For å vurdere om uttrykket profiler av de ulike EMT markører var forskjellig mellom primære og metastatisk mage kreft, tilfeller med regional lymfeknutemetastase ble også vurdert. Når det gjelder tidspunktet for gjentakelse, noen svulster gjenta seg i løpet av det første året etter reseksjon, og i disse tilfellene, kan mistenkes utilstrekkelig radikal kirurgisk tilnærming eller systematisk metastase ved operasjon. I vår studie har vi definert tidlig tilbakefall som tilbakefall innen to år etter operasjonen. Late residiv ble definert som residiv mer enn to år etter operasjonen. Disse 402 pasientene ble delt inn i to grupper, nemlig de tidlige tilbakefall gruppe, som inneholdt 248 pasienter, og på slutten av tilbakefall gruppe, som inneholdt 154 pasienter. Eksklusjonskriterier inkluderte synkron mage dobbel kreft, en tidligere historie av kirurgi for magekreft, mage stubbe kreft eller kreft anatomisk klassifisert som kreftfaren i henhold til den amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) syvende utgaven [6].
Studien ble godkjent av de kliniske forskningsetiske komiteer i Drum Tower Hospital og informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Tissue matrise og immunhistokjemi
alle prøvene i studien ble fjernet fra formalinfiksert parafin-embedded mage kreft vev. For alle de matriser ble tre kjerner fra forskjellige områder av tumoren i hvert tilfelle fjernet og plassert inn i en ny tom mottaker parafin blokken som tidligere beskrevet av Hsu et al
. [7], ble og 4-mikrometer tykke seksjoner innhentet for immunhistokjemi. Prøvene ble deparaffinized og dehydrert etter en gradert serie av etanol løsninger (Nanjing Chemical Reagens Co, Ltd, Nanjing, Kina). Immunhistokjemisk farging for EMT-beslektede proteiner snegle-1, sink finger E-box-bindende homeobox 1 (ZEB-1), vimentin, E-cadherin, β-catenin, og kreft stamcelle-lignende markører CD44 og CD54, ble utført og vurdert i henhold til den tidligere metoden [3, 5].
som for statistisk analyse av multiple markører, ble prøven registrert som å ha positiv immunoreaktivitet for hvert antistoff, med unntak av E-cadherin, hvis mer enn 5% av kreftcellene var immunreaktivt, og tumorceller med mindre enn 5% ble ansett som negativt. De scoring kriterier for E-cadherin ble definert som "positive (intakt)" når immunoreaktivitets på cellemembranen var til stede i mer enn 25% av mage kreftceller.
Mønstre av tilbakefall
Mønstre av tilbakefall rapportert representerer første områdene dokumentert tilbakevendende sykdom etter kurativ reseksjon. Tilbakefall ble dokumentert fra de første kliniske eller radiologiske tegn på sykdom med en nådeløs kurs som fører til tumorprogresjon og /eller død. Bekreftelse gjennom biopsi ble anbefalt for noen bevis for tilbakevendende sykdom eller fjernmetastaser. Gjentakelse mønstre ble klassifisert som lokoregionalt, peritoneal, eller hematogenous. Lokoregionalt tilbakefall ble definert som en hvilken som helst kreft tilbakefall ved reseksjon marg eller lymfeknuter (inkludert regionale noder samt retropancreatic og para-aorta noder) eller drift seng innenfor det område av reseksjon (under mellomgulvet og leveren, og over bukspyttkjertelen og abdominal sår). Peritoneal residiv ble definert som enhver kreft tilbakefall i bukhulen på grunn av intraperitoneal distribusjon inkludert visceral metastaser, rektal hylle, pericholedochal, og periureteral infiltrasjon. Hematogenous residiv ble definert som enhver metastatisk lesjon påvist i lever, lunge, bein og andre fjerne organer.
Oppfølging
Etter operasjonen ble alle pasienter følges opp jevnlig. Oppfølgings Vurderingene ble utført hver tredje måned for de første fem årene etter operasjonen, og hvert halvår deretter fram til pasientens død. De oppfølgingsrutiner inkludert en medisinsk historie, fysisk undersøkelse, rutinemessige blodprøver, leverfunksjonstester, måling av svulst markør nivåer (carcinoembryonic antigen og karbohydrat antigen 199), en kiste røntgenbilde, og andre imaging studier. Alle rutinemessige prosedyrer ble utført av en kirurg, ble esophagogastroduodenoscopy utført av en gastroenterolog, og øvre gastrointestinal serien, mage sonogram, og computertomografi (CT) skanner ble utført av en radiolog. For bekreftet tilbakevendende sykdom eller fjernmetastaser, ble biopsier ikke oppnådd for nye, flere lungelesjoner eller lesjoner karakteristisk for ossøs metastaser bemerket på CT eller hele kroppen bein skanner. Når metastase ble mistenkt, ble ytterligere teknikker anvendes, slik som bein skanning, positronemisjonstomografi (PET), og biopsi prøvetaking.
Statistisk analyse
Alle verdier er uttrykt som middelverdi ± standardavvik. Kategoriske variabler ble analysert ved hjelp av χ 2 test og kontinuerlige variabler ved hjelp av uavhengige prøver t-test. Logistisk regresjon multivariat analyse ble utført for å bestemme forskjellene mellom de to gruppene. Analyse av overlevelse ble utført av Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene mellom kurvene ble testet ved hjelp av en to-tailed log-rank test. P
< 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS (SPSS 13.0 for Windows, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Programvare
Resultater
Uttrykk av epitel-mesenchymale overgang og kreft stamcelleliknende markør tilknytning tumorresidiv
Tabell 1 viser clinicopathologic karakteristikk av pasienter med tidlig tilbakefall og sent gjentakelse. Blant de perioperative variablene er registrert for univariat analyse var: tilstedeværelse av CD44, CD54, og vimentin, tap av E-cadherin og β-catenin uttrykk, med en tumorstørrelse på 5 cm eller mer, mer avansert T-fasen, og en mer avansert TNM stadium med tidlig tilbakefall til sent tilbakefall multivariat analyse ble benyttet for å identifisere de uavhengige risikofaktorer for generelle gjentakelse. Analysen viste at pasienter som ble diagnostisert med et tumorstørrelse på 5 cm eller mer, og en mer avansert stadium TNM, kombinert med EMT ekspresjon og ekspresjon av kreft stamcelle markør CD44, var fremtredende i begynnelsen av tilbakefall (tabell 2) .table 1 Clinicopathological egenskaper av tilbakevendende magekreftpasienter
Tidlig tilbakefall (n = 248) n (%)
Late tilbakefall (n = 154) n (%)
P-verdi

Age, år
0,392
< 65
109
61
≥65
139
93
kjønn, mann /kvinne
162 /86
100/54
0,937
Tumor størrelse, cm
0,013
< 5
76
68
≥5
172
86
Gastrectomy
0,061
Total
91
71
Subtotal
157
83
beliggenhet
0,232
Øvre
46
27
Middle
49
20
Nedre
130
95
Diffuse
23
12
Gross utseende
0,001
Overflatisk svulst
18
25
Bormann type I og II
25
40
Bormann type III og IV
205
89
Histologi typen
0.315
Differensiert
76
40
Undifferentiated
172
114
Lauren klassifisering
0,572
Tarm typen
104
69
Diffuse skriver
144
85
lymfeknutemetastaser
0,002
Negativ
52
54
Positive
196
100
Lymphovascular invasjon
0.003
Fraværende
57
56
Presenter
191
96
Dybde invasjon
< 0,001
T1 og T2
46
53
T3 og T4
202
101
TNM stadium
< 0,001
jeg
14
27
II
43
59
III
191
68
lymfeknutedisseksjon
0,414
D1
109
75
D2
86
54
D3
53
25
EMT uttrykk (%)
Aberrant uttrykk for mesenchymale markør
Snail-1
117(47.2)
64(41.6)
0.271
ZEB-1
168(67.7)
109(70.8)
0.522
Vimentin
87(35.1)
21(13.6)
<0.001
Expression tap av epitel markør
E-cadherin
112 (45,2)
35 (22,7)
< 0,001
β-catenin
29 (11,7)
19 (12,3)
0,846
uttrykk for kreftstamcelle markør (%)
CD44
163 (65,7)
71 (46,1)
0,001
CD54
120 (48,3)
63 (40,9)
0,037
Adjuvant kjemoterapi, ja /nei
221/27
142/12
0,308
Tabell 2 Multivariat analyse av faktorer uavhengig assosiert med timingen av gjentakelse (tidlig versus sen)
tidlig
Late
P-verdi
Odds ratio
95,0% KI for eksperiment B

Tumor størrelse ≥5 cm
172 (69,4)
86 (55,8)
0,001
8.750 product: (2,265 til 33,799)
TNM stadium III
191 ( 77,0)
68 (44,2)
0,040
0,493 product: (0,251 til 0,970)
EMT uttrykk (%)
vimentin
87 (35,1)
21 (13,6 )
0,031
2,359 product: (1,082 til 5,145)
E-cadherin
112 (45,2)
35 (22,7)
< 0,001
0,125
(0,046 til 0,338)
uttrykk for kreftstamcelle markør (%)
CD44
163 (65,7)
71 (46,1)
0,017
0,297 product: (0,108 til 0,806 )
Mønstre av tilbakefall
median tid til tilbakefall var 17,0 måneder (range: 2,0 til 89,0). De fleste tilbakefall i vår studie gruppe (248 av 402, 61,7%) skjedde i løpet av to år etter kurativ kirurgi (tabell 3). I den tidlige tilbakefall gruppen, den vanligste mønsteret var hematogenous metastase, etterfulgt av lokoregionalt og peritoneal gjentakelse. Inkludert mønstre som utviklet samtidig, lokoregionalt og hematogenous tilbakefall var det vanligste mønsteret, etterfulgt av peritoneal gjentakelse. I slutten av tilbakefall gruppen, den vanligste mønsteret var lokoregionalt og peritoneal tilbakefall, etterfulgt av hematogenous tilbakefall som enkelt mønstre, og når mønstre som utviklet samtidig ble inkludert, lokoregionalt tilbakefall var fortsatt den vanligste mønsteret. Fjernmetastaser er mer vanlig i tidlig tilbakefall, men peritoneal formidling er ikke signifikant. Blant pasienter med hematogenous metastaser, er levermetastaser mer vanlig i tidlig recurrence.Table 3 Mønsteret for første tilbakefall av magekreft
Tidlig tilbakefall (n = 248) n (%)
Late gjentakelse (n = 154) n (%)
P-verdi
Lokal regional gjentakelse
161 (64,9)
85 (55,2)
0,052
Hepatoduodenal ligament
57 (23,0)
37 (24)
0,810
Perigastric område
25 (10,1)
24 (15,6)
0,101
Anastomose
23 (9,3)
15 (9,7)
0,877
Remnant magen
15 (6)
12 (7,8)
0,601
Peripancreatic område
12 (4,8)
9 (5.8)
0,660
bukveggen
10 (4)
7 (4,5)
0,804
lymfeknute
51 (20,6)
27 (17,5)
0,455
Blandet
10 (4)
3 (1,9)
0,251
Distant metastase
207 (83,5)
109 (70,8)
0,003
Peritoneal formidling
106 (42,7)
62 (40,3)
0,624
hematogenous metastasis
112(45.2)
49(31.8)
0.008
Liver
64(25.8)
23(14.9)
0.010
Lung
25(10.1)
17(11)
0.760
Bone
9(3.6)
4(2.6)
0.570
Adrenal gland
7(2.8)
3(1.9)
0.584
Brain
2(0.8)
0
0.264
Skin
2(0.8)
0
0.264
Mixed
3(1.2)
2(1.3)
0.938
Overlevelsestid etter tilbakefall
fleste pasienter med tilbakefall av magekreft (321 av 402, 79,9%) døde innen to år etter tilbakefall. Median overlevelse etter tilbakefall var 8,1 måneder i tidlig tilbakefall og 13,3 måneder i slutten av tilbakefall, henholdsvis. Totalt 16 pasienter overlevde mer enn fem år etter tilbakefall: 10 med tidlig tilbakefall og seks med sent tilbakefall. Blant de 10 pasienter med tidlig tilbakefall, tilbakefall mønster inkludert en levermetastaser, to lungemetastaser, tre anastomose tilbakefall, to hepatoduodenal ligament tilbakefall, en bukveggen tilbakefall, og en peritoneal seeding. Blant de seks pasienter med sent residiv gjentakelsesmønster inkludert en abdominal snitt tilbakefall, to levermetastaser, en levning magen tilbakefall, en hepatoduodenal ligament tilbakefall, og en anastomose tilbakefall med lever invasjon. Overlevelse etter tilbakefall var signifikant kortere i den tidlige gruppen (P
< 0,001, log-rank test) (figur 1). Figur 1 Sammenligning av overlevelse etter tilbakefall av Kaplan-Meir.
Diskusjon
Magekreft er den fjerde største årsaken til kreftdødelighet i verden. Lokoregionalt tilbakefall kan forekomme etter kurativ reseksjon, inkludert tilstøtende lymfeknuter reseksjon og tverrfaglig behandling, eventuelt i form av peritoneal carcinosis og /eller fjernmetastaser, som er en av grunnene til den høye frekvensen av tilbakefall. Carcinoma tilbakefall er egentlig dødelig, og så langt er det ingen spesifikke behandlinger for å unngå tilbakefall [8-10].
Kliniske betydningen av EMT har blitt rapportert i ulike kreft hos mennesker, og spesifikke mekanismene som er involvert i kreft progresjon, for eksempel unndragelse av apoptose, motstand mot kjemoterapi, og oppkjøpet av stamcelleliknende egenskaper og deres innflytelse på pasientens overlevelse har blitt foreslått [1, 5, 11, 12]. CD44 er et trans glykoprotein som er godt kjent som en kreftstamcelle markør i magekreft [2]. CD44 er positivt og signifikant assosiert med metastase, tilbakefall og dødelighet i magekreft [13, 14].
I denne studien uttrykk for mesenchymale markør vimentin var hyppigere i tidlig tilbakefall enn i slutten av tilbakefall kreft (P
< 0,001), og E-cadherin uttrykk ble tapt i 112 (45,2%) av 248 tidlige tilbakefall kreft, men bare 35 sent tilbakefall (22,7%) kreft viste tap av E-cadherin uttrykk (P
< 0,001). Disse funnene viser at omleggingen av epithelial mage celler kan fremme svulst tilbakefall og metastasering. CD44 og CD54 uttrykk ble også funnet oftere i tidlige tilbakefall pasienter enn for sent tilbakefall (P
= 0,001, P
= 0,037), noe som tyder på at stamcellemarkører kan tas som en promoter for svulst fremgang.
det har vært flere studier [1, 5] på kompleksiteten i samspillet mellom EMT-relaterte proteiner og deres effekt på kreft tilbakefall. Den foreliggende undersøkelse fastslått at kombinasjonen av endringer i protein ekspresjon av vimentin, E-cadherin, og CD44 var den mest effektive prognostiske faktor i magekreft. I tillegg har denne kombinasjonen var et uavhengig prediktiv faktor av tilbakefall, sammen med en konvensjonell clinicopathologic parameter som pTNM scene og histologisk differensiering.
I serien, er det en stor forskjell i størrelse kreft, grovt utseende, lymfeknutemetastase, lymphovascular invasjon, dybden av invasjonen, og scenen mellom de tidlige og sene tilbakefall grupper og pasienter med CD44 og vimentin, og tap av E-cadherin og β-catenin uttrykk, har en høyere tendens til tidlig tilbakefall. Våre resultater viste at pasienter med en tumor størrelse på 5 cm eller mer, og en mer avansert TNM stadium, kombinert med EMT uttrykk og uttrykk av kreft stamcelle markør CD44, var fremtredende i tidlig tilbakefall i den multivariate analysen.
As for tilbakefall mønstre, generelt, er det tre hoved tilbakefall mønstre av magekreft etter kurativ kirurgi: lokoregionalt gjentakelse, peritoneal formidling, og hematogenous metastasering. Våre data viste at pasienter med tidlig tilbakefall hadde mer fjernmetastaser, men ikke peritoneal formidling, enn de med sent tilbakefall. Hematogenous metastaser var mer vanlig i tidlig tilbakefall, som var lik noen studier [9, 10]. Det er ingen signifikant forskjell mellom tidlig og sen tilbakefall i forhold til lokoregionalt tilbakefall. Vi fant ut at lever, lunge og bein er de mest hematogenous metastaserende organer. Dette resultatet er sammenfallende med andre [10, 15]. Levermetastaser viser en tendens til å oppstå tidligere, mens lunge og skjelettmetastaser oppstå senere. Leveren er det første filteret av cancerceller via portveneblodstrømmen fra magesekken; lunge virker som et sekundært filter. Dette resultatet tyder på at pasienter bør overvåkes nøye for hematogenous metastaser i løpet av de to første årene av oppfølging, og for lokoregionalt eller peritoneal tilbakefall senere.
Survival ganger etter tilbakefall har sjelden blitt dokumentert i tidligere studier, men en ny studie utført av Wu et al
. [16] rapporterte at de fleste pasienter bukket innen ett år å få en diagnose av tilbakefall, med median overlevelse tid etter tilbakefall blir bare 6,7 måneder. I våre resultater, median overlevelse av den tidlige tilbakefall gruppen var signifikant lavere (8,06 versus 14,97 måneder, P
< 0,001). Til tross for dårlig overlevelse etter tilbakefall av kreft og en ugunstig reaksjon på kjemoterapi hos noen pasienter, 16 pasienter hadde langsiktig overlevelse på mer enn fem år etter tilbakefall. Vi foreslår at tett oppfølging med B-ultralyd og endoscopies er viktig, spesielt i de to første årene, for å forlenge overlevelsen.
Konklusjoner
hematogenous metastaser ble funnet å være vanlig hos pasienter som opplevde tilbakefall innen to år med kurativ reseksjon, og pasienter med store tumorstørrelse (≥5 cm) og avansert TNM (trinn III) ble funnet å være mer utsatt for tidlig tilbakefall. EMT og stamcelleliknende fenotyper er korrelert med aggressive kliniske funksjoner i magekreft, og de tre proteiner, E-cadherin, vimentin og CD44, kan være den beste kombinasjonen for å forutsi pasientens tilbakefall
. Merknader
ret- fang Xu Wei-Jie Zhang bidratt likt til dette arbeidet
Forkortelser
EMT.
Epiteliale-mesenchymale overgang
ZEB-en:
Sink finger E-box-bindende protein en
CD44:
Cluster av differensiering 44
CD54:
Cluster av differensiering 54
AJCC:
amerikanske Joint Committee on Cancer
CT:
Computertomografi

PET:
Positronemisjonstomografi
SPSS:
statistiske produkter og tjenester
TNM:
'svulst, node, metastaser'
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (stipend nummer: 81201909)., og Nanjing Medical Science og Technology Development program (tilskudds tall: QYK11166, YKK12072).
Forfattere 'originale legges filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12957_2014_1838_MOESM1_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 1 Konkurrerende interesser
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Forfatternes bidrag
GFX og WJZ deltok i studien design, kliniske data og prøvetaking, og dataanalyse. QS og xyx som patologer re-klassifisert alle adenokarsinom prøver. GFX og WJZ skrev utkastet papir. XPZ og WXG bidratt likt: både unnfanget og gjennomført undersøkelsen, og revidert hele manuskriptet. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Den oxytocin /vasopressin reseptor antagonist Atosiban forsinker gastrisk tømming av et halvfast måltid sammenlignet med saltvann i menneskets
• Prediksjon av svulst tilbakefall etter kurativ reseksjon i magekreft basert på BCL-2 uttrykk