Kombineret epithelial-mesenchymal overgang med cancer stamcelle-lignende markering som prædiktorer for tilbagefald efter radikal resektion for mavekræft

Kombineret epithelial-mesenchymal overgang med cancer stamcelle-lignende markering som prædiktorer for tilbagefald efter radikal resektion for mavekræft
Abstract
Baggrund
Formålet med undersøgelsen var at bestemme forekomsten og prædiktorer for tilbagefald efter helbredende resektion og den kliniske betydning af epitelial-mesenkymale overgang (EMT) og stamceller-lignende fænotyper i mavekræft.
Metoder
i alt 1.463 patienter, der undergik helbredende resektion for mavekræft mellem januar 2001 januar 2008 Drum Tower Hospital, 402 (27,5%) oplevede recidiv. De var inddelt i tidlig recidiv (inden for to år) og sen recidiv (mere end to år). De klinisk-patologiske karakteristika, herunder fem EMT-relaterede proteiner (Snail-1, ZEB-1, E-cadherin, vimentin, og β-catenin) og mavekræft stamceller markører CD44 og CD54, terapeutiske modaliteter, overlevelsestid efter tilbagefald, og gentagelse mønstre blev sammenlignet mellem de to grupper.
Resultater
Tab af E-cadherin ekspression og afvigende ekspression af vimentin og den kendte mavekræft stamceller maker CD44 var signifikant associeret med aggressive clinicopathologic funktioner. Multivariat analyse viste, at fase III gastrisk cancer patienter med tidlig recidiv havde større tumorer og mere lymfeknude metastaser, kombineret med afvigende udtryk EMT og kræft stamceller markør, end patienter med sent gentagelse. Tidlig tilbagefald var forbundet med mere fjernmetastaser end sent tilbagefald og patienter tendens til at dø inden for to år tilbagefald.
Konklusioner
Kombineret EMT med kræft stamcelle-lignende markør er en indikator for tilbagefald efter radikal resektion for mavekræft. Avanceret TNM stadie var forbundet med tidlig cancer død efter tilbagefald.
Baggrund
mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform i verden, og kirurgi er stadig den vigtigste behandling, med helbredende hensigt. Selv efter gastrektomi og lymphadenectomy, hvert år mange patienter dør af tilbagefald. Epitel-mesenkymale overgang (EMT), en udviklingsproces, hvor epitelceller udvise reduceret intercellulær adhæsion og erhverve migrerende fibroblastiske egenskaber, anses for at være kritisk for invasiv og metastatisk progression i cancer [1]. Processen med EMT er forbundet med nedregulering af epiteliale markører, unormal translokation af β-catenin, og afvigende opregulering af mesenchymale markører. Cancer stamceller er celler inden en tumor, der besidder selvfornyelse og tumorfremkaldende kapacitet. I mavekræft, blev CD44-positive tumorceller vist sig at have kræft stamceller egenskaber, herunder tumor-initierende evne [2], og Chen et al
. [3] viste, at CD44 + CD54 + celler udviser cancer stamceller kapaciteter i gastrisk kræft væv. Disse tumor-initierende celler tilvejebringer et reservoir, som kan forårsage tumor tilbagefald efter behandling [4].
Tidligere Ryu et al
. [5] viste, at en kombination af EMT og stamcelle-lignende fænotyper er en vigtig prædiktor for aggressiv biologiske opførsel af gastrisk cancer; dog få studier øjeblikket har undersøgt EMT med kræft stamcelle-lignende markør i mavekræft med tilbagefald og prognose. Formålet med den aktuelle undersøgelse var at karakterisere gentagelsesmønstre, identificere prædiktorer for tidspunktet for tilbagefald og indledende tilbagefald mønstre af mavekræft med tidlig og sen tilbagefald, og find risikofaktorer til prædicere tidligt tilbagefald efter radikal resektion for mavekræft. Dette kunne hjælpe i den præoperative vurdering af hensigtsmæssige terapeutiske strategier og i at yde mere intensive og skræddersyede opfølgningsstrategier for højrisikopatienter.
Metoder
Patient valg
Mellem januar 2001 og januar 2008 med undtagelse af patienter, der gik tabt til opfølgning eller dårlig compliance, i alt 1.463 patienter gennemgik helbredende resektion for mavekræft på Drum Tower Hospital. I alt 402 (27,5%) af disse patienter oplevede tilbagefald og blev efterfølgende inkluderet i undersøgelsen; således den recidivraten i vores undersøgelse var 27,5%. Den gennemsnitlige alder af de 402 patienter var 64,7 år (range: 26 til 91 år), med en mandlig: kvinde ratio på 1,87: 1. Medicinske diagrammer og patologi rapporter blev revideret til at registrere kliniske og patologiske data. For at evaluere om udtrykket profiler af de forskellige EMT markører var forskellige mellem primære og metastatiske gastriske cancere, blev sager med regional lymfeknude metastaser også evalueret. Med hensyn til timingen af ​​tilbagefald, nogle svulster gentage sig inden for det første år efter resektion, og i disse tilfælde kan være mistanke utilstrækkelig radikal kirurgisk tilgang eller systematisk metastase ved operation. I vores undersøgelse, vi definerede tidligt recidiv som tilbagefald inden for to år efter operationen. Sent recidiv blev defineret som tilbagefald mere end to år efter operationen. Disse 402 patienter blev delt i to grupper, nemlig de tidlige gentagelse gruppe, som indeholdt 248 patienter, og den sene gentagelse gruppen, som indeholdt 154 patienter. Eksklusionskriterier inkluderet synkrone gastrisk dobbelt kræft, en tidligere historie af kirurgi for mavekræft, gastrisk stub kræft eller kræft anatomisk klassificeret som kræft i spiserøret i henhold til den amerikanske Blandede Cancer (AJCC) syvende udgave [6].
Undersøgelsen blev godkendt af de kliniske forskning etiske komitéer i Drum Tower Hospital og informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.
Tissue array og immunhistokemi
alle prøver i undersøgelsen blev fjernet fra formalin-fikserede paraffin-indstøbt mavekræft væv. Af alle de arrays blev tre kerner fra forskellige områder af tumoren i hvert tilfælde fjernes og anbringes i en ny tom recipient paraffinblok som beskrevet tidligere af Hsu et al
. [7], blev og 4 um tykke snit opnået for immunhistokemi. Prøverne blev deparaffineret og dehydreret af en gradueret serie af ethanol-løsninger (Nanjing Chemical Reagent Co Ltd, Nanjing, Kina). Den immunhistokemiske farvning for EMT-relaterede proteiner snail-1, zinkfinger E-box-bindende homeobox 1 (ZEB-1), vimentin, E-cadherin, β-catenin og cancer stamcelle-lignende markører CD44 og CD54, blev udført og evalueret i overensstemmelse med den tidligere metode [3, 5].
som for statistisk analyse af flere markører, blev prøven registreret som havende positiv immunreaktivitet for hvert antistof, undtagen E-cadherin, hvis mere end 5% af cancercellerne var immunoreaktive, og tumorceller med mindre end 5% blev betragtet som negative. Kriterierne for E-cadherin scoring blev defineret som "positiv (intakt) ', når immunoreaktivitet på cellemembranen var til stede i mere end 25% af mavens kræftceller.
Mønstre af tilbagefald
Mønstre af tilbagefald rapporteret repræsenterer første steder med dokumenteret tilbagevendende sygdom efter helbredende resektion. Gentagelse blev dokumenteret fra de første kliniske eller radiologiske tegn på sygdom med en vedholdende kursus, der fører til tumor progression og /eller død. Bekræftelse gennem biopsi blev anbefalet for tegn på tilbagevendende sygdom eller fjernmetastaser. Gentagelse mønstre blev klassificeret som locoregional, peritoneal eller hæmatogen. Locoregional tilbagefald blev defineret som enhver cancertilbagefald på resektionsranden eller lymfeknuder (herunder regionale knudepunkter samt retropancreatic og para-aortiske knudepunkter) eller drift seng i området ved resektion (under mellemgulvet og lever, og over pancreas og abdominale sår). Peritoneal tilbagefald blev defineret som enhver cancertilbagefald inden bughulen på grund af intraperitoneal fordeling herunder visceral metastase, rektal hylde, pericholedochal, og periureteral infiltration. Hæmatogen tilbagefald blev defineret som enhver metastatisk læsion påvist i lever, lunge, knogle og andre fjerntliggende organer.
Opfølgning
Efter operationen blev alle patienter fulgt op på regelmæssigt. Opfølgende vurderingerne blev foretaget hver tredje måned i de første fem år efter operationen, og hver sjette måned derefter indtil patientens død. De opfølgende procedurer omfattede en sygehistorie, fysisk undersøgelse, rutinemæssige blodprøver, leverfunktionsprøver, måling af tumor markør niveauer (carcinoembryonisk antigen og kulhydrat-antigen 199), en røntgenundersøgelse af thorax, og andre billeddiagnostiske undersøgelser. Alle rutinemæssige procedurer blev udført af en kirurg, blev gastroskopi udføres af en gastroenterolog, og øvre gastrointestinal serier, abdominal sonogram, og computertomografi (CT) scanninger blev udført af en radiolog. For bekræftede tilbagevendende sygdom eller fjernmetastaser blev biopsier ikke opnået for nye, flere lungelæsioner eller læsioner karakteristiske for ossøse metastaser angivet på CT eller hele kroppen knogle scanninger. Når metastase var mistanke blev yderligere teknikker anvendes, såsom knoglescanning, positronemissionstomografi (PET), og biopsi prøveudtagning.
Statistisk analyse
Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Kategoriske variable blev analyseret ved hjælp af χ 2 test og kontinuerlige variabler ved hjælp af den uafhængige-prøver t-test. Logistisk regression multivariat analyse blev udført for at bestemme forskellene mellem de to grupper. Analyse af overlevelse blev udført ved Kaplan-Meier-metoden, og forskelle mellem kurverne blev testet under anvendelse af en to-halet log-rank test. P
< 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS (SPSS 13,0 til Windows, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Software
Resultater
Angivelse af epitelial-mesenkymale overgang og kræft stamcelle-lignende markør association med tumor recidiv
tabel 1 viser clinicopathologic egenskaber ved patienter med tidlig recidiv og sen gentagelse. Blandt de perioperative variabler konstateret for univariat analyse var: tilstedeværelsen af ​​CD44, CD54, og vimentin, tab af E-cadherin og β-catenin-ekspression, med en tumor størrelse på 5 cm eller mere, mere avanceret T-stadium, og en mere avanceret TNM stadie med tidlig recidiv til sent gentagelse Multivariat analyse blev anvendt til at identificere de uafhængige risikofaktorer for den samlede gentagelse. Analysen viste, at patienter, der lider en tumorstørrelse på 5 cm eller mere, og en mere avanceret TNM stadie, kombineret med EMT ekspression og ekspression af cancer stamcellemarkør CD44, var fremtrædende i tidlige tilbagefald (tabel 2) .table 1 klinisk-patologisk kendetegn af tilbagevendende gastrisk kræftpatienter
Tidlig recidiv (n = 248) n (%)
Late recidiv (n = 154) n (%)
P-værdi

Alder, år
0,392
< 65
109
61
≥65
139
93
Køn, mand /kvinde
162 /86
100/54
0,937
Tumor størrelse, cm
0,013
< 5
76
68
≥5
172
86
gastrektomi
0,061
Total
91
71
Subtotal
157
83
Beliggenhed
0,232
Upper
46
27
Mellemøsten
49
20
Lavere
130
95
Diffus
23
12
Gross udseende
0,001
Overfladisk tumor
18
25
Bormann type I og II
25
40
Bormann type III og IV
205
89
Histologi typen
0,315
Differentieret
76
40
Udifferentieret
172
114
Laurens klassifikation
0,572
Intestinal typen
104
69
Diffuse skriv
144
85
lymfeknudemetastase
0,002
Negativ
52
54
Positiv
196
100
Lymphovascular invasion
0,003
Fraværende
57
56
Præsenter
191
96
dybde invasion
< 0,001
T1 og T2
46
53
T3 og T4
202
101
TNM stadie
< 0,001
jeg
14
27
II
43
59
III
191
68
lymfeknudedissektion
0,414
D1
109
75
D2
86
54
D3
53
25
EMT udtryk (%)
afvigende ekspression af mesenchymale markør
Snail-1
117(47.2)
64(41.6)
0.271
ZEB-1
168(67.7)
109(70.8)
0.522
Vimentin
87(35.1)
21(13.6)
<0.001
Expression tab af epitelial markør
E-cadherin
112 (45,2)
35 (22,7)
< 0,001
β-catenin
29 (11,7)
19 (12,3)
0,846
Angivelse af kræft stamceller markør (%)
CD44
163 (65,7)
71 (46,1)
0,001
CD54
120 (48,3)
63 (40,9)
0,037
Adjuverende kemoterapi, ja /nej
221/27
142/12
0,308
tabel 2 Multivariate analyse af faktorer uafhængigt forbundet med timingen af recidiv (tidlig versus sen)
tidlig
Late
P-værdi
Odds forholdet
95,0% CI for eksperiment B

Tumor størrelse ≥5 cm
172 (69,4)
86 (55,8)
0,001
8.750
(2,265 til 33,799)
TNM stadie III
191 ( 77.0)
68 (44,2)
0,040
0,493
(0,251 til 0,970)
EMT udtryk (%)
vimentin
87 (35,1)
21 (13,6 )
0,031
2,359
(1,082-5,145)
E-cadherin
112 (45,2)
35 (22,7)
< 0,001
0,125
(0,046-0,338)
Angivelse af kræft stamceller markør (%)
CD44
163 (65,7)
71 (46,1)
0,017
0,297
(0,108-0,806 )
Mønstre af tilbagefald
Den gennemsnitlige tid til tilbagefald var 17,0 måneder (interval: 2,0-89,0). De fleste gentagelser i vores undersøgelsesgruppe (248 ud af 402, 61,7%) fandt sted inden for to år efter kurativ kirurgi (tabel 3). I den tidlige gentagelse gruppe, den mest almindelige mønster var hæmatogen metastase, efterfulgt af locoregional og peritoneal gentagelse. Herunder mønstre, der er udviklet sideløbende, locoregional og hæmatogen gentagelse var den mest almindelige mønster, efterfulgt af peritoneal gentagelse. I slutningen af ​​gentagelse gruppen, den mest almindelige mønster var locoregional og peritoneal gentagelse, efterfulgt af hæmatogen tilbagefald som enkelte mønstre, og når mønstre, der er udviklet på samme tid var medtaget, locoregional gentagelse var stadig den mest almindelige mønster. Fjernmetastaser er mere almindelig i den tidlige tilbagefald, men peritoneal formidling er ikke signifikant. Blandt patienter med hæmatogen metastase, levermetastaser er mere almindelig i begyndelsen recurrence.Table 3 Mønstret indledende gentagelse af mavekræft
Tidlig recidiv (n = 248) n (%)
Late gentagelse (n = 154) n (%)
P-værdi
Lokoregional recidiv
161 (64,9)
85 (55.2)
0,052
Hepatoduodenal ledbånd
57 (23,0)
37 (24)
0.810
Perigastric området
25 (10,1)
24 (15,6)
0,101
anastomose
23 (9,3)
15 (9,7)
0,877
Remnant mave
15 (6)
12 (7,8)
0,601
Peripancreatic området
12 (4.8)
9 (5.8)
0.660
Abdominal væg
10 (4)
7 (4.5)
0,804
Lymfeknude
51 (20,6)
27 (17,5)
0,455
Blandet
10 (4)
3 (1,9)
0,251
Distant metastase
207 (83,5)
109 (70,8)
0,003
Peritoneal formidling
106 (42,7)
62 (40.3)
0,624
hæmatogene metastasis
112(45.2)
49(31.8)
0.008
Liver
64(25.8)
23(14.9)
0.010
Lung
25(10.1)
17(11)
0.760
Bone
9(3.6)
4(2.6)
0.570
Adrenal gland
7(2.8)
3(1.9)
0.584
Brain
2(0.8)
0
0.264
Skin
2(0.8)
0
0.264
Mixed
3(1.2)
2(1.3)
0.938
Overlevelse tid efter tilbagefald
Størstedelen af ​​patienterne med gentagelse af mavekræft (321 ud af 402, 79,9%) døde inden for to år efter gentagelse. Den mediane overlevelsestid efter tilbagefald var 8,1 måneder i begyndelsen af ​​tilbagefald og 13,3 måneder i slutningen af ​​tilbagefald, hhv. I alt 16 patienter overlevede mere end fem år efter recidiv: 10 med tidlig recidiv og seks med sene tilbagefald. Blandt de 10 patienter med tidlig recidiv, gentagelse mønster omfattede en levermetastaser, to lunge metastase, tre anastomose gentagelser, to hepatoduodenal ligament gentagelser, en bugvæggen tilbagefald, og en peritoneal såning. Blandt de seks patienter med sent recidiv, gentagelsesindstillingerne mønstre omfattede en abdominal incision gentagelse, to levermetastaser, en rest mave tilbagefald, en hepatoduodenal ligament tilbagefald, og en anastomose tilbagefald med lever invasion. Overlevelsestid efter tilbagefald var signifikant kortere i den tidlige gruppe (P
< 0,001, log-rank test) (figur 1). Figur 1 Sammenligning af overlevelse efter recidiv af Kaplan-Meir.
Diskussion
mavekræft repræsenterer den fjerde hyppigste dødsårsag kræft på verdensplan. Lokoregional tilbagefald kan forekomme efter kurativ resektion, herunder tilstødende lymfeknuder resektion og tværfaglig behandling, eventuelt i form af peritoneal carcinose og /eller fjernmetastaser, hvilket er en af ​​grundene til den høje sats for fornyet. Carcinoma tilbagefald er hovedsagelig dødbringende, og indtil videre er der ingen specifikke behandlinger for at undgå tilbagefald [8-10].
Den kliniske betydning af EMT er blevet rapporteret i forskellige menneskelige kræftformer, og specifikke mekanismer involveret i kræft progression, såsom unddragelse af apoptose, modstandsdygtighed over for kemoterapi, og købet af stamceller celle-lignende egenskaber og deres indflydelse på patientens overlevelse er blevet foreslået [1, 5, 11, 12]. CD44 er et transmembrant glycoprotein, er kendt som en kræft stamcellemarkør i gastrisk cancer [2]. CD44 er positivt og signifikant associeret med tumormetastase, tilbagefald, og dødelighed i gastrisk cancer [13, 14].
I den foreliggende undersøgelse, ekspression af mesenchymale markør vimentin var hyppigere i begyndelsen tilbagefald end i sene tilbagefald cancere (P
< 0,001), og E-cadherin ekspression blev tabt i 112 (45,2%) af 248 tidlige tilbagefald kræft, men kun 35 sent recidiv (22,7%) kræftformer viste tab af E-cadherinekspression (P
< 0,001). Disse resultater viser, at omdannelsen af ​​mavens epitelceller kunne fremme tumor recidiv og metastaser. CD44 og CD54 udtryk blev også fundet oftere i tidlige gentagelse patienter end sent recidiv (P
= 0,001, P
= 0,037), hvilket antyder, at stamcelle markører kan tages som en promotor for tumor fremskridt.
Der har været flere undersøgelser [1, 5] om kompleksiteten af ​​samspillet mellem EMT-relaterede proteiner og deres indvirkning på kræft tilbagefald. Den foreliggende undersøgelse fastslået, at kombinationen af ​​ændringer i proteinet ekspression af vimentin, E-cadherin, og CD44 var den mest effektive prognostisk faktor i gastrisk cancer. Derudover denne kombination var en uafhængig forudsigende faktor for fornyet sammen med et konventionelt clinicopathologic parameter såsom pTNM scenen og histologisk differentiering.
I vores serie, er der en stor forskel i kræft størrelse, brutto udseende, lymfeknudemetastase, lymphovascular invasion, dybde af invasion, og scene mellem de tidlige og sene tilbagefald grupper, og patienter med CD44 og vimentin, og tab af E-cadherin og β-catenin-ekspression, har en højere tendens til tidlig gentagelse. Vores resultater viste, at patienter, der lider en tumorstørrelse på 5 cm eller mere, og en mere avanceret TNM fase, kombineret med EMT ekspression og ekspression af cancer stamcellemarkør CD44, var fremtrædende i begyndelsen tilbagefald i den multivariate analyse.
Som for tilbagefald mønstre, generelt, er der tre vigtigste gentagelse mønstre af mavekræft efter kurativ kirurgi: locoregional gentagelse, peritoneal udbredelse, og hæmatogen metastaser. Vores data viser, at patienter med tidlig recidiv havde mere fjernt metastase, men ikke peritoneal formidling, end dem med sene gentagelse. Hæmatogen metastase var mere almindelig i begyndelsen tilbagefald, som var magen til nogle undersøgelser [9, 10]. Der er ingen signifikant forskel mellem tidlig og sen tilbagefald i forhold til locoregional gentagelse. Vi fandt, at lever, lunge, og knogle er de hyppigst hæmatogen metastatiske organer. Dette resultat stemmer overens med andre [10, 15]. Levermetastaser viser en tendens til at forekomme tidligere, mens lunge og knoglemetastaser opstår senere. Leveren er det første filter af cancerceller via portalen venøse blodstrøm i maven; lunge fungerer som et sekundært filter. Dette resultat tyder på, at patienter bør overvåges nøje for hæmatogen metastasering i de første to år af opfølgning, og for locoregional eller peritoneal tilbagefald senere.
Survival gange efter tilbagefald sjældent er blevet dokumenteret i tidligere studier, selv om en ny undersøgelse foretaget af Wu et al
. [16] rapporterede, at de fleste patienter bukkede under inden for et år efter modtagelsen af ​​en diagnose for fornyet, med median overlevelsestid efter tilbagefald er kun 6,7 måneder. I vores resultater, median overlevelsestid for tidlig recidiv gruppen var signifikant lavere (8,06 versus 14,97 måneder, P
< 0,001). Trods dårlig overlevelse efter recidiv af cancer og en ugunstig reaktion på kemoterapi hos nogle patienter, 16 patienter havde overlevelse på mere end fem år efter tilbagefald på lang sigt. Vi foreslår, at tæt opfølgning med B-ultralyd og endoskopier er vigtige, især i de første to år, for at forlænge overlevelsen.
Konklusioner
hæmatogen metastaser viste sig at være almindelig hos patienter, der oplevede tilbagefald inden for to års helbredende resektion, og patienter med stor tumorstørrelse (≥5 cm) og avancerede TNM (stadium III) sig at være mere tilbøjelige til tidlig gentagelse. EMT og stamceller-lignende fænotyper er korreleret med aggressive kliniske funktioner i mavekræft, og de tre proteiner, E-cadherin, vimentin og CD44, kan være den bedste kombination til at forudsige patientens tilbagefald.
Notes
GUI- fang Xu, Wei-jie Zhang bidraget ligeligt til dette arbejde
Forkortelser
EMT:.
Epithelial-mesenkymale overgang
ZEB-1:
Zink finger E-box-bindende protein 1
CD44:
Klynge af differentiering 44
CD54:
Klynge af differentiering 54
AJCC:
amerikanske Blandede Udvalg om kræft
CT:
computertomografi

PET:
positronemissionstomografi
SPSS:
statistiske produkt- og serviceløsninger
TNM:
'tumor, node, metastaser'
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud nummer: 81.201.909)., og Nanjing Medical Science og Technology Development program (tilskud numre: QYK11166, YKK12072).
Forfattere 'oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12957_2014_1838_MOESM1_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 1 Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Forfattere bidrag
GFX og WJZ deltog i undersøgelsen design, kliniske data og prøvetagning, og dataanalyse. QS og XYX som patologer re-klassificeret alle adenocarcinom prøver. GFX og WJZ skrev udkastet papir. XPZ og WXG bidraget lige: både udtænkt og gennemførte undersøgelsen, og revideret hele manuskriptet. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Oxytocin /vasopressin receptor antagonist atosiban forsinker mavetømning af et halvfast måltid sammenlignet med saltvand i human
• Forudsigelse af tumor tilbagefald efter kurativ resektion i gastrisk karcinom baseret på bcl-2 expression