Epstein-Barr virus infetta adenocarcinoma gastrico esprime trascritti virali latenti e litici ed ha una distinta espressione del gene umano profile

di Epstein-Barr virus infetta adenocarcinoma gastrico esprime trascritti virali latenti e litici e ha un distinto profilo di espressione genica umana
Abstract
Background
EBV DNA si trova all'interno delle cellule maligne del 10% dei tumori gastrici. La tecnologia molecolare moderna facilita l'identificazione degli effetti biochimici legati ai virus che potrebbe aiutare nella diagnosi precoce e la gestione della malattia.
Metodi
In questo studio, espressione di RNA profiling è stata eseguita su 326 tessuti inclusi in paraffina macrodissected tra cui 204 tipi di cancro e, quando disponibile, adiacente mucosa non maligne. sonde Nanostring NCounter mirate 96 RNA (20 virali, 73 umana, e 3 spillo RNA).
Risultati
in 182 tessuti con adeguate RNA governante, profili distinti sono stati trovati in infetto contro
tumori non infetti, e maligna contro
adiacente mucosa benigna. tumori gastrici EBV-infettate espressi quasi tutto il 18 latente e litica EBV RNA nel pannello di prova. Livelli di EBER1 Comprare e EBER2
RNA erano più alte e erano proporzionali alla quantità di genomi EBV come misurato da Q-PCR. Tra codificanti proteine ​​EBV RNA, EBNA1
dal promotore Q e BRLF1
erano altamente espresso mentre EBNA2
livelli erano bassi positivi in ​​soli 6/14 tumori infetti. upregulation concomitante di fattori cellulari implica che il virus non è un innocente spettatore, ma piuttosto è legato alla segnalazione NFKB (FCER2, TRAF1
) e la risposta immunitaria (TNFSF9, CXCL11, IFITM1, FCRL3, MS4A1 e PLUNC)
, con PPARG
espressione che implica alterato metabolismo cellulare. Rispetto alla mucosa non maligno adiacente, tumori gastrici costantemente espresso INHBA, SPP1, Thy1, SERPINH1, CXCL1, FSCN1, PTGS2 (COX2), BBC3, ICAM1, TNFSF9, SULF1, SLC2A1, TYMS
, tre collagene, la proliferazione cellulare marcatori
MYC e PCNA
, e EBV BLLF1
mentre mancavano CDH1 (e-caderina), CLDN18
, PTEN, SDC1
(CD138), GAST
(gastrina) e il suo effettori a valle CHGA
(cromogranina). Rispetto al carcinoma linfoepitelioma simile della cervice uterina, tumori gastrici espressi CLDN18, EpCAM, REG4, BBC3, OLFM4, PPARG
, e CDH17
mentre avevano diminuito i livelli di IFITM1
e HIF1A
. Il target druggable ERBB2 (Her2), MET, e la via HIF, così come molti altri indicatori potenziali di farmacogenetica (compresa l'infezione da EBV stessa, così come SPARC, TYMS, FCGR2B
e REG4
) sono stati identificati in qualche campioni tumorali.
Conclusione
Questo studio dimostra come la tecnologia molecolare applicata alla archivio tessuti fissati rendimenti moderno romanzo intuizioni oncogenesi virale che potrebbero essere utili nella gestione dei pazienti affetti.
Parole
adenocarcinoma gastrico virus di Epstein-Barr espressione di RNA delle cellule stromali profilo prova farmacogenetica Sfondo
cancro gastrico è la seconda causa di mortalità per cancro globale con quasi un milione di nuovi casi all'anno [1, 2]. Circa il dieci per cento degli adenocarcinomi gastrici sono virus di Epstein-Barr (EBV) infettato, e EBV è considerato una classe 1 patogeno oncogeno dall'Organizzazione Mondiale della Sanità [3-6]. L'incidenza è in aumento per quei tumori nel segmento prossimale dello stomaco (cardias, corpo) in cui EBV è coinvolta più frequentemente [7-14].
Dati recenti dal programma di sorveglianza del cancro del National Cancer Institute mostra un aumento preoccupante di cancro gastrico incidenza tra i giovani adulti negli Stati Uniti [7, 8, 15]. Emerging terapia mirata rende ancora più importante identificare tumori infetti e di caratterizzare i difetti biochimici come l'iperespressione ERBB2 che aumenta probabilità di risposta al trastuzumab in pazienti con cancro gastrico metastatico [16-18]. EBV-infettate rispetto al cancro gastrico non infetti ha una prognosi favorevole [19], e gli studi clinici stanno cominciando a scoprire una terapia mirata virus come 1) le cellule infuse specifiche per EBV T citotossici o cellule NK [20-23], 2) inversione il methylator fenotipo EBV-correlata [24], 3) innescando la replicazione virale litica che potrebbe quindi incitare risposte innate e adattative del corpo immunitarie di uccidere le cellule tumorali infettate [25-33], e 4) la terapia di induzione litico co-somministrato con nucleoside antivirale analogici quali gancyclovir che è fosforilata e quindi attivato da chinasi virali che promuovono citotossicità [34-41].
Gli studi clinici hanno esaminato l'efficacia della terapia mirata trarrebbe beneficio da test di laboratorio che consentono di identificare i candidati che possono rispondere, e potrebbero beneficiare di laboratorio saggi che indicano l'effetto degli interventi sulle vie biochimiche destinate. La tecnologia molecolare moderna consente ora di analisi cliniche-grade di più analiti pertinenti attraverso l'espressione di RNA profiling [42]. I produttori di dispositivi hanno prodotto probe array sensibili, specifici e personalizzabili per misurare simultaneamente più RNA, compreso RNA non codificanti, come RNA EBV-encoded 1 o 2 che sono abbondantemente espresso nei tumori infetti. I recenti progressi nelle strategie di garanzia della qualità hanno maturato al punto che i profili di espressione di RNA sono in corso di attuazione in laboratorio clinico [42].
Per essere pratico in ambito clinico, un test deve essere applicabile a raccolte di routine campioni quali l'archiviazione, la paraffina tessuto -Embedded [42]. In questo studio, abbiamo misurato l'espressione genica virale e umana nei tumori gastrici d'archivio e nella mucosa e di controllo adiacente a sviluppare un sistema di prova che potrebbero essere utilizzati per caratterizzare in modo affidabile le firme predittivi di risposta alla terapia mirata. Un sistema di test serie 96-RNA che abbiamo dub pannello Gastrogenus v1 ™ è stato personalizzato per misurare pertinenti RNA virali latenti e litici fianco mRNA umani clinicamente rilevanti che sono stati precedentemente segnalati per essere 1) cancro gastrico specifico, 2) indicativi di infiammazione, e /o 3) predittivo di risposta a farmaci specifici. Questi test, così come RNA controllo spillo endogena, sono stati misurati in sezioni in paraffina macrodissected utilizzando il sistema di prova Nanostring nCounter [43-45]. istologiche Correlativo e studi molecolari sono stati fatti per dimostrare che il sistema di test eseguito come previsto. I nostri risultati mostrano che i tumori EBV-correlate esprimere trascrizioni più latenti e litici che sono stati precedentemente riconosciuti, e che i tumori infetti hanno caratteristiche biologiche uniche rispetto ai tumori non infetti. Due principali sottotipi di cancro sono stati trovati, il che implica che le strategie di diagnosi precoce del cancro gastrico o test di monitoraggio potrebbero essere adattati per rilevare le firme pertinenti che caratterizzano i principali sottotipi molecolari. Infine, i dati pilota rivela espressione di geni virali e correlate al cancro selezionati adiacente mucosa non maligne, suggerendo un effetto di campo che potrebbe essere importante per lo sviluppo del cancro o di manutenzione.
Risultati
profili di espressione genica è stata eseguita su un totale di 326 tessuti, tra cui 187 tumori gastrici, 17 cancri cervicali linfoepitelioma-simili, e 118 abbinati mucosa non maligno della stessa procedura chirurgica (quando disponibile). Dopo la normalizzazione dei dati, una mappa di calore dei 182 tessuti che hanno la migliore qualità di RNA, come giudicato da più alto livello medio di quattro RNA di pulizia, ha rivelato i modelli di espressione genica che differivano in gastrica rispetto
tessuti di controllo cervicali. Inoltre, sia nel gastriche e cervicali cluster, tessuti maligni e benigni tendevano a raggrupparsi, sostenendo la capacità del sistema di test per misurare nCounter clinicamente importanti funzioni biologiche. (Vedi Figura 1). Figura 1 profili di espressione di 182 tessuti per 20 geni virali e 73 geni umani. Una mappa di calore mostra senza supervisione clustering gerarchico di ogni tessuto in una colonna separata, e ciascuno di RNA in una riga separata. I dati sono mediana centrato con il rosso che indica relativa sovraespressione e verde che indica relativa sotto-espressione per ogni gene. dati correlativi sopra la mappa indica la classificazione istopatologica con l'ulteriore subclassificazione della coorte cancro gastrico in 14 EBV infetta e 104 EBV tumori negativi sulla base di livelli di EBV DNA. Sotto la mappa, ogni cancro gastrico è classificato dalla proporzione di cellule maligne, e viene mostrata l'origine geografica di ogni tessuto.
Un gruppo di carcinomi gastrici sovraespresso praticamente tutti gli RNA EBV. Per determinare quali tipi di cancro gastrico dovrebbe essere designato come EBV-infetti, i 71 tessuti con i più alti livelli combinati di EBER1
e EBER2
RNA da serie Nanostring nCounter sono stati ulteriormente esaminati per i livelli di EBV genoma all'interno dello stesso tessuto da Q- PCR. C'è stata una relazione lineare tra la quantità di EBER1
e EBER2
RNA e la quantità di genoma EBV. (Vedi Figura 2). Il nostro cutoff precedentemente stabilito [46] per il livello di genoma EBV corrispondente alla localizzazione del virus di cellule maligne dato vita a 14 tumori di essere immessi nella categoria EBV-infettate. I tumori gastrici rimanenti sono stati chiamati EBV-negativi, e tra questi i più alti livelli di RNA registrati sono stati 174.016 per EBER1
e 27.972 per EBER2
. Al contrario, tra i tumori gastrici EBV-infettate il più basso livello di EBER1
era 263.589 e il più basso livello di EBER2
era 140.081. tagli proposti per identificare un tessuto come EBV-infettate sono mostrati nella Figura 2. Figura 2 livelli di RNA EBV-codificati sono ricchi di cancro gastrico infetto e sono proporzione al livello di EBV genoma. A. Box appezzamenti di EBER1
e EBER2
nei tessuti benigni e maligni rivelare che il cancro gastrico EBV-infettate ha livelli sostanzialmente più elevati di EBER1
e EBER2
RNA non codificanti di quanto non facciano i tumori e di controllo non infetti tessuti. soglie proposte per EBER1
o EBER2
visualizzati oltre il quale un cancro gastrico potrebbero affidabile essere designati come EBV-infettate. Ogni punto rappresenta un risultato analitico individuale su una scala log2 unità normalizzato (NU). confronto B. due a due la EBER1
e EBER2
livelli di RNA di serie Nanostring nCounter e carica virale EBV DNA di Q-PCR rivela un'associazione lineare tra i livelli di ognuno di questi analiti. sono mostrati; Pearson coefficienti di correlazione (0.86 P >). Il livello precedentemente convalidato di EBV DNA carica virale è mostrato oltre la quale EBER
era sempre localizzato a cellule maligne di EBER in situ
ibridazione (soglia di 10,558 genomi EBV per 100.000 cellule, che equivale a 13,37 su questa scala log2 ) [46]. tagli proposti per i livelli di RNA sono indicati sia per EBER1
(200.000 NU, o 17.61 su questa scala logaritmica 2) e EBER2
(100.000 NU, o 16.61 su questa scala log2). L'unico valore erratico è una mucosa gastrica non maligno, che si trovava adiacente a un cancro gastrico EBV-infettate, e questo mucosa ha avuto un carico equivalente EBV DNA a quello dei tumori infetti, ma sarebbe stato correttamente escluso dal cancro EBV-infettate gruppo se uno EBER1
o EBER2
livelli di RNA sono stati utilizzati, o se sono stati utilizzati l'istologia, per lo screening per il tumore maligno EBV-correlati.
geni sovraespressi in EBV-infettate contro il cancro gastrico EBV-negativi
Venti otto geni erano significativamente differenzialmente espressi nei tumori EBV-infettate rispetto ai tumori gastrici negativi EBV (p < 0,05). È interessante notare che tutti i 28 stati upregulated piuttosto che smorzati nei tumori infetti, e questa tendenza è spiegato almeno in parte da una scelta di marcatori positivi piuttosto che negativi di infezione nella scelta degli RNA da profilati per questo studio. La mancata individuare eventuali geni diminuito l'era ancora dato rapporti sorprendenti che EBV è associato con una CpG isola methylator fenotipo e inoltre il virus può destabilizzare mRNA cellulari a livello mondiale [47]. Con gli geni significativamente upregulated in tumori infetti erano tutti 18 della RNA EBV testate, nonché citomegalovirus pp65 (UL83). Il risultato citomegalovirus pp65 (UL83) è probabile che sia falsi positivi (sospettato di essere sonda croce ibridazione), come dimostra l'assenza di un altro RNA litico, citomegalovirus pol (UL54), nei tumori EBV-infettate. Inoltre, UL83 ma non UL54 è stata espressa in EBV infetto ma non nei controlli linea cellulare EBV-negative (dati non mostrati). Un'altra spiegazione possibile per falsa espressione positiva di RNA virale è sonda crossreattività con il DNA virale. Nove RNA umani sono stati significativamente upregulated in EBV-infettate rispetto a tumori gastrici EBV negativi: FCER2, MS4A1 (CD20), PLUNC, TNFSF9, TRAF1, CXCL11, IFITM1, PPARG
, e FCRL3
. (Vedi Figura 3). Figura 3 RNA umani multipli sono sovra-espressi in cancro gastrico EBV-infettate rispetto al cancro EBV-negativi. trame Box dimostrano i livelli di RNA umani in infetto rispetto a tumori gastrici non infetti e controlli che includono il cancro linfoepitelioma come cervicale, la mucosa del collo dell'utero, e mucosa gastrointestinale benigna. Ogni punto rappresenta un risultato analitica individuale su una scala in unità normalizzata log2.
Geni differenzialmente espressi nel carcinoma gastrico rispetto alla mucosa gastrointestinale non maligno
Venti sei geni erano significativamente deregolazione nel cancro gastrico rispetto alla mucosa gastrica non maligne ( p < 0,05). Gli RNA umani upregulated nel carcinoma gastrico erano INHBA, SPP1, Thy1, SERPINH1, CXCL1, FSCN1, COL1A1, SPARC, COL1A2, PTGS2 (COX2), BBC3, ICAM1, TNFSF9, MYC, SULF1, SLC2A1, COL3A1, PCNA, e TYMS
, mentre gli RNA ha diminuito l'erano CDH1 (e-caderina), CLDN18
, CHGA
(cromogranina), PTEN, SDC1
(CD138) e GAST
(gastrina). L'unico fattore virale che è stato espresso in modo differenziale era BLLF1
che era significativamente più alta nel tumore rispetto al mucosa gastrica non maligne (p = 0,004). BLLF1
codifica per la fine del virale proteina dell'involucro gp350 /220, suggerendo che virioni sono significativamente più prevalenti nel cancro rispetto al tessuto gastrico non maligne. BLLF1
non era specifico per il cancro gastrico, tuttavia, come è stato espresso anche in alcuni tessuti cervicali benigne e maligne, pure.
Geni associati a cancro gastrico rispetto al cancro del collo dell'utero linfoepitelioma simile
Nove geni erano significativamente disregolazione nel carcinoma gastrico rispetto al cancro del collo dell'utero linfoepitelioma-simile (p < 0,05). I sette RNA upregulated nel carcinoma gastrico erano CLDN18, EpCAM, REG4, BBC3, OLFM4, PPARG
, e CDH17
, mentre i due geni erano diminuito l'IFITM1
e HIF1A
.
Modelli di l'espressione genica virale latente e litica in EBV infetta tumori gastrici
le 14 tumori gastrici EBV-infettate in questo studio in modo coerente coexpressed praticamente tutti i EBV geni latenti e litici, che è un po 'sorprendente dato che la letteratura prima descrive un modello di latenza in qualche modo limitato [48-51]. E 'possibile che la tecnologia analitica Nanostring nCounter è più sensibile rispetto ai metodi tradizionali di rilevazione.
L'RNA virale più altamente espresso è stato EBER1
ad una media di oltre 1 milione di unità normalizzate per tessuto del cancro EBV-infetti, seguito da EBER2
, BRLF1
e EBNA1
dal del promotore Q. EBNA2
era il meno RNA virale espresso con una espressione media di soli 10 unità normalizzate al tessuto infetto e EBNA2
era completamente assente in 8 dei 14 tumori gastrici infetti. I modelli di espressione genica virale sono rappresentati in Figura 4. Figura 4 geni di EBV latente e litici sono co-espressi in cancro gastrico. Una porzione della mappa calore Figura 1 viene visualizzato in alto contrasto per decifrare relativi livelli di espressione di geni EBV nei 14 tumori gastrici EBV-infettate e campioni circostanti. Tutti i tessuti sono tumori gastrici, tranne una sola mucosa gastrica non maligno, in grigio, sezionato dallo stesso blocco di paraffina come un cancro gastrico EBV-infettate. Medio livello di espressione di ogni RNA nel gastrica coorte di cancro EBV-infettate è mostrato a destra di ogni simbolo gene.
Origine geografica e la proporzione delle cellule tumorali non sono preferenzialmente associati con lo status di EBV di cancro gastrico
Sotto la mappa di calore in Figura 1 è la distribuzione dei casi di cancro gastrico per origine geografica da Honduras (n = 86), il Giappone (n = 5), o gli Stati Uniti (n = 17). Non c'era alcuna associazione significativa tra l'origine geografica e EBV-positivo contro
raggruppamento negativo dei tumori gastrici (Fisher test esatto p = 0,9), suggerendo che l'origine geografica non è il driver principale di clustering gerarchico.
Il fondo della Figura 1 mostra anche la distribuzione di EBV-infettate contro
EBV-negativi tumori gastrici classificati per la proporzione di cellule maligne di ingresso nel profilo di espressione saggio. Non c'era alcuna associazione significativa tra la percentuale di cellule maligne e la EBV-infettate contro
gruppi EBV-negativi di cancro gastrico. Sorprendentemente, i tessuti tumorali a basso contenuto di cellule maligne non preferenzialmente cluster con i tessuti gastrici non maligne. I tumori a basso contenuto di cellule maligne (da 1 a 25% le cellule maligne) sono stati distribuiti tra i vari segmenti della mappa di calore con tumori a media (26-50%) o alto (> 50%) il contenuto delle celle maligne (Fisher test esatto p = 0.5), il che suggerisce che le caratteristiche complessive trascrittoma superano proporzione delle cellule tumorali come il conducente di clustering gerarchico.
Tenendo presente che i linfoepitelioma come cancro cervicale in questo studio sono stati ricchi di stroma linfoide, come lo sono molti tumori gastrici EBV-infettate , è notevole che queste due classi di cancro raggruppati separatamente gli uni dagli altri e ha raggiunto anche ragionevolmente buona separazione dalla mucosa non maligne adiacente. Per la maggior parte dei geni nel pannello, vi è una notevole sovrapposizione dei livelli tra i tipi di malattie. Mentre i profili sono più informativo e più convincente di quanto lo siano i singoli risultati di trascrizione, vi è una certa sovrapposizione nei profili così, a significare che l'analisi i risultati del test deve essere correlata con caratteristiche istologiche al fine di classificare con precisione un tessuto come benigne o maligne.
Farmacogenetica predittori e gli obiettivi druggable
infezione da EBV stesso è considerato un obiettivo perseguibile, almeno per il 14/108 (13%) infettato tumori gastrici che abbiamo identificato. Questo studio dimostra un nuovo modo per identificare i tumori infettate da virus da RNA profiling delle sezioni di paraffina in modo che le informazioni prognostico e predittivo può essere considerato nelle decisioni di gestione del paziente. fattori cellulari di potenziale farmacogenetica includono la via HIF, SPARC, TYMS, FCGR2B, MET,
e ERBB2
(Her2). (Vedere Figure5). Rispetto ai tumori gastrici, cancri cervicali tendono ad avere livelli più elevati di HIF1A
indicando risposta all'ipossia, anche se altrettanto elevati livelli nella mucosa cervicale non maligno sollevano la possibilità di ex vivo
stimolazione di questo fattore di ossigeno-sensing. Ulteriori studi sono necessari per distinguere fattori tecnici da in vivo
up-regulation che giustificherebbero considerazione di inibitori dell'angiogenesi. Figura 5 Alcuni tipi di cancro gastrico hanno significativi disregolazione di fattori che mostrano la promessa come predittori di farmacogenetica. trame Box dimostrano espressione di obiettivi di farmacogenetica selezionati infetti contro i tumori gastrici non-infetti, nonché mucosa gastrica non maligne e cervicali histopathologies. Ogni punto rappresenta un risultato analitica individuale su una scala in unità normalizzata log2.
Abbiamo confermato che SPARC
è upregulated nel carcinoma gastrico rispetto alla mucosa gastrica benigna. Risposta al docetaxel, un farmaco che inibisce taxano assemblaggio del fuso mitotico, viene riferito, influenzato dalla quantità di espressione della proteina SPARC nel cancro gastrico [52]. Gastriche e cervicali tumori entrambi avevano maggiore thymydylate sintasi (TYMS)
che hanno fatto le loro rispettive controparti della mucosa benigni. Alti livelli TYMS
contribuisce riferito alla resistenza acquisita alla terapia di combinazione 5-FU [53].
Alcuni tumori gastrici avevano alti livelli di recettore Fc, FCGR2B
, che potrebbero influire internalizzazione di droga e farmacodinamica di anticorpi terapeutici come cetuximab in vivo
. Quattro tumori gastrici hanno espresso con forza il TEM,
e altri otto casi fortemente sovraespressi espressi ERBB2 (Her2)
, aumentando la possibilità che questo test possa predire la risposta alla terapia con inibitori della tirosin-chinasi.
Discussione
Questo studio ha utilizzato metodi molecolari moderni per esaminare una grande RNA virale umana pannello e nel cancro gastrico. A nostra conoscenza, questo è il più grande gruppo di prodotti genici virali da esaminare di concerto con RNA umani in archivio, tessuti inclusi in paraffina. Il sottotipo EBV-infettate di cancro gastrico è drammaticamente evidente nel corrispondente mappa di calore creato da il clustering non supervisionato, e infezione da EBV è stata confermata da alte cariche virali EBV DNA in questi tessuti. L'espressione di geni virali ed umani selezionati nei tumori confermato più noti a virus e gli effetti correlati al cancro e ha anche rivelato nuove scoperte che fanno luce sulla patogenesi e possibili strategie di gestione della malattia.
Sorprendentemente, i tumori gastrici infetti sovraespresso tutto 18 della geni EBV latente e litici che sono stati testati. Abbiamo scoperto alti livelli di BRLF1
RNA (che codifica l'immediato inizio proteina virale innescando la replicazione litica di concerto con BZLF1) e moderatamente elevati livelli di BXLF1
(la timidina chinasi virale che trasforma penicyclovir ad una forma tossica, suggerendo un meccanismo per la terapia) [54]. BLLF1
(che codifica per la fine virale gp350 proteina dell'involucro /220) è stato espresso a livelli moderati che erano comunque significativamente superiore nella mucosa non maligne, suggerendo che l'infezione da EBV litica non è abortivo, ma piuttosto è in grado di produrre la busta in ritardo virale proteina gp350 /220. Tra i geni latenti, EBNA1
dal promotore Q, EBNA-LP, e EBNA3C
trascrizioni erano più diffusa. EBNA2
stato focally rilevato a livello basso, ma era ancora significativamente più alta nei infetto che in tumori gastrici non infetti. lavoro istochimica Prima non è generalmente rivelato l'espressione a livello proteico dei EBNAs o prodotti genici virali litici, in modo ulteriore lavoro è necessario per sapere se questi RNA codificanti viralmente sono localizzate a maligna delle cellule, i linfociti, o forse anche per esosomi o virioni nel extracellulare ambiente.
Rispetto ai tumori non infetti, i tumori infetti avevano significativa upregulation di nove fattori cellulari (FCER2, MS4A1 (CD20), PLUNC, TNFSF9, TRAF1, CXCL11, IFITM1, PPARG
, e FCRL3
), il che implica che EBV non è un innocente spettatore rispetto a impatto biochimico. I cambiamenti associata al virus che abbiamo trovato erano in percorsi noti oncologi virali, cioè NFKB e segnalazione Notch (FCER2, TRAF1, PPARG
) e la risposta immunitaria della mucosa (PLUNC, TNFSF9, CXCL11, IFITM1, FCRL3
). MS4A1 (CD20) è cellule B specifiche, ricordando che alcuni dei fattori upregulated in EBV-infettate rispetto a tumori gastrici non infetti potrebbe derivare da elementi stromali piuttosto che dalle cellule epiteliali maligne. PLUNC
è stato precedentemente descritto come un marcatore tumorale per carcinomi gastrici e del rinofaringe, e codifica per una proteina secreta coinvolta nella risposta immunitaria innata [55-57]. TNFSF9, una citochina del fattore di necrosi tumorale famiglia, stimola l'attivazione delle cellule T e innesca la produzione IFNG che a sua volta induce la CXCL11 chemochine proinfiammatorie e il fattore antivirale innata IFITM1. PPARG è come un recettore nucleare che controlla le reti del metabolismo del glucosio e dei microtubuli, ed è un bersaglio promettente per i farmaci inibitori [58]. Il FCRL3
gene risposta immunitaria è mutato in malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide, il lupus, e la malattia di Graves.
I nostri risultati supportano il lavoro di Lee et al
che ha trovato diversi modelli di espressione umana in infetto contro
non infetti tumori gastrici [10]. Anche se il loro studio mirato delle proteine ​​e la nostra mirati RNA, i nostri risultati concordati con loro per 4 dei 5 fattori in comune tra i due studi (BCL2, PTEN, CDH1, PTGS2
). C'era un potenziale discrepanza per ERBB2
che è stato significativamente meno frequentemente espresso in infetto rispetto a tumori gastrici non infetti durante il test a livello proteico [10], mentre l'attuale studio non ha mostrato alcuna differenza significativa a livello di RNA trascritto. fattori confondenti includono 1) la proporzione di cellule tumorali presenti nei campioni valutati, 2) i criteri differenti per classificare lo stato di espressione, e 3) RNA contro bersagli proteici.
In generale, la tecnologia di array che è stato utilizzato in questo studio hanno lavorato notevolmente bene nel generare profili di RNA che erano credibile in virtù di distinguere noto benigni contro
maligna e gastrico rispetto
histopathologies cervicali. Inoltre, co-espressione di analiti nello stesso percorso o da parte dello stesso agente infettivo ha senso dal punto di vista patobiologia e virologia. È interessante notare che tutti i tessuti cervicali raggruppati insieme e lesioni cervicali benigne e maligne sono stati in gran parte segregati anche se il pannello di prova Gastrogenus v1 ™ non era stato progettato specificamente per raggiungere questi endpoint. La mancanza di più co-espressi EBV mRNA nei tessuti cervicali rinforzato quello che sapevamo circa la loro EBV-negatività dal EBER gold standard in situ
test di ibridazione.
Tra i sette geni che sono stati significativamente più espressi in cancro gastrico (a prescindere dello stato di infezione) rispetto al cancro del collo dell'utero linfoepitelioma-like, quattro sono stati precedentemente riportati come marcatori tumorali gastriche (CLDN18, REG4, OLFM4, CDH17
) [55, 59-63]. Due altri (glicoproteina EpCAM cellule epiteliali specifici trans-membrana, e PPARG chemochine), così come REG4, sono allo studio per la terapia del cancro mirata [64-66]. L'ultimo dei sette, BBC3 (chiamato anche p53 modulatore di apoptosi up-regolata, o PUMA) è riferito upregulated da EBV LMP2A e regnò in da EBV miR-BART5 in modelli di linee cellulari [67, 68], il che suggerisce che questa famiglia BCL2 membro è strettamente regolata dal virus.
Uno dei due RNA che era significativamente più alto nei cervicale rispetto al cancro gastrico è stato IFITM1
, che si può ricordare è risultato essere sovraespresso in infette rispetto al cancro gastrico non infetti anche. Sono necessari ulteriori lavori per esplorare se i tumori della cervice (papillomavirus-infettati presumibilmente umani) e EBV-infettate tumori gastrici condividono un meccanismo di virus legati comune per la sovraespressione di questo fattore di risposta immunitaria innata. L'altro gene significativamente sovraespresso in cervicale rispetto al cancro gastrico è stato HIF1A
la cui espressione è stata associata con quella di quattro mediatori dell'angiogenesi a valle nel nostro pannello (VEGFA, SLC2A1, SLC2A3
e EPAS1
) come evidenziato dal positivo Pearson coefficienti di correlazione (dati non mostrati). Se confermato di essere operativo in vivo
, la stimolazione percorso HIF implica che gli inibitori dell'angiogenesi sono la pena indagare.
Benigna contro
tessuti gastrici maligni tendono a raggrupparsi separatamente sulla mappa di calore, con alcune eccezioni. ad effetto di campo [69] o il trasferimento exosomal di fattori da regioni adiacenti del contesto locale [70, 71] potrebbe spiegare il motivo per cui alcuni tipi di cancro e dei tessuti adiacenti reattivi hanno profili simili. Mentre macrodissection è stato utilizzato per separare accuratamente lesioni benigne da quelle maligne, non si può escludere un tumore maligno occulta come contributore al clustering aberrante.
Tra i 19 geni significativamente upregulated nel carcinoma gastrico rispetto alla adiacente mucosa gastrica non maligno, la maggior parte erano in precedenza segnalati come marcatori del cancro gastrico specifici [72-76], e ora confermare che la loro upregulation è rilevabile nel tessuto incluso in paraffina archiviazione. Bassi livelli di GAST
(gastrina) RNA nei tessuti tumorali potrebbe aiutare a spiegare la perdita concomitante del fattore di segnalazione gastrina CHGA
(cromogranina). Il fattore più consistente downregulated nel carcinoma gastrico rispetto
adiacente mucosa benigna è stato il CDH1 gene soppressore del tumore (E-caderina)
suggerendo o 1) CDH1
ipermetilazione del promotore [77], 2) rara mutazione germinale di CDH1
associati con predisposizione ereditaria al cancro gastrico [78], o 3) sottoregolazione di CDH1
da EBV LMP1 come descritto in modelli di linee cellulari [79].
LMP1 è stato precedentemente segnalato per essere assente nel cancro gastrico infetto tranne in rari casi [50, 51, 80, 81]. E 'stato quindi sorprendente che Nanostring nCounter gamma di profili ha mostrato coerente seppur espressione basso livello di LMP1
RNA insieme a quasi tutti gli altri RNA EBV che sono stati testati nei tumori gastrici infetti. Coordinato co-espressione di più geni virali sostiene che l'espressione è vera positivo. I nostri risultati microarray sollevano la possibilità che gli RNA virali da noi rilevati non sono codificanti proteine ​​o che le proteine ​​sono: 1) solo transitoriamente espressi, 2) rapidamente degradato, 3) localizzati a cellule rare che sono prontamente riconosciute e distrutte dal sistema immunitario, o 4) presenti a tale livello basso che le analisi tradizionali sono troppo insensibili al loro rilevamento [82]. Il produttore del sistema di test nCounter sostiene analitica sensibilità equivalente a quella di rtPCR [43].
Mentre la maggior parte dei geni virali sono stati espressi quasi esclusivamente nel infetto coorte di cancro gastrico, EBER1
e EBER2
erano comunemente espressi in ciascuno delle coorti gastriche e cervicali benigni e maligni, anche se a livelli molto più bassi di quanto si è visto in ciascuno dei tumori gastrici EBV-infetti. Infatti, il nostro studio ha rivelato un nuovo modo per identificare il cancro gastrico EBV-infettate misurando EBER1
e /o EBER2
RNA nei tessuti d'archivio, e abbiamo proposto soglie che contraddistinguono successo infettati da cancro gastrico non infetto.
Il supporto per l'infezione virale attiva in pazienti affetti da cancro gastrico infetti proviene dalla prova sierologica di titoli più alto rispetto l'antigene del capside virale rispetto ai pazienti affetti da cancro gastrico EBV-negativi e controlli benigni [83]. infezione litica di basso livello è stato precedentemente descritto nelle cellule linfoidi mucose [31, 82, 84] e nelle linee infetti gastriche epiteliali delle cellule [85]. BARF1 è noto per essere espresso nel cancro gastrico in cui si propone di agire come un latente piuttosto che un fattore litico [50, 51]. Utilizzando la tecnologia sensibile rtPCR, più trascrizioni EBV litici sono stati rilevati da Luo et al nei tessuti di cancro gastrico [50].

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• lignaggi genetici di indifferenziato di tipo carcinomi gastrici analizzati da raggruppamento senza sorveglianza del DNA genomico dati di microarray