Identifizierung von Serum Proteom Signaturen von lokal fortgeschrittenem und metastasiertem Magenkrebs: eine Pilotstudie

Identifizierung von Serum Proteom Signaturen von lokal fortgeschrittenem und metastasiertem Magenkrebs: eine Pilotstudie
Zusammenfassung
Hintergrund
Der Magenkrebs ist eine der häufigsten und sterblichen Krebs weltweit. Die anfängliche asymptomatischen Entwicklung und weiteren unspezifischen Symptomen führen bei der Diagnose im fortgeschrittenen Stadium mit einer schlechten Prognose. Doch keine klinisch nützliche Biomarker für diese Bösartigkeit zur Verfügung, und invasive gastrointestinalen Endoskopie bleibt die einzige zuverlässige Option im Moment. Daher besteht ein Bedarf für die Entdeckung von klinisch brauchbaren nichtinvasive diagnostische und /oder prognostisches Werkzeug als Alternative (oder Komplement) für aktuelle diagnostische Werkzeuge. Hier wollten wir für Serumproteine ​​charakteristisch für die lokale und invasive Magenkrebs
Methoden
Vorbehandlung wurden Blutproben von Patienten gesammelt mit der Diagnose Adenokarzinom des Magens an der anderen Stadium der Krankheit zu suchen. 35 Patienten mit lokal fortgeschrittenem Krebs und 18 Patienten mit metastasierendem Krebs; 50 gesunden Spendern wurden auch als Kontrollgruppe enthalten. Die niedermolekularen Gewichtsfraktion des Serums Proteom wurde durch die Massenspektrometrie MALDI-ToF Profil (dh endogene Peptidoms), und die ganze Proteom Komponenten wurden durch die LC-MS /MS shotgun-Ansatz identifiziert und quantifiziert.
Ergebnisse
Mehrkomponenten Peptidoms Unterschriften wurden gezeigt, dass eine gute Unterscheidung zwischen gesunden Kontrollen und Krebspatienten sowie zwischen Patienten mit lokal fortgeschrittenem und metastasiertem Krebs erlaubt. Außerdem ergab ein LC-MS /MS-Ansatz 49 Serumproteine ​​mit unterschiedlichen Häufigkeiten zwischen gesunden Spendern und Krebspatienten (überwiegend assoziierte Proteine ​​mit einer Entzündung und Akut-Phase-Reaktion). Des Weiteren 19 Serumproteine ​​mit unterschiedlichen Häufigkeiten zwischen Patienten mit lokal fortgeschrittenem und metastasiertem Krebs identifiziert wurden (einschließlich Proteinen assoziiert mit Zytokin /Chemokin-Reaktion und den Stoffwechsel von Nukleinsäuren). weder Peptidoms Profilierung noch Shotgun Proteomics jedoch Annäherungserfassungsaddierwert erlaubt Serumkomponenten zwischen zwei Untergruppen von Patienten mit lokalen Krankheit Diskriminierung, die entweder entwickelt oder nicht entwickeln Metastasen während des Follow-up.
Schlussfolgerungen
die molekularen Unterschiede zwischen lokal fortgeschrittenen und metastasierten Magenkrebs, sowie mehr offensichtlichen Unterschiede zwischen gesunden Individuen und Krebspatienten, haben Reflexion auf der Ebene des Serums Proteom markiert. Allerdings haben wir keinen Beweis, dass Merkmale der Vorbehandlung Serum Proteom ein Krebsrisiko Verbreitung bei Patienten, aufgrund der örtlichen Krankheit vorhersagen könnte. Dennoch präsentierten Daten potentielle Anwendbarkeit eines Serum Proteom signaturbasierte Biomarker in der Diagnostik von Magenkrebs bestätigt.
Schlüsselwörter Magenkrebs Frühe Diagnose Neubildungen Proteomics Biologische Marker hintergrund und Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache für Krebs-Todesfälle weltweit. Dieser Krebs besonders befällt Populationen von Ostasien, Osteuropa und Teilen Mittel- und Südamerika und die Morbiditätsrate ist doppelt so hoch bei Männern als bei Frauen [1]. Die Bösartigkeit ist mit unspezifischen Symptomen oder sogar asymptomatisch Entwicklung in einem frühen Stadium, die im fortgeschrittenen Stadium der Diagnose führt oft. Stadium von Magenkrebs korreliert stark mit einer schlechten Prognose. Laut dem Bericht National Cancer Data Base, 5-Jahres-Überlebensrate für Stufe IA betrug 78% und es fiel im Wesentlichen auf jeder Stufe bis etwa 7% für die mit Stadium IIIB oder Stadium IV Krankheit diagnostizierten Patienten [2]. So könnte eine frühzeitige Diagnose von Magenkrebs radikal Wirksamkeit der Behandlung erhöhen und die Prognose für diese tödliche Krankheit zu verbessern. Derzeit ist die effizienteste Diagnose-Tool zur Erkennung von Magenkrebs bleibt eine Magen-Darm-Endoskopie, doch ist diese invasive Technik ist nicht geeignet für eine groß angelegte Screening. Leider gibt es keine alternative nicht-invasive Biomarkern zur Verfügung, weil die häufig gastrointestinale Tumormarker wie CEA, CA 19-9 oder CA 72-4 verwendet zur Früherkennung dieser Krebsart aufgrund ihrer geringen Empfindlichkeit und Spezifität unzureichend sind (20-30 %) [3-5]. Die Mehrheit der Magenkrebsfälle (über 90%) als Adenokarzinome eingestuft. In jüngerer Zeit vier molekularen Subtypen von Adenokarzinom des Magens wurden auf Genomprofil geliefert dank des Cancer Genome Atlas Projekt zeichnet anhand [6]. Jedoch bleibt das Wissen über molekulare Heterogenität und Biologie dieser Krebs, einschließlich der Entwicklung und Mechanismen der Progression, noch eher begrenzt. Daher bezieht sich ein dringender Bedarf zur Identifizierung von klinisch relevanten Biomarker nicht nur die Früherkennung, sondern auch die Prognose und Vorhersage des Behandlungsergebnisses.
Clinical Proteomics ist ein wichtiger Ansatz zur Entdeckung von Biomarkern von Magenkrebs [7]. Es ist allgemein anerkannt, dass Blut Proteom eine vielversprechende Quelle neuer Biomarker dieser Krebsart ist, einschließlich besonders wertvollen Marker für die Früherkennung der Erkrankung und Überwachung der Reaktion auf die Behandlung [8]. Massenspektrometrie-basierte Profilierung der niedermolekularen Gewichtsfraktion des Serums Proteom, so endogene Peptidoms genannt, offenbarte Multipeptid Signaturen mit potentiellen Anwendbarkeit in Klassifikation und Diagnose von verschiedenen Krebsarten [9-13]. Einige Werke wurden veröffentlicht, die MALDI /SELDI-basierte Profilierung von Serum /Plasma petidome zur Diagnose von Magenkrebs untersucht, die Peptid-Signaturen vorgeschlagen, die gesunden Spendern und Patienten mit Magenkrebs zugelassen Diskriminierung oder mit einem Verlauf einer Krankheit [assoziierten Signaturen ,,,0],14-22]. Mehrere Komponenten solcher Unterschriften wurden weiter als Fragmente KNG1 identifiziert [18], APOC1 und APOA2 [19], SAA [20], TBB5 und TYB4 [22] oder FIBA ​​[23, 24]. In jüngerer Zeit wurde zwischen Magenkrebspatienten und Patienten mit gutartigem Magenerkrankungen [25] zu unterscheiden vorselektierten ein Panel von Biomarkern von Serumproteinen zusammengesetzt basierend auf vorklinischen Maus-Modell (Afamin, Clusterin, VDBP und Haptoglobin) validiert. Dennoch keines der vorgeschlagenen Serum Proteom Signaturen von Magenkrebs wurde allgemein akzeptiert und noch in der klinischen Praxis angewendet.
Hier wollten wir Proteom Merkmale der Vorbehandlung Serum mit dem Risiko der Metastasierung von Magenkrebs assoziiert zu charakterisieren. Zwei Arten von Proteom-Analysen wurden durchgeführt: (1) der niedermolekularen Gewichtsfraktion des Serums Proteom wurde Profil durch die MALDI-TOF-Massenspektrometrie, (2) die gesamte Proteom Komponenten wurden identifiziert und quantifiziert durch LC-MS /MS nach der Verdauung mit Trypsin (eine "Shotgun Proteomics" -Ansatz). Gruppen von zuvor unbehandelten Patienten mit lokal fortgeschrittenem Magenkrebs und Metastasen wurden in die Studie eingeschlossen (eine angepasste Gruppe von gesunden Personen wurde als Referenz analysiert); solche umfassenden Proteomanalyse wurde in einer Gruppe von Kaukasiern Patienten mit Magenkrebs zum ersten Mal durchgeführt. Serum Proteom Signatur, die zwischen Patienten mit lokal fortgeschrittenem Krebs und metastatischem Krebs differenziert wurde in dieser Pilotstudie nachgewiesen, noch verfügt spezifisch für Patienten mit lokal fortgeschrittener Erkrankung zum Zeitpunkt der Diagnose, die schließlich entwickelt Metastasen wurden auf dieser Ebene nicht beobachtet.
Methoden
Eigenschaften von Patientengruppen
Fifty-drei Patienten mit zuvor unbehandeltem Biopsie nachgewiesene Adenokarzinom des Magens wurden in dieser Studie qualifiziert: 35 Patienten mit lokal fortgeschrittenem Krebs, darunter 16 Patienten mit Metastasen während der Therapie entwickelt oder Follow-up und 19 Patienten mit keine Metastasen während des Follow-up festgestellt, und 18 Patienten mit metastasierendem Krebs. Die letztere Gruppe bestand aus vier Patienten mit Fernmetastasierung auf einzelne Organ und 14 Patienten mit Ausbreitung auf mehrere Organe; beteiligten Organe enthalten Peritoneum (13 Fälle), Leber (acht Fälle), Lunge (drei Fälle), andere Stellen (acht Fälle). Im Allgemeinen Einschlusskriterien beteiligt: ​​Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) Performance-Status von 0-2, Alter 20-85 Jahre, Serumcreatininspiegel < 1,5 mg /dl, Serum-Bilirubin Ebene < 2,0 mg /dl, eine Granulozyten > 1500 Zellen /ul und eine Blutplättchenzahl > 100.000 Zellen /ul, während Ausschlusskriterien beteiligt: ​​vorherige Bösartigkeit, frühere Operation, Bestrahlung oder Chemotherapie. Die Vorbehandlung Inszenierung bei der körperlichen Untersuchung basiert, esophagogastroscopy mit Biopsien, CT des Bauches und der Brust Prüfung durch Röntgen oder CT. Fünfzig geschlechts- und altersangepassten krankheitsfreien Spendern wurden als Kontrollgruppe enthalten. Alle Studienteilnehmer waren Kaukasiern (~ 65% Männer) mit dem Alter, in den Bereich von 34 bis 74 Jahren. Tabelle 1 zeigt detaillierte Informationen über analysierten Gruppen. Die Studie wurde von der zuständigen Ethikkommission genehmigt, und alle Personen, die an dieser Studie zur Verfügung gestellt informierte Zustimmung unter Angabe ihrer bewussten und freiwilligen participation.Table 1 Merkmale der Gebergruppen eingeschrieben in die Studie
Gruppe /Parameter
Gesunde Kontrolle
Krebspatienten (alle Fälle)
Patienten mit lokal fortgeschrittenem Krebs
Patienten mit metastasierendem Krebs
Kein Ausbreitung

verbreiten
Nummer (n)
50
53
19
16
18
Geschlecht (M /F)
30/20
37/16
07.12
13/3
06.12
Alter (Jahre)
28-60 (Median 50)
34-74 (Median 59)
36-70 (Median 59)
34-73 (Median 58)
35-74 (Median 60)
Tumor Lage
oberen Drittel
- 15 (28%)
3 (16%)
6 (37%)
6 (33%)
Mitte Drittel
- 31 (59%) 13 (68%)

9 (57%)
9 (50%)
unteren Drittel
- 7 (13%)
3 (16%)
1 (6%)
3 (17%)
Grading
G1-G2
- 16 (30%)
10 (53%)
3 (19%)
3 ( 17%)
G3
- 29 (55%)
8 (42%)
11 (69%)
10 (56%)
Nicht angegeben
-
8 (15%)
1 (5%)
2 (12%)
5 (27%)
Primärtumor
cT1-T3
-
50 (94%)
19 (100%) 16 (100%) auf
15 (83%)
cT4
- 3 (6%)
0 (0%)
0 (0%)
3 (17%)
Lymph Node
cN0
- 20 (38%)
13 (68%)
5 (31%)
2 (11%)
CN1-N3
- 33 (62%)
6 (32%)
11 (69%)
16 (89%)
Metastasierung (initial)
cM0
- 35 (66%)
19 (100%)
16 (100%)
0 (0%)
cM1
- 18 (34%)
0 (0%)
0 (0%)
18 (100%)
Gruppe Patienten mit lokal fortgeschrittenem Krebs zum Zeitpunkt der Diagnose waren weiter unterteilt in Untergruppe, wo entweder keine Ausbreitung (Kontrolle) oder Verbreitung in Folge Krebs /Ausbreitung (Metastasierung) nachgewiesen wurde
Herstellung von Serumproben
Blut Vorbehandlung gesammelt wurde in a 5 ml Vacutainer Rohr (Becton-Dickinson) für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, so dass die Gerinnung und dann 10 min bei 1000 g zentrifugiert
das Gerinnsel zu entfernen. Das Serum wurde bei -70 ° C bis zur Verwendung in Aliquots aufgeteilt und gespeichert
Profilieren des niedermolekularen Fraktion von Serum
Proteom Vor der Analyse Proben wurden 1:. 5 mit einem Puffer von 20% Acetonitril (ACN) enthält, und 25 mM Ammoniumbicarbonat, und dann durch Zentrifugation durch Amicon ultra-Einheiten (50 kDa cut-off) zum Entfernen der reichlich vorhandenen hochmolekularen Proteine ​​filtriert, insbesondere Albumin. Unmittelbar vor der Analyse Proben wurden durch Laden auf ZipTip C18 Micro-Säulen (Millipore) entsalzt, eingeengt und dann mit 1 &mgr; l der Matrixlösung (gesättigte Lösung von alpha-Cyano-4-hydroxy-Zimtsäure in 30% ACN /H 2O und 0,1% TFA) direkt auf die 800 &mgr; m AnchorChip ™ (Bruker Daltonics) Platte. Die Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung eines UltrafleXtreme MALDI-ToF-Massenspektrometer (Bruker Daltonics); der Analysator arbeitete im linearen Modus, und positive Ionen wurden im Massenbereich zwischen 1000 und 12.000 Da aufgezeichnet. Die Proben wurden in zweifacher Ausfertigung und für jeden Punkt zwei Spektren wurden erworben gesichtet. Massen Kalibrierung wurde nach jeweils vier Proben unter Verwendung von Protein-Kalibrationsstandard I (Bruker Daltonics) durchgeführt. Randomisierung in den Blöcken wurde in den Spektren Registrierung verwendet, um eine mögliche Batch-Effekt zu vermeiden. Danach werden die Rohdaten in TXT-Dateien exportiert wurde und die spektralen Komponenten wurden vorverarbeitet in unserer Gruppe erstellt Bioinformatik-Algorithmen, die Ausrichtung enthalten, Erkennung und Entfernung von Ausreißern Profile von Dixon Q-Test (Einzelspektren von etwa 5% der Proben entnommen wurden), im Durchschnitt der technischen Wiederholungen, Basisentfernung und Normalisierung des Gesamtionenstrom. Die Spektren Glättung, Spitzen Kommissionierung, Binning und statistische Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung Spectrolyzer-Software (Version 1.0.21.3590, MedicWave).
LC-MS /MS-Analyse von Serum-Proteom Components

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