PLOS ONE: Nikotin Dämpar Aktivering av Tissue residenta makrofager i musen magen genom β2 nikotin-acetylkolinreceptorn

Abstrakt

Bakgrund

kolinerga antiinflammatoriska vägen är en endogen mekanism genom vilken det autonoma nervsystemet dämpar makrofagaktivering via nikotinacetylkolinreceptorer (nAChR). Detta koncept har dock inte visats på cellnivå i intakt vävnad. För detta ändamål har vi studerat effekten av nikotin på aktivering av residenta makrofager i en mus mage beredning med hjälp av kalcium avbildning.

Metoder

Kalcium transienter ([Ca ^{2 +] _{i) i inhemska makrofager in i en mus mage preparat innehållande myenteric plexus och muskelskikt av Fluo-4. Aktivering av makrofager uppnåddes genom fokal puff administrering av ATP. Effekterna av nikotin på aktivering av makrofager utvärderades och nAChR involverad var farmakologiskt karakteriserats. Närheten av kolinerga nerverna till makrofager kvantifierades genom konfokalmikroskopi. Expression av β2 och α7 nAChR utvärderades av β2 immunhistokemi och fluorofor-märkta α-bungarotoxin}}

Resultat

83% av makrofager kolinerga åderbråck nervfibrer detekterades på avstånd. ≪ 900 nm. ATP-inducerad [Ca ^{2 +] _{Jag öka signifikant hämmas i 65% eller 55% av makrofager av 100 ^ M eller 10 ^ M nikotin, respektive. Denna inhiberande effekt reverserades av β2 nAChR föredrar antagonist dihydro-β-eryhtroidine men inte genom hexametonium (icke-selektiv nAChR-antagonist), mecamylamin (α3β4 nAChR-föredrar antagonist), α-bungarotoxin eller methyllycaconitine (både α7 nAChR-föredrar antagonist ). Makrofager i magen uttrycka β2 men inte α7 nAChR på proteinnivå, medan de i tarmen uttrycka båda receptorunderenheter.}}

Slutsats

Denna studie är den första i Málaga situ
demonstration av en hämning av makrofagaktivering av nikotin föreslå funktionell signalering mellan kolinerga neuroner och makrofager i magen. Data tyder på att den β2 subenheten av nAChR är kritiskt involverade i nikotin-inducerad hämning av dessa residenta makrofager

Citation:. Nemethova A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nikotin Dämpar Aktivering av Tissue residenta makrofager i musen magen genom β2 nikotin-acetylkolinreceptorn. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10.1371 /journal.pone.0079264

Redaktör: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, USA

Mottagna: 10 juni 2013, Accepteras: 26 september 2013, Publicerad: 1 november 2013

Copyright: © 2013 Nemethova et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Europeiska unionen 7: e ramprogram (IPODD), Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 till MS; genom ett bidrag på Research Foundation Flanders (FWO, Odysseus och Hercules-programmet) till GEB och genom en FWO postdoktoral forskning gemenskap till PJG. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

2000, Tracey och medarbetare visade att elektrisk stimulering av vagusnerven ger en potent antiinflammatorisk insignal till mjälten. I en musmodell av sepsis, vagal nervstimulering (VNS) resulterade i minskad proinflammatorisk cytokinproduktion, en effekt beroende av a7-nikotinacetylkolinreceptorer (nAChRs) [1,2]. Denna så kallade "kolinerg antiinflammatoriskt reaktionsvägen" (CAIP) verkar genom adrenerga mjält nerver gör synaptiska liknande kontakter med p2-adrenergiska receptor-uttryckande mjält-T-celler. Efterföljande frisättning av acetylkolin (ACh) från dessa T-celler är ansvarig för antiinflammatorisk effekt förmodligen genom att interagera med α7nAChR-uttryckande makrofager [1,2].

2005, förutsatt att vi bevis för att CAIP också modulerar tarmimmunsystemet. I en musmodell för postoperativ ileus, visade vi att VNS reducerade tarm manipulation-inducerad inflammation i tunntarmen, en gynnsam effekt beroende α7 nAChR men oberoende av mjälten [3,4]. Dessa data antyder att tarmen immunsystemet är i stället direkt moduleras av vagala nervändar och /eller enteriska neuroner. Som bosatta tarmmakrofager är de viktigaste aktörerna som utlöser detta inflammatoriska svar [5], dessa celler representerar den mest sannolika målet för CAIP. In vitro studier med isolerade peritoneala makrofager, har perifera mononukleära blodceller som härrör makrofager eller makrofagcellinjer verkligen rikligt visat att acetylkolin och nikotin minska cytokinproduktion [1-3,6,7] och öka fagocytos [6]. Icke desto mindre är det tveksamt i vilken utsträckning deras fenotyp verkligen påminner om de residenta makrofager som drabbats av enter neuroner, i synnerhet som receptoruttryck i makrofager kan vara upp- eller nedregleras som de har isolerats från sin naturliga miljö. Därför bestämde vi oss för att utveckla en teknik som skulle tillåta oss att studera effekten av nikotin på aktivering av residenta makrofager i deras naturliga miljö. Som makrofager aktiveras av ATP, en välkänd fara signal för immunceller [8,9], visar en ökning av intracellulär Ca ^{2 +, bor Ca 2 + avbildning valdes för att studera residenta makrofager i intakt platta ark mus mage preparat. Detta tillät oss att jämföra ATP framkallade Ca 2 + transienter ([Ca 2 +] _{i) i makrofager som finns i de glatta muskelskikt före och efter applicering av nikotin. Vi vidare använda flera antagonister med kända preferenser för specifika nAChR subenheter för att tillhandahålla ytterligare mekanistiska insikter roller nikotinreceptoruttryckande makrofager för CAIP i tarmen. Dessa farmakologiska rön bekräftades genom immunohistokemi. Slutligen analyserade vi andelen residenta makrofager som är i närheten av kolinerga nervfibrer.}}

Metoder

Etik Statement

Allt mus arbete utfördes enligt de tyska riktlinjerna för djurvård och välfärd (Deutsches Tierschutzgesetz) och godkännas av den bayerska statliga etiska kommittén (Regierung Oberbayern, som fungerar som institutionsstyrelse och användning kommittén för Technische Universität München) enligt §4 och §11 Deutsches Tierschutzgesetz under referensnummer 32 -568-2.

Vävnadsprov

Man 12-16 veckor gamla C57Bl /6-möss (Charles River, Sulzfeld, Tyskland) dödades genom cervikal dislokation. Magen skördades i iskall Krebs buffert innehållande (i mM) 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2PO 4, 25 NaHCOa 3, 2,5 CaClz 2 2 H 2O och 11 glukos och justerades till pH 7,4. Magen öppnades längs den större krökningen och tvättades med iskall Krebs. Under mikroskopisk undersökning, var magen nålas ner på en sylgard skålen och slemhinnan och submucosa avlägsnades försiktigt. Under dissektion vävnaden kontinuerligt perfusion med iskall Krebs lösning för att säkerställa lönsamheten i vävnaden. Endast den främre eller bakre halvan av magen nålas på en liten Sylgard ring med en central öppning på 100 x 200 mm ^2.}

Calcium imaging

Platta ark mus magen preparat var odlades i modifierad Krebs-lösning (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2PO 4, 20 NaHCOa 3, 2,5 CaClz 2 2 H 2O och 11 glukos) innehållande 30 ^ M av den fluorescerande indikator kalcium Fluo 4-acetoximetyl (AM) (Invitrogen) och 1,25 mM probenecid (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Tyskland) under 2 h vid rumstemperatur i mörker och gasas med karbogen (95% O 2 - 5% CO 2). Sylgard ringen monterades i inspelningen kammare med serosala sidan av magen som vetter mot botten av kammaren. Kammaren kopplades till perfusionssystemet för att möjliggöra kontinuerlig perfusion med karbogen-gasades Krebs lösning vid rumstemperatur. En wash-out period av 1,5 h tilläts före starten av experimentet. Vävnadskammaren var monterad på ett inverterat epifluorescensmikroskop (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Tyskland) utrustad med en höghastighetsmonokrom kamera (Zeiss AxioCam HSM) och mjukvara (Zeiss Axio Vision 4,8) för insamling och analys. Fluo-4 var glada med hjälp av en blå lysdiod (LED) Luxeon III (3W, 470nm dominerande våglängd, Philips Lumiled, Phillips, Hambur, Tyskland) var och Fluo-4 signaler detekteras med en filter kub F26-514 klar linje FITC BP (excitation: HC475 /35, dikroiska: 499, emission: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Tyskland) med hjälp av X20 mål (A-plan, NA = 0,25, Zeiss). Systemet uppmätta relativa förändringar i fluorescens (Δ F /F) av Fluo-4 bevaka förändringar i intracellulär kalcium ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + transienter registrerades startar 3 sekunder innan lokal administrering av ATP för totalt 14,5 s med en bildhastighet på 2 Hz och exponeringstid på 200 ms.}}

Vi använde ATP som ett verktyg för makrofagaktivering eftersom det är en signal för fara frigöras lokalt vid platsen för inflammation [8,9] och eftersom ATP är känt för att inducera cytokinutsöndring från makrofager via ökning av [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) och nikotin (Sigma-Aldrich) lokalt appliceras genom tryck utstötning från två mikropipetter med löptider på 200 ms och 10 sekund, respektive. Placeringen av mikropipetter säkerställas att de utkastade volymer omfattas identiska vävnadsområden. Mikropipetter fylldes med 1 mM ATP och 100 ^ M eller 10 iM nikotin upplöst i Krebs lösning innehållande 1,25 mM probenecid. Enligt tidigare publicerade kalibreringskurvor, vi uppskattar att varje ämne som appliceras av tryckutstötningspulser kommer att spädas ut med cirka 01:10 när den når vävnaden [13].

Lokal administration av ATP och nikotin tillät mätning av svaren vid multipla regioner (typiskt 4-5) i samma vävnad. Läget för regionerna i vävnaden dokumenterades med hjälp av koordinatsystemet som visas på den mobila mikroskop scenen. Effekten av nikotin på ATP-inducerad kalcium transienter åter studeras i samma regioner efter tillsats av olika nAChR-antagonister. Efter inspelning av svaren, var makrofager visualiserades genom vital inkubation av vävnaden med allofykocyanin (APC) -märkt rått-anti-mus-anti-F4 /80-antikropp (1: 250, eBioscience, Frankfurt, Tyskland) under 1 h, vid rumstemperatur i mörker och gasas med karbogen. Vävnaden tvättades i 15 minuter. Mikroskopet etappen flyttas för att hitta de områden där vi som spelats in från. Bilder av märkta makrofager förvärvades med hjälp av röda Z-LED P4 (3,5 W) exciteringskälla (625 nm dominerande våglängd, Seoul Semiconductor) och filter kub F46-006 ET filteruppsättning (excitation: ET 620/60, dikroiska: 660, emission: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Tyskland). Överlagring av Fluo-4 signaler och bilder av F4 /80 positiv makrofager tillät oss att analysera svaren i enskilda makrofager.

Immunohistokemi

För att etikettvävnads residenta makrofager, först använde vi den viktiga märkning protokoll som beskrivits ovan. Vävnaden fixerades därefter över natten vid rumstemperatur i en lösning innehållande 4% formaldehyd och 0,2% pikrinsyra i 0,1 M fosfatbuffert, tvättades 3 x 10 minuter i fosfatbuffert och inkuberades slutligen under 1 timme i en lösning innehållande 0,5% Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% hästserum löst i PBS (alla från Sigma-Aldrich). För att märka kolinerg varicosities ades vävnaden inkuberades över natten i blockeringslösning innehållande get-anti-vesikulär acetylkolintransportör (VAChT; 1: 1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Tyskland). Vävnaderna tvättades 3 X 10 minuter i PBS och inkuberades under 1,5-2 h i blockeringslösning innehållande Cy3-märkt anti-get-antikropp (1: 500; Dianova, Hamburg, Tyskland). Vävnaderna tvättades 3 x 10 minuter i PBS och monterades i anti-fade substans (20% PBS /NaN 3, 80% glycerol) på poly-L-lysin-belagda objektglas och täckglas för visning.}

för att märka β2 nAChR i vävnads residenta makrofager, slemhinnor fria gastric hela Mount preparat från vild-typ och p2 nAChR knock-out [14] möss fixerades under 10 min i iskall PBS-lösning innehållande 4% paraformaldehyd (PFA) . Vävnaderna tvättades sedan 2 X 10 min i PBS och inkuberades under 2 h i PBS innehållande 1% proteas-fritt Albumin Bovine fraktion V albumin (BSA; Serva, Heidelberg, Tyskland) och 10% normalt donkey serum (NDS; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania sylvania~~POS=HEADCOMP, USA). Vävnaderna inkuberades i 36 h med PBS innehållande 1% BSA, 5% NDS, rått-anti-mus-F4 /80 (1: 500; klon BM8, BioLegend, San Diego, USA) och kanin-anti-mus-β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland). Vävnaderna tvättades 3 X 10 minuter i PBS och inkuberades under 1 h i PBS innehållande 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor® 647-märkt get-anti-rått-antikropp (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA) och Cy3-märkt åsne-anti-kanin-antikropp (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, USA). Vävnaderna tvättades 3 x 10 minuter i PBS och monterades i slow-fade-reagens (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Belgien) på poly-L-lysin-belagda objektglas och täckglas för viewing.To etikett α7nAChR i vävnads residenta makrofager, en bit av mus mage och ileum utsattes för vital märkning med användning av Cy5-märkt α-bungarotoxin (Invitrogen) vid 0,1

• PLOS ONE: elektroakupunktur på ST36 lindrar magtömning och räddar Nätverk av interstitiella celler i Cajal i magen av diabetiska råttor
• PLOS ONE: Tonic och phasic glatt muskulatur regleras inte av PKCa - CPI-17 Banan i svin mage Antrum och Fundus