PLoS One: nikotin csillapítja aktiválása Tissue Resident makrofágok egér gyomor keresztül β2 nikotin acetilkolin receptor

absztrakt

alapon

A kolinerg gyulladásgátló pálya egy endogén mechanizmus, amellyel a vegetatív idegrendszer csillapítja makrofág aktiváció keresztül nikotinos acetilkolin receptorok (nAChR). Ez a koncepció azonban nem igazolták a sejtek szintjén az ép szövetekben. Ebből a célból, az általunk hatását vizsgáltuk a nikotin az aktiválási rezidens makrofágok egy egér gyomor készítmény útján kalcium képalkotás.

Módszerek

Kalcium tranziensek ([Ca ^{2 +] _{i) a rezidens makrofágok rögzített egér gyomor tartalmazó készítmény plexus myentericus és az izom rétegek Fluo-4. Makrofágok aktiválása értük el fokális puff beadása ATP. A hatások a nikotin a makrofágok aktiválása értékelték, és a nAChR érintett volt farmakológiailag jellemezték. A közelsége kolinerg idegek makrofágok mennyiségileg konfokális mikroszkóppal. Expressziója β2 és α7 nAChR értékeltük β2 immunhisztokémiai fluorofór-jelölt α-bungarotoxin. Katalógusa}}

Eredmények katalógusa

83% makrofágok kolinerg visszeres idegrostokat detektáltuk távolságok < 900nm. Az ATP által kiváltott [Ca ^{2 +] _{i növelik jelentősen csökkent a 65% vagy 55% a makrofágok 100 jiM vagy 10 nM nikotin, ill. Ez a gátló hatás megfordítható a β2 nAChR preferáló antagonista dihidro-β-eryhtroidine de nem hexametónium (nem-szelektív nAChR-antagonista), mekamilamin (α3β4 nAChR-preferáló antagonista), α-bungarotoxin vagy metillycaconitint (mind α7 nAChR-preferáló antagonista ). A makrofágok a gyomorban kifejezni β2 de nem α7 nAChR fehérje szinten, míg a bélben expressz mindkét receptor alegységek. Katalógusa}}

Következtetés katalógusa

Ez a tanulmány az első katalógusa situ
támasztható alá gátlása a makrofág aktiválást nikotin ami arra utal, funkcionális jelátviteli között kolinerg neuronok és makrofágok a gyomorban. Az adatok arra utalnak, hogy a β2 alegységének nAChR kritikusan részt vesz a nikotin által kiváltott gátlás ilyen rezidens makrofágok. Katalógusa

Citation: Némethová A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) a nikotin csillapítja aktiválása Tissue Resident makrofágok egér gyomor keresztül β2 nikotin acetilkolin receptor. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10,1371 /journal.pone.0079264 katalógusa

Szerkesztő: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: június 10, 2013; Elfogadva: szeptember 26, 2013; Megjelent: november 1, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Némethová et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott a támogatást az Európai Unió 7. keretprogram (IPODD), amely a Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 MS; által nyújtandó, a Research Foundation-Flandria (FWO, Odüsszeusz és Hercules program) a GEB, és egy FWO posztdoktori ösztöndíjjal PJG. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

2000-ben, Tracey és munkatársai kimutatták, hogy az elektromos stimulálása a vagus ideg biztosít erős gyulladáscsökkentő bemenetet a lépben. Egy egér modellben a szepszis, vagus ideg stimuláció (VNS) csökkenését eredményezte a pro-gyulladásos citokin termelést, amely hatás függ α7 nikotinos acetilkolin receptorok (nAChR) [1,2]. Ez az úgynevezett "kolinerg gyulladásgátló pálya" (CAIP) keresztül működik adrenerg lép idegek így szinaptikus-szerű kapcsolatokat β2 adrenerg receptort expresszáló lép-T-sejtek. Későbbi acetilkolin felszabadulását (ACh) ezekből a T-sejtek felelősek a gyulladáscsökkentő hatás feltehetően kölcsönhatásban α7nAChR expresszáló makrofágok [1,2].

2005-ben bizonyították, hogy a CAIP is modulálja a bél immunrendszert. Egy egér modellben a posztoperatív ileus, azt mutatta, hogy VNS csökkentett bél manipuláció okozta gyulladás a vékonybél, jótékony hatással függ α7 nAChR de független a lépben [3,4]. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a bél immunrendszer inkább közvetlenül modulált vagus idegvégződések és /vagy enterikus neuronok. Rezidens bél makrofágok a fő szereplői kiváltó ezen gyulladásos válasz [5], ezek a sejtek képviselik a legvalószínűbb célpontja a CAIP. In vitro vizsgálatok segítségével izolált peritoneális makrofágok, perifériás vér mononukleáris sejt-eredetű makrofágok vagy makrofág sejtvonalak valóban bőségesen igazolta, hogy az acetil-kolin és a nikotin csökkenti citokintermelést [1-3,6,7], és növeli a fagocitózis [6]. Mindazonáltal, továbbra is kérdéses, hogy milyen mértékben a fenotípust tényleg hasonlít a rezidens makrofágok által érintett enterikus neuronok, különösen a receptor expresszióját a makrofágokban lehet felfelé vagy lefelé szabályozni, mivel azok már izoláltak természetes környezetben. Ezért úgy döntöttünk, hogy dolgozzon ki egy olyan technikát, amely lehetővé tenné számunkra, hogy tanulmányozza a hatását a nikotin az aktiválási rezidens makrofágok a természetes környezetükben. A makrofágok által aktivált ATP-t, egy jól ismert veszély jel immunsejtek [8,9], növekedést mutat intracelluláris Ca ^{2+, élő Ca 2+ képalkotó választották, hogy tanulmányozza a rezidens makrofágok intakt lapos lapos egér gyomor készítmények. Ez lehetővé tette számunkra, hogy hasonlítson az ATP által kiváltott Ca 2+ tranziensek ([Ca 2 +] _{i) a makrofágokban található, a simaizom rétegek alkalmazása előtt és után a nikotin. Mi tovább használt többféle antagonisták ismert preferenciák specifikus nAChR alegységek annak érdekében, hogy további mechanisztikus betekintést szerepeinek nikotin receptort expresszáló makrofágokban a CAIP a bélben. Ezek farmakológiai eredmények megerősítették immunohisztokémiával. Végül elemeztük az aránya rezidens makrofágok, amelyek közel kolinerg idegrostok. Katalógusa}}

Módszerek katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

Minden egér munkát végeztek szerint a német irányelvek az állatok gondozásáért és jólétéért (Deutsches Tierschutzgesetz), és jóváhagyta a bajor állam etikai bizottság (Regierung Oberbayern, amely arra szolgál, mint a gazdasági Care and Use Committee a Technische Universität München) szerint 4.§ és §11 Deutsches Tierschutzgesetz hivatkozási szám alatt 32 -568-2.

a szövetminták

Férfi 12-16 hetes C57BL /6 egereket (Charles River, Sulzfeld, Németország) megöljük. A gyomrot betakarított jéghideg Krebs pufferben (mm) 117 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCI 2 2 H 2O és 11 glükóz, pH-ját 7,4-en. A gyomrot megnyílt a nagyobb görbület mentén, és mossuk jéghideg Krebs. A mikroszkopikus vizsgálat, a gyomrot tűzött le a SYLGARD edénybe, és a nyálkahártya és nyálkahártya alatti óvatosan eltávolítjuk. A boncolás, a szövetet folyamatosan perfundáltuk jéghideg Krebs-oldatot, hogy biztosítsák életképességét a szövetet. Csak az elülső vagy hátulsó fele a gyomor volt tűzve egy kis SYLGARD gyűrű egy központi nyílás, 100 x 200 mm-es ^2.}

Kalcium képalkotó

sík lap egér gyomor készítmények voltak inkubáljuk módosított Krebs-oldatba (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 magnézium-klorid _{2 6 H 2 O, 1,2 hidrid 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCI 2 2 H 2O és 11 glükóz), amely 30 uM a fluoreszcens kalcium indikátor Fluo 4-acetoxi-metil (AM) (Invitrogen) és 1,25 mM probenecid (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Németország) 2 órán át szobahőmérsékleten, sötétben és a gázt a Carbogen (95% O 2 - 5% CO 2). A SYLGARD gyűrű volt szerelve a felvétel kamra serosa oldalán a gyomor felé néző alja a kamrából. A kamrát csatlakozik a perfúziós rendszer lehetővé teszi a folyamatos perfúzió Carbogen-elgázosított Krebs-oldattal, szobahőmérsékleten. Kimosódási időszak 1,5 órán hagytuk, mielőtt az a kísérlet megkezdése. A szöveti kamrába szerelt fordított epifluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss Jena, Németország) ellátott nagy sebességű fekete-fehér kamera (Zeiss AxioCam HSM) és szoftver (Zeiss Vision Axio 4.8) beszerzését és elemzését. Fluo-4 izgatott volt egy kék fénykibocsátó dióda (LED) Luxeon III (3W, 470nm domináns hullámhossz, Philips Lumiled, Phillips, Hambur, Németország) és a Fluo-4 jelek detektálására szűrővel kocka F26-514 világos vonal FITC BP (gerjesztés: HC475 /35, dichroic: 499, emisszió: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Németország) segítségével X20 objektív (A-terv, NA = 0,25, Zeiss). A rendszer mért relatív változásait fluoreszcencia (Δ F /F) Fluo-4 felügyelet változását az intracelluláris kalcium ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + tranziensek jegyeztek kiindulási 3 ek előtt helyi beadása ATP összesen 14,5 s egy frame rate 2 Hz és az expozíciós idő 200 ms.}}

felhasznált ATP-t, mint eszköz a makrofág aktiváció, mivel ez az a veszély jel megjelent helyileg a gyulladás helyén [8,9], és mivel az ATP ismert, hogy indukálja a citokin szekréciót makrofágok keresztül növekedése [Ca ^{2 +] _{i [10-12]. katalógusa}}

ATP (Sigma-Aldrich) és a nikotin (Sigma-Aldrich) helyileg alkalmazott nyomás kiesés két mikropipetták időtartama 200 ms és 10 sec, ill. A helyzet a mikropipetták biztosította, hogy a kilépő mennyiségek hatálya alá tartozó azonos szöveti régióban. A mikropipetták tele voltak 1 mM ATP-t és 100 uM vagy 10 jiM nikotint feloldjuk tartalmazó Krebs-oldattal 1,25 mM probenecidet. Szerint a korábban közzétett kalibrációs görbék, úgy becsüljük, hogy bármely olyan anyag által alkalmazott nyomás ejekciós impulzusokat kell hígítani körülbelül 01:10, amint eléri a szövet [13].

Helyi beadás az ATP és a nikotin megengedett mérése válaszok a több régió (általában 4-5) ugyanabban a szövetben. A tartományok helyzetét a szövetben dokumentálták a koordinátarendszer jelenik meg a mobil mikroszkóp színpadon. A hatás a nikotin ATP által kiváltott kalcium tranziensek ismét vizsgáltuk ugyanabban a régiókban hozzáadása után különféle nAChR antagonisták. A felvétel után a válaszokat, makrofágok tettük láthatóvá létfontosságú inkubálása a szövet allofikocianin (APC) jelzett patkány anti-egér anti-F4 /80 antitestet (1: 250, eBioscience, Frankfurt, Németország), 1 óra, szobahőmérsékleten a sötét és elgázosították a Carbogen. A szövetet mossuk 15 percig. A mikroszkóp színpad helyezni, hogy megtalálják a régiókban, ahol felvett. Képek a jelzett makrofágok szerezte a piros Z-LED P4 (3,5 W) gerjesztő forrás (625 nm domináns hullámhossz, Seoul Semiconductor), és szűrjük kocka F46-006 ET szűrő szett (gerjesztés: ET 620/60, dichroic: 660, emisszió: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Németország). Az overlay Fluo-4 jelek és képek F4 /80 pozitív makrofágok lehetővé tette számunkra, hogy elemezze a válaszokat az egyes makrofágok. Katalógusa

Az immunhisztokémiai katalógusa

címke szöveti rezidens makrofágok, először használta a létfontosságú címkézés az előzőkben ismertetett protokoll. A szövetet ezután fix éjszakán át szobahőmérsékleten olyan oldatban, amely 4% -os formaldehid és 0,2% pikrinsavat tartalmazott 0,1 M foszfát pufferben, majd 3 * 10 perc foszfát pufferben, és végül 1 órán át inkubáltuk egy oldatot, amely 0,5% Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% lószérum PBS-ben oldott (mind a Sigma-Aldrich). A címke kolinerg varikozitások, a szövetet egy éjszakán át inkubáljuk a blokkoló oldatban tartalmazó kecske anti-vezikuláris acetilkolin transzporter (VAChT; 1: 1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Németország). A szöveteket mostuk 3 x 10 percig, PBS-ben, és inkubáltuk 1,5 - 2 óra hosszat a blokkoló oldatban tartalmazó Cy3-jelzett anti-kecske ellenanyaggal (1: 500; Dianova, Hamburg, Németország). A szöveteket mostuk 3 x 10 percig PBS-ben és szerelt anti-fading anyag (20% PBS /NaN 3, 80% glicerin) poli-L-lizinnel bevont csúszdák és lefedtük megtekintésre.}

címke β2 nAChR szöveti rezidens makrofágok, nyálkahártya-mentes gyomor whole mount készítmények a vad típusú és a p2 nAChR knock-out [14] egereket fixáltuk 10 percig jéghideg PBS-oldattal, amely 4% -os paraformaldehiddel (PFA) . A szöveteket ezután mostuk 2 x 10 percig PBS-ben és 2 órán keresztül inkubáljuk PBS-ben, amely 1% proteáz-mentes Albumin Bovine Fraction V albumin (BSA; Serva, Heidelberg, Németország), és 10% normál szamár-szérum (NDS; Jackson Immuno, Pennsylvania, USA). A szöveteket inkubáltuk 36 óra tartalmazó PBS-sel 1% BSA-t, 5% NDS, patkány anti-egér F4 /80 (1: 500; klón BM8, BioLegend, San Diego, USA) és a nyúl anti-egér β2 nAChR (1: 200; santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Németország). A szöveteket mostuk 3 x 10 percig PBS-ben és 1 órán át inkubáltuk PBS-ben, amely 1% BSA-t, 5% NDS, Alexa Fluor® 647-jelzett kecske anti-patkány antitesttel (1: 1000; Jackson Immuno, Pennsylvania, USA) és Cy3-jelzett szamár anti-nyúl antitesttel (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, USA). A szöveteket mostuk 3 x 10 percig PBS-ben és szerelt lassú fading reagens (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Belgium) poli-L-lizinnel bevont csúszdák és lefedtük a viewing.To címke α7nAChR szöveti rezidens makrofágok, egy darab egér gyomor és a csípőbél vetettük alá létfontosságú címkézés segítségével Cy5-jelzett α-bungarotoxin (Invitrogen), 0,1 ug /ml RPMI 1640 közegben (Lonza, Basel, Svájc), 4 ° C-on 15 percig [4]. A szöveteket ezután rögzített tartalmazó PBS-ben 4% PFA. A nyálkahártya és a nyálkahártya alatti szövetre eltávolítottuk, és a szöveteket inkubáltuk 2 órán blokkoló oldatban, amely 1% BSA-ban. A szöveteket ezután inkubáltuk 60 órán blokkoló oldatban tartalmazó patkány anti-egér F4 /80 (klón BM8, BioLegend), majd 3 x 10 percig mostuk PBS és 1 órán át inkubáltuk PBS-ben, amely 1% BSA-t és Cy3-jelzett anti-patkány antitesttel (1: 1000; Jackson Immuno, Pennsylvania, USA). Végül a szöveteket mostuk 3 x 10 percig PBS-ben és szerelt lassú fading anyag poli-L-lizinnel bevont csúszdák és lefedtük megtekintésre.

Konfokális mikroszkópia és képanalízis

a képeket használ LSM 510 (Carl Zeiss) konfokális mikroszkóp Plan-Neofluar x40 /1.3 Olaj DIC és a Plan Apochromat X63 /1.4 Olaj DIC célkitűzéseket. Lézeres hullámhosszai 543 nm-nél és 633 nm-nél használtunk a gerjesztés az fluorofórok Cy3 és APC vagy Cy5, ill. Cy3 és APC vagy Cy5 jelek alkalmazásával detektáltuk a szűrő meghatározza BP 565-615 IR és BP 650-710 IR, ill.

képhalmaitól mennyiségi elemzésének segítségével X63 cél beszkennelt XY felbontása 1024 × 1024, amely fedett terület 95,5 × 95,5 um ^{2. Az első és utolsó optikai szeleteket vettünk a tetején és alján a külső felületének egy makrofág. Az optikai mélység minden szelet volt 900 nm. Két egymást követő szeletek átfedik 500 nm. Általában 9 és 16 között szeleteket keletkezett így a beolvasási mélység 3,2-6,0 um tartalmazó 1-3 makrofágok és VAChT pozitív fonalak keresztezési makrofágok. Képhalmaitól elemeztük Image J Pro. Katalógusa}

Képek a β2 és α7 nAChR-jelölt makrofágok vettük fel a X63 objektív és szkennelt XY felbontása 1024 × 1024, amely fedett terület 95,5 × 95,5 um ^{2. Az optikai mélység a képek volt 900 nm-en.}

Pharmacology

blokkolásához akciós potenciál terjedési a neuronokban, tetrodotoxin (Biotrend, Köln, Németország) adtunk a átáramló Krebs oldat 1 um. A farmakológiai jellemzése, a következő nikotinsav-blokkolókat adtunk a Krebs-oldatot átáramló a szövet: 200 uM hexametónium (Sigma-Aldrich), 100 uM mekamilamin (Sigma-Aldrich), 10 uM dihidro-β-erythroidine (DHBE; Sigma-Aldrich) , 100 nM, 3 uM és 10 uM α-bungarotoxin (ABGT; Tocris) és 10 nM és 100 nM metillycaconitint (MLA, Tocris). Hexametónium, mekamilamin és DHBE teszteltünk a koncentrációk, amelyek képesek voltak megszüntetni nikotin gyors serkentő posztszinaptikus potenciálok tengerimalac myentericus neuronok [15] .A használatát 10 nM és 100 nM MLA alapul koncentráció illetve használni, hogy megakadályozza α7 alegységet tartalmazó nAChR [16] és gátlására alkalmazott IL-6 szekréciót izolált peritoneális makrofágok [3]. katalógusa

Az adatok elemzése és a statisztikák katalógusa

A maximális relatív változása fluoreszcencia (Δ F /F), válaszul a ATP beadás fejeztük% -os növekedést fenti bazális fluoreszcencia előtt ATP beadásra. A statisztikai elemzéseket végeztünk a Sigma Plot 9.0 (Systat Software Inc, Erkrath, Németország). Az adatokat whisker diagramot a medián és a 25 ^{-én és 75 th percentil, valamint a 10 -én és 90 th százalékosztályok. Nem normális eloszlású párosított elemeztük a Wilcoxon tesztet. A különbségeket akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak P katalógusa < 0.05. N katalógusa számok zárójelben, számokat makrofágok /szövetek tanult, azaz eredményeként felvételek alapján 20 makrofágok 5 szövetekben (egyenlő 5 állat) be (20/5). Katalógusa}

Eredmények katalógusa

térbeli kapcsolata szöveti rezidens makrofágok és kolinerg varikozitások egér gyomor katalógusa

Mi használt konfokális mikroszkóppal értékelésére környéke között F4 /80-pozitív makrofágok és VAChT pozitív visszér kolinerg idegrostok az egér gyomor (1A). Részletes elemzés feltárta, hogy 83% -a 41 makrofágok tanulmányozott belül találhatók a 900 nm és legalább egy visszeres kolinerg ideg rost (1B-C).

reprodukálhatósága ATP kiváltotta [Ca 2 +] i jeleket szöveti rezidens makrofágok katalógusa

Microejection ATP által kiváltott erős, gyors kialakulását [Ca ^{2 +] _{i átmeneti makrofágok érte el a csúcsot 8-10 mp után a kérelmet, majd lassú visszatér a kiindulási [Ca 2 +] i szint (2A és Film S1). Mivel nem volt mindig teljes felépülés a kiindulási értékre a rögzítési periódus alatt, a maximális [Ca 2 +] i jelet az elemzéshez használt összes kísérlet. Nem tachyphylaxiát volt megfigyelhető, mivel a maximális amplitúdó [Ca 2 +] i jel válaszként egy második ATP-adagolás után 10 perccel az első, nem különbözött a kezdeti maximális válasz (2b ábra).}}

hatása nikotin [Ca ^{2 +] _{i jeleket szöveti rezidens makrofágok katalógusa}}

hatásának vizsgálatára a nikotin ATP kiváltotta [Ca ^{2+] _{i jelek azt microejected nikotin 10 másodpercig, majd azonnal újra alkalmazható ATP rá ugyanabban a régióban. Egy racionális használata a nikotin, mint a szelektív, nem degradált nAChR agonista volt, hogy utánozza nikotin receptor aktiváció acetilkolin felszabadulását származó kolinerg neuronok. Elemezve a változások [Ca 2 +] i minden makrofágok kiderült, hogy a nikotin szignifikánsan csökkentette az ATP által kiváltott [Ca 2 +] i jelek (2D ábra és F). A részletesebb elemzés a hatását a nikotin az ATP által kiváltott [Ca 2 +] i-tranziensek során három populáció makrofágok (2D ábra G). A nikotin a 10 és 100 uM legyengített az ATP-kiváltotta [Ca 2 +] i jeleket 55% és 65% a makrofágok, ill. A [Ca 2 +] i jel változatlan maradt 36% és 28% a makrofágok alkalmazását követően 10 jiM és 100 jiM nikotin, ill. Egy kis részét, 10 nM és 100 nM nikotin fokozta az ATP-vel kiváltott [Ca 2 +] i válasz (9%, illetve 7% makrofágok -kal). Katalógusa}}

Hogy ne torzítás további elemzés alapjául nikotin hatásai az összes makrofágok független attól, hogy az ATP által kiváltott [Ca ^{2 +] _{i jel csökkent, nőtt vagy nem változott. katalógusa}}

szerepe neuronok a nikotinos kiváltott csillapítása makrofág aktiváció katalógusa

a nikotin közvetlenül aktiválja enterális neuronok és megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy aktiválását közeli myenterikus neuronok hozzájárult a legyengített [Ca ^{2 +] _{i válaszok makrofágok. Nem találtunk semmilyen bizonyítékot az ilyen közvetett gátló út, mert a csillapítás az ATP-vel kiváltott [Ca 2 +] i jel nikotin maradt jelenlétében tetrodotoxin (2C ábra). Érdemes megjegyezni azonban, hogy azoknak az aránya, makrofágok, ahol a nikotin nem változtatta meg az ATP által kiváltott [Ca 2 +] i jeleket drasztikusan csökkent (28% vs 6%). Ugyanakkor, a makrofágok, amelyek a nikotin gátolja vagy potencírozza az ATP kiváltotta [Ca 2 +] i jeleket nőtt 65% -ról 71% és 7% -ról 23% -ra.}}

farmakológiai jellemzése gátló hatásának nikotin szöveti rezidens makrofágok

a makrofágok aktiválása által ATP és a gátlás az ATP válasz 100 jiM nikotin megbízhatóan rögzítve mind a 21 készítmények ábrán 2F. Ez lehetővé tette számunkra, hogy végre antagonisták tanulmányok szükségessége nélkül restudy gátló válasz azokban makrofágok kezelt antagonisták. Sőt, ezzel csökkentette a felvétel időszakokat olyan szintre, amely nem veszélyeztetheti a jelerősséget és a garantált reprodukálható ATP válaszokat. Annak érdekében, hogy tanulmányozzuk a nAChR-alegységek részt vesz a gátló hatása a nikotin, teszteltük öt különböző blokkolók ismerten alegység preferenciák [17] (3. ábra). A gátló hatást a nikotin ATP-kiváltotta [Ca ^{2 +] _{i válaszok nem változott a jelenléte a nem-szelektív ganglion nAChR antagonista hexametónium a α3β4 nAChR-preferáló antagonista mekamilamin vagy α7 nAChR-preferáló antagonisták α-bungarotoxin és metillycaconitint (3A ábra). Azonban a β2 nAChR-preferáló antagonista di-hidro-β-eryhtroidine megfordította a gátló hatása nikotin ATP-kiváltotta [Ca 2 +] i válaszok makrofágok (3B ábra).}}

Bár használt ABGT olyan koncentrációkban, amelyek leírták, hogy megbízhatóan megakadályozza α7 nAChR a neuronokban és izolált alveoláris makrofágok [18], voltunk az érintett, hogy esetleg nem lesz képes, hogy antagonizálják a gátló hatása nikotin miatt kedvezőtlen verseny a kötőhely. Azonban ez nem tűnik valószínűnek, mert még koncentrációban 3 uM és 10 uM ABGT nem volt képes visszafordítani a gátló hatása a nikotin ATP kiváltotta [Ca ^{2 +] _{i válaszok (3A ábra). ABGT egyáltalán nem is fordított a csillapítás által kiváltott 10 nM nikotin (3C, ábra).}}

Címkézése β2 de nem a7 nAChR szöveti rezidens makrofágok katalógusa

A további bizonyítékot arra, hogy vonják β2 nAChR de nem α7 nAChR gátló hatása a nikotin ATP kiváltotta [Ca ^{2 +] _{i válaszok immunhisztokémiai a p2 nAChR és létfontosságú címkézése α7 nAChR által ABGT rezidens makrofágok gyomor muscularis végeztünk (4. ábra). A legtöbb rezidens makrofágok gyomor muscularis arra p2 nAChR-immunreaktív (4A) támogatja a megfigyelt antagonista hatását DHBE nikotinos gátlása ATP válaszokat. Az alkalmazott antitest p2 nAChR konkrét hiánya miatt a p2 nAChR immunreaktivitás a β2 nAChR knockout egér (4B ábra). Katalógusa}}

Vital címkézése α7 nAChR által ABGT kiderült hiányában α7 nAChR szöveti rezidens makrofágok az egér gyomor (4C), ezzel szemben, az intesztinális makrofágokat jelöltük ABGT (ábra 4d). A hiányzó α7 nAChR gyomor muscularis rezidens makrofágok megerősítette, hogy nincs antagonizmusa α7 nAChR-preferáló blokkolók ABGT és az MLA a gátló hatása a nikotin ATP kiváltotta [Ca ^{2 +] _{i válaszok ezekben a sejtekben.}}

Discussion

a dátum, a hatás a nikotin vizsgálták csak az izolált makrofágokban vagy makrofág sejtvonalakban. Itt az általunk kifejlesztett egy in vitro katalógusa modellje egér zúzógyomrukat-plexus myentericus készítmény hatásának vizsgálatára a nikotin szöveti makrofágok rezidens azok természetes környezetben. Ez a jelen tanulmány tehát az első, hogy azt mutatják, hogy a nikotin közvetlenül gátolja aktiválását szöveti rezidens makrofágok keresztül β2 alegységet tartalmazó nAChR, és ezáltal biztosítja az alapot a funkcionális jelátviteli között kolinerg neuronok és makrofágok a bélben. A következtetést támasztja alá több sornyi bizonyítékok. Először is, az ATP által kiváltott [Ca ^{2 +] _{i tranziensek makrofágok jelentősen csökken a nikotin jelenlétében is az ideg-blokkoló tetrodotoxin. Másodszor, a nikotin által indukált csillapítás ATP válaszok makrofágok megfordult DHBE, de nem hexametónium, mekamilamin, ABGT vagy MLA. A farmakológiai eredmények alátámasztották demonstrációja β2-positiv de ABGT-negatív nAChR alegységek a gyomor makrofágok. Harmadszor, a legtöbb makrofágok közvetlen szomszédságában visszeres kolinerg idegrostok. Hasonló közelsége makrofágok idegrostok volt megfigyelhető a patkány intesztinális muscularis [3].}}

kritérium meghatározására használt közelsége között makrofágok és kolinerg ideg rostok (a 900 nm-távolság) egyetért a koncepció extraszinaptikus kommunikáció . E koncepció szerint a diffúzió kötet átviteli előfordulhatnak 100 nm-um közötti távolság a forrás és a cél [19]. Feltételezzük, hogy a legtöbb, ha nem az összes, kolinerg idegek közvetlen szomszédságában makrofágok származott myenterikus idegsejt szervek alapján a korábbi megfigyelés, hogy a vagus rostok ne forduljon bél rezidens makrofágok [3], Ezt támasztja alá az is megállapítást, hogy a gyomor vagus efferens rostokat szinte kizárólag végződnek enterális ganglionokban [20], ahol aktiválják a legtöbb myentericus neuronok keresztül nikotinos receptorok [15].

A CAIP jelent élettani rendszer ellenőrzésére makrofág aktiváció során gyulladásos állapotok. A gyulladásgátló hatás CAIP aktiválás Kimutatták in vivo
által bolygóideg-stimuláció egér modellekben a szepszis és a posztoperatív ileus [2,3] és a in vitro
nikotin beadás izolált lipopoliszacharidot stimulált makrofágok [1-4,21]. A jelen vizsgálatban azt találtuk, hogy a nikotin csökkenti az ATP által kiváltott növekedés a sejten belüli Ca ^{2+ a rezidens makrofágok a gyomorban. Érdekes, hogy ez a hatás megfordul a β2 nAChR alegység preferáló antagonista DHBE ami arra utal, bevonása ennek alegység a nikotin-mediált moduláció a rezidens makrofágok. Ez a megfigyelés összhangban van a korábbi megállapítást, hogy DHBE fordított nikotin által indukált gátlását a tumor nekrózis faktor-α (TNF-α) kiadás és a megnövekedett fagocitózis izolált peritoneális makrofágok [6]. A vonal, citokin termelését humán neuroblasztóma sejtvonal stabilan transzfektálva α4β2 nAChR jelentősen csökken a nikotin előkezelés [22]. Bár ezek az adatok arra utalnak, hogy α4β2 nAChR közvetítheti a hatását a nikotin az ATP által kiváltott növekedés a sejten belüli Ca 2+, újabb bizonyítékok azt mutatják, hogy β2 alegységek is össze más α alegységek, beleértve α7 alegységek. Egy nemrégiben publikáció tárgyalja a elektrofiziológiai tulajdonságai α7β2 nAChR kifejezett humán epiteliális sejtvonal, azt mutatta, hogy alacsony koncentrációjú DHBE antagonizálta α7β2 nAChR de nem a7 nAChR receptor [16]. Ezek és más adatokat a farmakológiai profilját DHBE azt sugallják, hogy DHBE egy rendkívül szelektív antagonista p2 nAChR de nem megbízhatóan megkülönböztetést különböző részegységek, α3, α4 vagy α7 a β2. Azonban a immunhisztokémiai és létfontosságú címkézése gyomor rezidens makrofágok nem kedvez bevonásával α7 nAChR mert gyomor- makrofágok nem jelöltük ABGT de kifejezte a β2 nAChR alegység.}

Ennek ellenére azt választhatják a meglehetősen konzervatív értelmezése adataink arra következtet, hogy β2 nAChR kritikusan részt nikotin gátolja a makrofágok aktivitását, bár valószínű, hogy a használt koncentrációjú vizsgálatunkban DHBE előnyösen blokkok α4β2 nAChR. A készítmény kiválóan alkalmas, hogy foglalkozzon a jövőbeli vizsgálatokban a lehetséges hozzájárulását α7β2 nAChR által gyakorolt ​​hatását vizsgálták, nikotin szöveti rezidens makrofágok α7 nAChR, p2 nAChR és α7β2 nAChR dupla knock-out egerekben. Hasonló stratégiákat kell használni, hogy tanulmányozza a jelentősége, α4β2 nAChR. Katalógusa

Fontos megjegyezni, hogy az antagonista hatása DHBE nem szelektív makrofágok DHBE, mint hexameto és mekamilamint is blokkolja nikotinos szinapszisok gyomor- myenterikus neuronok [15]. Mindazonáltal, a nikotinos receptorok makrofágok kell rendelkeznie, különböző tulajdonságú, mint az enterikus neuronok, mivel sem hexametónium sem mekamilamin megfordította a nikotin által indukált csillapítás az ATP-kiváltotta válaszokat a makrofágok. Hexameto és mekamilamin fejtik ki intézkedései eltömődés a pórusok a nikotinos csatorna [23-25]. Hogy képtelenek megfordítani a nikotin gátolja a makrofágok feltételezik az atipikus nAChR szaporodását. Valóban, a rögzítés Ca ^{2+ tranziensek válaszul nikotin alkalmazás mellett végzett megnövelt [Ca 2 +] _{I csak 13% makrofágok (6 a 45 makrofágok; az adatokat nem mutatjuk). Ez a populáció sokkal kisebb, hogy az arány a makrofágok, amelyek a nikotin modulált az ATP által kiváltott [Ca 2 +] i.}}

Sok bizonyíték azt sugallja, hogy α7 nAChR döntő szerepet játszik a nikotin által indukált csökkenését makrofág citokin termelés [2,3,6,26]. Korábban azt valóban kimutatták, hogy a nikotin nem csökkentette a TNF-α termelés peritoneális makrofágokban a α7 nAChR knockout egerekben [6], mivel a gyulladáscsökkentő hatás a vékonybélben a vagus ideg stimuláció a modellben a posztoperatív ileus elvész ezekben KO egerek [4]. A jelen tanulmányban azonban a nikotin hatásának ATP-indukálta makrofág aktiváció nem blokkolja a α7 nAChR preferáló blokkolók ABGT és MLA ellen érvel bevonásával α7 nikotinos acetilkolin receptorok. Ezt támasztja alá az a címkézés hiánya a gyomor muscularis makrofágok α7 nAChR-preferáló α-bungarotoxin. A bélben, azonban tettük megfigyelni α-bungarotoxin pozitív jelölt muscularis makrofágok [4, és ez a tanulmány], jelezve a régió-specifikus különbségek a fenotípus ezen immunsejtek.

Bár a nyilvánvaló hiánya ABGT érzékeny α7 nAChR vizsgálatunkban tűnik ellentmondásosnak a korábban látottakhoz, mi eléggé abban, hogy ezek az adatok nem miatt képtelenek a ABGT versenyezni a kötőhely azonos koncentrációban alkalmazott vizsgálatunkban blokkok neuronális α7 nAChR az agyban és a elszigetelt alveoláris makrofágok [18].

• PLoS One: Elektroakupunktúrája at ST36 javítja gyomor kiürülését és a mentések Networks a kötőszöveti sejtek Cajal gyomrában Diabetikus Rats
• PLoS One: Tonic és fázisos simaizom-összehúzódást nem szabályozza a PKC - CPI-17 útvonal sertés gyomor Antrum és Fundus