PLOS ONE: Nicotine atenua a activação de Tissue Residente macrófagos no estômago do rato através da β2 receptor de acetilcolina nicotínica

Abstract

Fundo

A via anti-inflamatória colinérgica é um mecanismo endógeno pelo qual o sistema nervoso autônomo atenua a activação de macrófagos via receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR). Este conceito tem, contudo, não foi demonstrada ao nível celular no tecido intacto. Para este fim, temos estudado o efeito da nicotina na ativação de macrófagos residentes numa preparação estômago do rato por meio de imagem de cálcio.

Métodos

transientes de cálcio ([Ca ^{2 +] _{i) em macrófagos residentes foram registrados em uma preparação de estômago de rato contendo plexo mioentérico e camadas musculares, Fluo-4. A activação de macrófagos foi conseguida por administração de sopro focal de ATP. Foram avaliados os efeitos da nicotina na ativação dos macrófagos eo nAChR envolvidos foi farmacologicamente caracterizado. A proximidade dos nervos colinérgicos para macrófagos foi quantificada por microscopia confocal. Expressão de β2 e α7 nAChR foi avaliada por imuno-histoquímica β2 e α-bungarotoxina marcado com fluoróforo}}

Resultados

Em 83% dos macrófagos fibras nervosas varicosas colinérgicos foram detectados em distâncias <. 900nm. O ATP induzida [Ca ^{2 +] _{i aumento foi significativamente inibido em 65% ou 55% de macrófagos por 100 � ou 10 � nicotina, respectivamente. Este efeito inibidor foi revertida pela nAChR β2 preferindo antagonista hidro-β-eryhtroidine mas não por hexametónio (nAChR-antagonista não selectivo), mecamilamina (α3β4 nAChR-preferindo antagonista), α-bungarotoxina ou methyllycaconitine (α7 antagonista tanto-preferindo nAChR ). Macrófagos no estômago expressar β2 mas não α7 nAChR a nível da proteína, enquanto aqueles no intestino expressar ambas as subunidades dos receptores.}}

Conclusão

Este estudo é o primeiro em
situ
demonstração de uma inibição da activação de macrófagos por nicotina sugerindo sinalização funcional entre neurónios colinérgicos e macrófagos no estômago. Os dados sugerem que a subunidade β2 do nAChR é criticamente envolvidos na inibição induzida por nicotina destes macrófagos residentes

citação:. Nemethova A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nicotine atenua a activação do tecido residentes macrófagos no estômago do rato através da β2 receptor de acetilcolina nicotínica. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10.1371 /journal.pone.0079264

editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de junho de 2013; Aceito: 26 de setembro de 2013; Publicação: 01 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nemethova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do 7º Programa Quadro da União Europeia (ipodd), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 para MS; por uma bolsa da Fundação de Pesquisa Flanders (FWO, Odisseu e programa de Hercules) para GEB, e por um FWO bolsa de pesquisa de pós-doutorado para PJG. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em 2000, Tracey e colaboradores demonstraram que a estimulação elétrica do nervo vago fornece uma entrada anti-inflamatório potente para o baço. Num modelo de rato de sépsis, a estimulação do nervo vagai (VNS) resultou numa diminuição da produção de citocina pró-inflamatória, um efeito dependente de receptores nicotinicos de acetilcolina (a7 nAChR) [1,2]. Este assim chamado "via anti-inflamatória colinérgica" (CAIP) opera através de nervos esplénicos adrenérgicos fazendo contatos sinápticos-like com as células T esplénicas que expressam receptores adrenérgicos p2. posterior liberação de acetilcolina (ACh) a partir destas células-T é responsável pelo efeito anti-inflamatório, presumivelmente através da interação com macrófagos α7nAChR expressando [1,2].

Em 2005, fornecemos evidências de que o CAIP também modula o sistema imune do intestino. Num modelo de rato de íleo pós-operatório, que mostrou que VNS reduziu a inflamação induzida por manipulação intestinal do intestino delgado, uma dependente de α7 nAChR mas independente do baço [3,4] efeito benéfico. Estes dados sugerem que o sistema imunitário do intestino é sim directamente modulados por terminações nervosas vagais e /ou neurónios entéricos. Como macrófagos intestinais residentes são os principais jogadores desencadeantes desta resposta inflamatória [5], estas células representam o alvo mais provável do CAIP. Estudos in vitro utilizando isolados macrófagos peritoneais, macrófagos derivados de células mononucleares do sangue periférico ou linhas celulares de macrófagos, de facto, abundantemente demonstrado que a acetilcolina nicotina e reduzir a produção de citocinas [1-3,6,7] e aumentar a fagocitose [6]. Não obstante, permanece questionável saber em que medida o seu fenótipo realmente se assemelha ao dos macrófagos residentes afectados pelos neurónios entéricos, especialmente quanto a expressão do receptor de macrófagos pode ser para cima ou para baixo-regulado, como têm sido isolados do seu ambiente natural. Portanto, decidimos desenvolver uma técnica que nos permite estudar o efeito da nicotina sobre a ativação de macrófagos residentes no seu ambiente natural. Como macrófagos ativados por ATP, um sinal de perigo bem conhecido por células do sistema imunológico [8,9], revelam um aumento de Ca intracelular ^{2 +, ao vivo Ca 2 + imagem foi escolhida para estudar os macrófagos residentes em plana intacta folha preparações estômago do rato. Isto permitiu-nos comparar ATP evocado Ca 2 + transientes ([Ca 2 +] _{i) em macrófagos localizados nas camadas musculares lisas antes e depois da aplicação da nicotina. Nós ainda usados ​​vários antagonistas com preferências conhecidos para subunidades específicas nAChR, a fim de facilitar uma melhor compreensão mecanicista para os papéis de receptor de nicotina expressando macrófagos para o CAIP no intestino. Estas descobertas farmacológicas foram confirmados por imuno-histoquímica. Por fim, analisamos a proporção de macrófagos residentes que estão em estreita proximidade das fibras nervosas colinérgicos.}}

Métodos

Declaração de Ética

Todo o trabalho do rato foi realizado de acordo com as directrizes alemãs para o cuidado e bem-estar (Deutsches Tierschutzgesetz) e aprovado pela comissão de ética do estado da Baviera (Regierung Oberbayern, que serve como Comitê cuidado e Uso Institucional para o Technische Universität München) animal de acordo com §4 e §11 Deutsches Tierschutzgesetz sob o número de referência 32 -568-2.

As amostras de tecido

Homem 12-16 semanas de idade camundongos C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Alemanha) foram mortos por deslocamento cervical. O estômago foi colhido em tampão de Krebs gelada contendo (em mM) 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2 PO? 4, 25 NaHCO 3, CaCl 2,5 2 2 H 2O e 11 de glucose e ajustada a pH 7,4. O estômago foi aberto ao longo da curvatura maior e lavados com solução de Krebs arrefecido com gelo. Sob inspecção microscópica, o estômago foi fixado para baixo sobre um prato Sylgard e da mucosa e submucosa foram cuidadosamente removidos. Durante a dissecção, o tecido foi continuamente perfundidos com solução de Krebs arrefecido com gelo para assegurar a viabilidade do tecido. Apenas o anterior ou posterior a metade do estômago estava preso em um pequeno anel Sylgard com uma abertura central de 100 x 200 mm ^2.}

Imagem de cálcio

preparações estômago folha de rato planas foram incubadas em solução de Krebs modificada (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2 PO? 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2O e 11 de glucose) contendo 30 uM do indicador de cálcio fluorescente Fluo 4-acetoximetil (AM) (Invitrogen) e probenecida 1,25 mM (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha) durante 2 h à temperatura ambiente no escuro e gaseados com carbogênio (95% O 2 - 5% CO 2). O anel de Sylgard foi montado na câmara de registo com o lado da serosa do estômago de frente para a parte inferior da câmara. A câmara foi ligada ao sistema de perfusão para permitir perfusão contínua com solução de Krebs gaseificada-carbogénio à temperatura ambiente. Um período de lavagem de 1,5 h foi deixada antes do início da experiência. A câmara de tecido foi montado em um microscópio de epifluorescência invertida (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Alemanha) equipado com uma câmera de alta velocidade monocromática (Zeiss AxioCam HSM) e software (Zeiss Axio Visão 4.8) para aquisição e análise. Fluo-4 foi animado usando uma luz azul emitting diode (LED) Luxeon III (3W, 470nm comprimento de onda dominante, Philips lumiled, Phillips, hambur, Alemanha) e fluo-4 sinais foram detectados com um cubo de filtro F26-514 brilhante Linha FITC BP (excitação: HC475 /35, dicróica: 499, emissão: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Alemanha), utilizando objetivo X20 (A-Plan, NA = 0,25, Zeiss). O sistema de medição mudanças relativas de fluorescência (Δ F /F) de Fluo-4 acompanhamento da evolução de cálcio intracelular ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + transientes foram registrados a partir de 3 s antes da administração local do ATP para um total de 14,5 s com uma taxa de quadros de 2 Hz e tempo de exposição de 200 ms.}}

ATP utilizado como uma ferramenta para a activação de macrófagos, uma vez que é um sinal de perigo libertado localmente no local da inflamação [8,9], e uma vez que o ATP é conhecido por induzir a secreção de citoquinas a partir de macrófagos por meio de aumento da [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) e nicotina (Sigma-Aldrich) foram aplicadas localmente pela ejeção pressão de duas micropipetas com durações de 200 ms e 10 s, respectivamente. A posição das micropipetas assegurado que os volumes ejectados coberto regiões dos tecidos idênticos. As micropipetas foram preenchidos com ATP 1 mM e 100? M ou 10? M de nicotina dissolvida em solução de Krebs contendo probenecid 1,25 mM. De acordo com curvas de calibração previamente publicados, estima-se que qualquer substância aplicada por impulsos de pressão de ejecção será diluída por cerca de 01:10, uma vez que atinge o tecido [13].

A administração local de ATP e nicotina permitiu a medição das respostas em várias regiões (tipicamente 4-5) no mesmo tecido. A posição das regiões do tecido foi documentada utilizando o sistema de coordenadas mostrado na platina do microscópio móvel. O efeito da nicotina sobre o ATP induzida transientes de cálcio foram novamente estudados nas mesmas regiões após adição de vários antagonistas de nAChR. Após o registo das respostas, os macrófagos foram visualizadas por incubação vital do tecido com aloficocianina (APC) marcado com anti-rato de ratinho anti-F4 80 de anticorpo /(1: 250, eBioscience, Frankfurt, Alemanha) durante 1 h, à temperatura ambiente em escuro e gaseados com carbogênio. O tecido foi lavado durante 15 minutos. O estágio do microscópio foi reposicionada para encontrar as regiões onde gravados a partir. Imagens de macrófagos marcados foram adquiridos utilizando vermelho Z-LED P4 (3,5 W) fonte de excitação (625 nm comprimento de onda dominante, Seoul Semiconductor) e cubo de filtro F46-006 ET conjunto de filtros (excitação: 620/60 ET, dicróica: 660, emissão: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Alemanha). A sobreposição de Fluo-4 sinais e imagens de F4 /80 macrófagos positivos nos permitiu analisar as respostas em macrófagos individuais.

Imunohistoquímica

Para macrófagos residentes de tecido rótulo, foi utilizado pela primeira vez a rotulagem vital protocolo descrito acima. O tecido foi então fixados durante a noite à temperatura ambiente numa solução contendo 4% de formaldeído e 0,2% de ácido pícrico em tampão fosfato 0,1 M, lavou-se 3 x 10 minutos em tampão de fosfato e finalmente incubou-se durante 1 hora numa solução contendo 0,5% de Triton X- 100, 0,1% de NaN _{3, 4% de soro de cavalo dissolvido em PBS (todos de Sigma-Aldrich). Para etiquetar varicosidades colinérgico, o tecido foi incubado durante a noite em solução de bloqueio contendo o transportador de cabra anti-acetilcolina vesicular (VAChT; 1: 1000; Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha). Os tecidos foram lavados 3 x 10 min em PBS e incubou-se durante 1,5-2 h na solução de bloqueio contendo o anticorpo anti-cabra marcado com Cy3 (1: 500; Dianova, Hamburgo, Alemanha). Os tecidos foram lavados 3 x 10 minutos em PBS e montadas em substância anti-desvanecimento (20% de PBS /NaN 3, 80% de glicerol) em poli-L-lisina-revestidas lâminas e lamínulas para visualização.}

para etiquetar β2 nAChR em macrófagos residentes de tecido, preparações de montagem inteiros gástricas livre de mucosa de tipo selvagem e p2 do nAChR knock-out [14] Os ratos foram fixados durante 10 minutos em gelo-frio solução de PBS contendo 4% de paraformaldeído (PFA) . Os tecidos foram então lavadas 2 x 10 minutos em PBS e incubou-se durante 2 horas em PBS contendo 1% livre de protease de albumina bovina Fracção V de albumina (BSA; Serva, Heidelberg, Alemanha) e 10% de soro de burro normal (NDS; Jackson ImmunoResearch, Pensilvânia, EUA). Os tecidos foram incubados durante 36 h com PBS contendo 1% de BSA, 5% de NDS, de rato anti-F4 /80 (1: 500; clone BM8, BioLegend, San Diego, EUA) e de coelho anti-ratinho β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemanha). Os tecidos foram lavados 3 x 10 min em PBS e incubados durante 1 h em PBS contendo 1% de BSA, NDS, anticorpo anti-rato de cabra Alexa 5% Fluor® 647-marcado (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pensilvânia, EUA) e -Cy3 de burro marcado com anticorpo anti-coelho (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, EUA). Os tecidos foram lavados 3 x 10 minutos em PBS e montadas em reagente lenta de desbotamento (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Bélgica), em lâminas de poli-L-lisina-revestidas e para a etiqueta lamínulas viewing.To α7nAChR em macrófagos residentes de tecido, uma pedaço de estômago de rato e o íleo foram submetidos a rotulagem vital utilizando marcado com Cy5 α-bungarotoxina (Invitrogen) a 0,1 ug /ml em meio RPMI 1640 (Lonza, Basileia, Suíça), a 4 ° C durante 15 min [4]. Os tecidos foram então fixadas em PBS contendo 4% de PFA. A mucosa e submucosa foram removidos e os tecidos foram incubados durante 2 h numa solução contendo 1% de BSA de bloqueio. Os tecidos foram então incubadas durante 60 h em solução bloqueadora contendo de rato anti-F4 /80 (clone BM8, BioLegend), seguido por 3 x 10 min lavagens em PBS e incubados durante 1 h em PBS contendo 1% de BSA e Cy3 marcado anticorpo anti-rato (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pensilvânia, EUA). Finalmente, os tecidos foram lavados 3 x 10 minutos em PBS e montadas em substância lenta de desbotamento em lâminas de poli-L-lisina-revestidas e lamínulas para visualização.

A microscopia confocal e análise de imagem

As imagens foram adquiridas utilizando um LSM 510 (Carl Zeiss) microscópio confocal com Plan-Neofluar x40 /1,3 óleo DIC e Plano Apochromat x63 /1.4 objetivos Oil DIC. comprimentos de onda laser de 543 nm e 633 nm foram utilizados para a excitação dos fluoróforos Cy3 e Cy5 ou APC, respectivamente. sinais de Cy3 e APC ou Cy5 foram detectadas utilizando o filtro define BP 565-615 IR e BP 650-710 IR, respectivamente.

pilhas de imagem para a análise quantitativa usando o objetivo x63 foram digitalizadas com uma resolução de XY de 1024 × 1024, que cobriu uma área de 95,5 × 95,5 mm ^{2. Os primeiros e últimos fatias óptica foram tiradas na parte superior e na parte inferior da superfície exterior de um macrófago. A profundidade óptica de cada fatia foi de 900 nm. Duas fatias consecutivas sobrepostos para 500 nm. Normalmente, entre 9 e 16 fatias foram geradas, resultando em uma profundidade de digitalização de 3.2-6.0 mm contendo entre 1-3 macrófagos e VAChT fibras positivas macrófagos de passagem. pilhas de imagens foram analisadas usando o Image Pro J.}

Imagens de macrófagos marcados com nAChR b2 e a7 foram tomadas com o objetivo x63 e digitalizadas com uma resolução de XY de 1024 × 1024, que cobriu uma área de 95,5 × 95,5 mm ^{2. A profundidade óptica das imagens foi de 900 nm.}

Farmacologia

Para bloquear a acção de propagação nos neurónios potencial, tetrodotoxina (Biotrend, Colónia, Alemanha) foi adicionado à solução de Krebs perfusão em 1 uM. Para a caracterização farmacológica, os seguintes bloqueadores nicotínicos foram adicionados à solução de Krebs perfusão do tecido: 200 uM de hexametónio (Sigma-Aldrich), 100 uM de mecamilamina (Sigma-Aldrich), 10

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