PLOS ONE: La nicotina atenúa la activación de los macrófagos del tejido residente en el estómago del ratón a través de la β2 nicotínico de acetilcolina de los receptores

Extracto

Antecedentes

El antiinflamatorios vía colinérgica es un mecanismo endógeno mediante el cual el sistema nervioso autónomo atenúa la activación de los macrófagos a través de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR). Este concepto ha sido demostrado no obstante a nivel celular en el tejido intacto. Con este fin, se ha estudiado el efecto de la nicotina sobre la activación de los macrófagos residentes en una preparación estómago del ratón por medio de imágenes de calcio.

Métodos

transitorios de calcio ([Ca ^{2 +] _{i) en macrófagos residentes se registraron en un preparado que contiene el estómago del ratón del plexo mientérico y capas musculares por Fluo-4. La activación de los macrófagos se logró mediante la administración de hojaldre focal de ATP. Los efectos de la nicotina sobre la activación de los macrófagos fueron evaluados y el nAChR involucrados se caracterizó farmacológicamente. La proximidad de los nervios colinérgicos a macrófagos se cuantificó por microscopía confocal. La expresión de β2 y α7 nAChR se evaluó mediante inmunohistoquímica y β2 fluoróforo de etiquetado α-bungarotoxina}}

Resultados

En el 83% de los macrófagos se detectaron fibras nerviosas colinérgicas varicosas en las distancias. ≪ 900 nm. El ATP inducida [Ca ^{2 +] _{i aumento fue inhibido significativamente en el 65% o el 55% de los macrófagos por 100μM o la nicotina 10μM, respectivamente. Este efecto inhibidor se invirtió por el nAChR β2 prefiriendo antagonista dihidro-β-eryhtroidine pero no por hexametonio (no selectivo nAChR-antagonista), mecamilamina (α3β4 nAChR que prefieren el antagonista), α-bungarotoxina o metillicaconitina (tanto α7 antagonista de nAChR que prefieren ). Macrófagos en el estómago expresan β2 pero no α7 nAChR en el nivel de proteínas, mientras que en el intestino expresan ambas subunidades del receptor.}}

Conclusión

Este estudio es el primero en
situ
demostración de una inhibición de la activación de macrófagos por la nicotina que sugiere señalización funcional entre las neuronas colinérgicas y macrófagos en el estómago. Los datos sugieren que la subunidad β2 del nAChR es críticamente implicado en la inhibición inducida por la nicotina de estos macrófagos residentes

Visto:. Némethová A, Michel K, Gómez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) la nicotina atenúa la activación de los macrófagos residentes de tejido en el estómago del ratón a través de la acetilcolina nicotínico receptor β2. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10.1371 /journal.pone.0079264

Editor: Yvette Tache, Universidad de California, Los Angeles, Estados Unidos de América

Recibido: 10 Junio, 2013; Aceptado: September 26, 2013; Publicado: 1 Noviembre 2013

Derechos de Autor © 2013 Némethová et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del 7º Programa Marco de la Unión Europea (ipodd), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 a MS; por una beca de la Fundación de Investigación de Flandes (programa Hércules FWO, Odiseo y) a GEB, y por una beca de investigación postdoctoral FWO a PJG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

En 2000, Tracey y sus colaboradores demostraron que la estimulación eléctrica del nervio vago proporciona una entrada potente anti-inflamatorio en el bazo. En un modelo de ratón de la sepsis, la estimulación del nervio vago (VNS) produjo una disminución de la producción de citoquinas pro-inflamatorias, un efecto dependiente de los receptores nicotínicos de acetilcolina (a7 nAChR) [1,2]. Este llamado "antiinflamatorios vía colinérgica" (CAIP) opera a través de los nervios adrenérgicos esplénica haciendo los contactos sinápticos similares con células T beta 2 adrenérgicos que expresan el receptor del bazo. la posterior liberación de la acetilcolina (ACh) a partir de estas células T es responsable del efecto antiinflamatorio, presumiblemente, mediante la interacción con los macrófagos que expresan α7nAChR [1,2].

En el año 2005, nos proporcionan pruebas de que la CAIP también modula el sistema inmunitario intestinal. En un modelo de ratón de íleo postoperatorio, mostramos que VNS reduce la inflamación intestinal manipulación inducida del intestino delgado, un efecto beneficioso depende de α7 nAChR pero independiente del bazo [3,4]. Estos datos sugieren que el sistema inmunitario del intestino es más bien directamente modulada por las terminaciones nerviosas vagales y /o las neuronas entéricas. Como los macrófagos intestinales residentes son los principales agentes que desencadenan esta respuesta inflamatoria [5], estas células representan el blanco más probable de la CAIP. En estudios in vitro con macrófagos peritoneales aislados, los macrófagos derivados de células mononucleares de sangre periférica o líneas celulares de macrófagos han hecho abundantemente demostrado que la acetilcolina y la nicotina reduce la producción de citoquinas [1-3,6,7] y aumentan la fagocitosis [6]. Sin embargo, sigue siendo cuestionable en qué medida su fenotipo muy similar a la de los macrófagos residentes afectados por las neuronas entéricas, especialmente como la expresión del receptor en los macrófagos puede ser ascendente o regulados hacia abajo, ya que han sido aislados de su medio ambiente natural. Por lo tanto, hemos decidido desarrollar una técnica que nos permitirá estudiar el efecto de la nicotina sobre la activación de los macrófagos residentes en su ambiente natural. A medida que los macrófagos activados por ATP, señal de peligro bien conocido por las células inmunes [8,9], revelan un aumento en intracelulares de Ca ^{2 +, vivir Ca 2 + de imágenes fue elegida para estudiar los macrófagos residentes en plana intacta preparaciones de estómago ratón hoja. Esto nos permitió comparar ATP evocó Ca 2 + transitorios ([Ca 2 +] _{i) en los macrófagos ubicados en las capas de músculo liso antes y después de la aplicación de la nicotina. Además, utiliza varios antagonistas con las preferencias conocidas para subunidades de nAChR específicos con el fin de facilitar la comprensión mecanicista en las funciones de los macrófagos que expresan receptor de nicotina para la CAIP en el intestino. Estos hallazgos farmacológicos fueron confirmados por inmunohistoquímica. Por último, analizamos la proporción de macrófagos residentes que se encuentran en las proximidades de las fibras nerviosas colinérgicas.}}

Métodos

Declaración de Ética

Todo el trabajo del ratón se llevó a cabo de acuerdo con las directrices alemanas para el cuidado y bienestar animal (Deutsches Tierschutzgesetz) y aprobado por el comité de ética del estado de Baviera (Oberbayern Regierung, que sirve como el Comité de cuidado y uso Institucional de la Technische Universität München) de acuerdo con el § 4 y § 11 Deutsches Tierschutzgesetz bajo el número de referencia 32 -568-2.

Las muestras de tejido

Varón 12-16 semanas de edad C57BL /6 ratones (Charles River, Sulzfeld, Alemania) por dislocación cervical. El estómago se recogió en tampón Krebs fría con hielo que contenía (en mM) 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1.2 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2O y 11 de glucosa y ajustado a pH 7,4. El estómago se abrió a lo largo de la curvatura mayor y se lavó con helado de Krebs. Bajo inspección microscópica, el estómago se inmovilizó en un plato Sylgard y la mucosa y submucosa se retiraron cuidadosamente. Durante la disección, el tejido se perfundió continuamente con solución de Krebs enfriado con hielo para asegurar la viabilidad del tejido. Sólo la mitad anterior o posterior del estómago se haya depositado en un anillo de Sylgard pequeña con una abertura central de 100 x 200 mm ^2.}

El calcio de imágenes

Preparados estómago hoja de ratón eran planas incubados en solución de Krebs modificada (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1.2 NaH 2 PO 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 h 2O y 11 de glucosa) que contiene 30 mM del indicador de calcio fluorescente Fluo 4-acetoximetilo (AM) (Invitrogen) y probenecid 1,25 mM (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemania) durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad y gaseados con carbógeno (95% O 2 - 5% de CO 2). El anillo de Sylgard se monta en la cámara de registro con el lado serosal del estómago frente a la parte inferior de la cámara. La cámara se conecta al sistema de perfusión para permitir la perfusión continua con una solución de Krebs carbógeno desgasificado a temperatura ambiente. Se dejó un periodo de lavado de 1,5 h antes del inicio del experimento. La cámara de tejido se montó en un microscopio de epifluorescencia invertido (Zeiss Axio Observador A1, Carl Zeiss, Jena, Alemania) equipado con una cámara de alta velocidad monocromo (Zeiss AxioCam HSM) y software (Zeiss Axio Vision 4.8) para la adquisición y el análisis. Fluo-4 estaba excitado mediante una luz azul diodo emisor de luz (LED) Luxeon III (3W, longitud de onda dominante de 470 nm, Philips LUMILED, Phillips, HAMBUR, Alemania) fueron detectados y Fluo-4 señales con un filtro de cubo F26-514 brillante Línea FITC BP (excitación: HC475 /35, dicroica: 499, emisión: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Alemania) usando objetivo X20 (A-plan, NA = 0,25, Zeiss). El sistema medido los cambios relativos de fluorescencia (Δ F /F) de seguimiento de la evolución de Fluo-4 en el calcio intracelular ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + transitorios se registraron a partir de 3 s antes de la administración local de la ATP para un total de 14,5 s con una velocidad de 2 Hz y tiempo de exposición de 200 ms.}}

Se utilizó ATP como una herramienta para la activación de los macrófagos, ya que es una señal de peligro liberado localmente en el sitio de la inflamación [8,9] y desde ATP se sabe que inducen la secreción de citocinas de los macrófagos a través de aumento de [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) y la nicotina (Sigma-Aldrich) se aplicaron a nivel local por la presión de eyección de dos micropipetas con una duración de 200 ms y 10 seg, respectivamente. La posición de las micropipetas se aseguró de que los volúmenes eyectados cubiertos regiones de tejido idénticas. Las micropipetas se llenaron de ATP 1 mM y 100 mM o 10 mM de nicotina disuelta en solución de Krebs que contenía probenecid 1,25 mM. De acuerdo con las curvas de calibración previamente publicados, se estima que cualquier sustancia aplicada por pulsos de expulsión presión se diluyó en aproximadamente 1:10 una vez que alcanza el tejido [13].

La administración local de ATP y la nicotina permitido medición de las respuestas en múltiples regiones (típicamente 4-5) en el mismo tejido. La posición de las regiones en el tejido fue documentado usando el sistema de coordenadas mostrado en la platina del microscopio móvil. El efecto de la nicotina sobre ATP inducida transitorios de calcio se estudió de nuevo en las mismas regiones después de la adición de diversos antagonistas de nAChR. Después de grabar las respuestas, los macrófagos se visualizaron por incubación vital del tejido con aloficocianina (APC) Anti-F4 /80 anticuerpo -etiquetados rata anti-ratón (1: 250, eBioscience, Frankfurt, Alemania) durante 1 h, a temperatura ambiente en la oscuridad y gaseado con un carbógeno. El tejido se lavó durante 15 minutos. La platina del microscopio se reposicionó para encontrar las regiones en las que grabó desde. Imágenes de macrófagos marcadas fueron adquiridos utilizando roja Z-LED P4 (3,5 W) fuente de excitación (625 nm longitud de onda dominante, Seoul Semiconductor) y el filtro de cubo F46-006 conjunto de filtros ET (excitación: ET 620/60, dicroica: 660, emisión: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Alemania). La superposición de Fluo-4 señales e imágenes de F4 /80 macrófago positivo nos permitió analizar las respuestas individuales en los macrófagos.

La inmunohistoquímica

Para los macrófagos residentes blancos de papel tisú, se utilizó por primera vez el etiquetado de vital importancia protocolo descrito anteriormente. El tejido se fijó durante la noche a temperatura ambiente en una solución que contiene 4% de formaldehído y ácido pícrico al 0,2% en tampón fosfato 0,1 M, se lavó 3 x 10 minutos en tampón fosfato y finalmente se incubaron durante 1 h en una solución que contiene 0,5% de Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% de suero de caballo disuelto en PBS (todos de Sigma-Aldrich). Para etiquetar las varicosidades colinérgica, el tejido se incubó durante la noche en la solución de bloqueo que contiene cabra transportador de acetilcolina anti-vesicular (VAChT; 1: 1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania). Los tejidos se lavaron 3 X 10 min en PBS y se incubaron durante 1,5-2 h en la solución de bloqueo que contiene el anticuerpo anti-cabra marcado con Cy3 (1: 500; Dianova, Hamburgo, Alemania). Los tejidos se lavaron 3 x 10 minutos en PBS y se montaron en sustancia anti-fade (20% PBS /NaN 3, 80% de glicerol) en poli-L-lisina recubierto diapositivas y cubreobjetos para su visualización.}

para etiquetar β2 nAChR en macrófagos residentes tejidos, preparaciones todo el montaje gástricos libre de la mucosa de tipo salvaje y ß2 nAChR ronda [14] ratones se fijaron durante 10 minutos en una solución de hielo frío PBS que contenía 4% paraformaldehído (PFA) . A continuación, los tejidos se lavaron 2 X 10 min en PBS y se incubaron durante 2 h en PBS que contenía 1% de albúmina bovina fracción V de albúmina sin proteasa (BSA; Serva, Heidelberg, Alemania) y 10% de suero normal de burro (NDS; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, EE.UU.). Los tejidos se incubaron durante 36 h con PBS que contenía 1% de BSA, 5% NDS, rata anti-ratón de F4 /80 (1: 500; clon BM8, BioLegend, San Diego, EE.UU.) y de conejo anti-ratón β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania). Los tejidos se lavaron 3 X 10 min en PBS y se incubaron durante 1 h en PBS que contenía 1% de BSA, NDS, anticuerpo anti-rata de 5% de cabra Alexa Fluor® 647 marcada con (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, EE.UU.) y Cy3-anticuerpo marcado de burro anti-conejo (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, EE.UU.). Los tejidos se lavaron 3 x 10 minutos en PBS y se montaron en reactivo lento fundido (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Bélgica) en los portaobjetos de poli-L-lisina y se cubrieron para el sello viewing.To α7nAChR macrófagos residentes en el tejido, una pedazo de estómago de ratón e íleon fueron sometidos a etiquetado de vital importancia el uso de marcado con Cy5 α-bungarotoxina (Invitrogen) a 0.1 g /ml en medio RPMI 1640 (Lonza, Basilea, Suiza) a 4 ° C durante 15 min [4]. Los tejidos se fijaron en PBS que contenía 4% PFA. La mucosa y submucosa fueron retirados y los tejidos se incubaron durante 2 h en una solución que contiene 1% de BSA de bloqueo. Los tejidos se incubaron durante 60 h en solución de bloqueo que contiene de rata anti-ratón de F4 /80 (clon BM8, BioLegend), seguido de 3 X 10 min lavados en PBS y se incubaron durante 1 h en PBS que contenía 1% de BSA y Cy3 marcado con anticuerpo anti-rata (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, EE.UU.). Por último, los tejidos se lavaron 3 x 10 minutos en PBS y se montaron en sustancia lento fundido en portaobjetos de poli-L-lisina y coverslipped para su visualización.

La microscopía confocal y análisis de imágenes

Las imágenes fueron adquiridas mediante un LSM 510 (Carl Zeiss) microscopio confocal con el plan Neofluar-x40 /1.3 aceite de DIC y el plan Apocromático X63 /1,4 aceite objetivos DIC. longitudes de onda de láser de 543 nm y 633 nm se utilizaron para la excitación de los fluoróforos Cy3 y APC o Cy5, respectivamente. señales de Cy3 y Cy5 o APC se detectaron utilizando el filtro IR establece BP 565-615 y 650-710 BP IR, respectivamente.

Pilas de imágenes para el análisis cuantitativo con el objetivo x63 fueron escaneados con una resolución de 1024 × XY de 1024 que cubría una superficie de 95,5 × 95,5 m ^{2. La primera y última rebanadas ópticas fueron tomadas en la parte superior e inferior de la superficie exterior de un macrófago. La profundidad óptica de cada rebanada fue de 900 nm. Dos cortes consecutivos se superponen para 500 nm. Por lo general, se generaron entre 9 y 16 rebanadas dará una profundidad de exploración de 3.2-6.0 micras que contienen entre 1-3 macrófagos y VAChT fibras positivas macrófagos de cruce. pilas de imágenes se analizaron utilizando la imagen J Pro.}

Se tomaron imágenes de los macrófagos nAChR marcado con beta 2 y a7 usando el objetivo x63 y escaneadas con una resolución de 1024 × XY 1024 que cubría una superficie de 95,5 × 95,5 m ^{2. La profundidad óptica de las imágenes fue de 900 nm.}

Farmacología

Para bloquear la propagación del potencial de acción en las neuronas, se añadió tetrodotoxina (BIOTREND, Köln, Alemania) a la solución de Krebs perfusión de la 1 micra. Para la caracterización farmacológica, se añadieron los siguientes bloqueadores nicotínicos a la solución de Krebs perfusión del tejido: 200 hexametonio mu M (Sigma-Aldrich), 100 M mecamilamina (Sigma-Aldrich), 10 mM dihidro-β-eritroidina (DHBE; Sigma-Aldrich) , 100 nM, 3 M y 10 M α-bungarotoxina (ABGT; Tocris) y 10 nM y 100 nM metillicaconitina (MLA, Tocris). Hexametonium, mecamilamina y DHBE fueron probados en las concentraciones que fueron capaces de abolir los potenciales postsinápticos excitatorios rápidos nicotínicos en las neuronas de cobaya mientérico [15] .El uso de 10 nM y 100 nM MLA se basa en la concentración, respectivamente utiliza para bloquear la subunidad α7 nAChR que contiene [16] y se utiliza para inhibir la secreción de IL-6 a partir de macrófagos peritoneales aislados [3].

análisis de datos y estadísticas

Los cambios relativos máximos de fluorescencia (Δ F /F) en respuesta a la administración de ATP se expresó como% de aumento por encima de la fluorescencia basal antes de la administración de ATP. Los análisis estadísticos se realizaron con Sigma Plot 9.0 (Systat Software Inc, Erkrath, Alemania). Los datos se presentan como gráficos de bigotes con la mediana y el 25 ^{º y 75 º percentiles, así como la 10 º y 90 º percentiles. No se analizaron los datos apareados normalmente distribuidos por la prueba de Wilcoxon. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P Hotel < 0.05. N
números entre paréntesis indican el número de macrófagos /tejidos estudiados, es decir, un resultado basado en grabaciones de 20 macrófagos en 5 tejidos (equivalentes a 5 animales) se presenta como (20/5).}

resultados

relación espacial entre el tejido macrófagos residentes y varices colinérgicas en el estómago de ratón

Se utilizó la microscopía confocal para evaluar la proximidad entre los macrófagos /80-positive F4 y fibras nerviosas colinérgicas varicosas VAChT-positivos en el estómago de ratón (Figura 1A). El análisis detallado reveló que el 83% de los 41 estudiados macrófagos se encuentran dentro de 900 nm a al menos una fibra nerviosa colinérgica varicosa (Figura 1B-C).

reproducibilidad de ATP evocado [Ca ^{2 +] _{i señales en los macrófagos residentes del tejido}}

Microejection de ATP induce una fuerte inicio, rápido [Ca ^{2 +] _{i transitoria en los macrófagos que alcanzaron su punto máximo 8-10 segundos después de la aplicación seguido por un lento retorno a la línea de base [Ca 2 +] niveles I (Figura 2A y la película S1). Dado que no siempre fue la recuperación completa a los niveles de línea de base durante el período de registro, la máxima [Ca 2 +] i señal se utilizó para el análisis de todos los experimentos. No se observó taquifilaxia desde la amplitud máxima de [Ca 2 +] i señal en respuesta a una segunda administración de ATP, 10 minutos después de la primera, no difieren de la respuesta máxima inicial (Figura 2B).}}

efecto de la nicotina en la [Ca ^{2 +] _{i señales en los macrófagos residentes del tejido}}

Para estudiar el efecto de la nicotina sobre el ATP evocado [Ca ^{2 +] _{i señales que microejected nicotina durante 10 segundos e inmediatamente ATP volver a aplicar sobre la misma región. Una racional de usar nicotina como selectiva, no degradado agonista de nAChR era imitar la activación del receptor nicotínico de liberación de acetilcolina de las neuronas colinérgicas. El análisis de los cambios en la [Ca 2 +] i en todos los macrófagos reveló que la nicotina reduce significativamente el ATP evocado [Ca 2 +] i> 2 +] i transitorios reveló tres poblaciones de macrófagos (Figura 2D-G). La nicotina a los 10 y 100 mM atenuó el evocado-ATP [Ca 2 +] i señales en 55% y 65% ​​de macrófagos, respectivamente. La [Ca 2 +] i señal de se mantuvo sin cambios en el 36% y el 28% de los macrófagos después de la aplicación de 10 mM y 100 mM de nicotina, respectivamente. En un pequeño subconjunto, 10 mM y 100 mM de nicotina potenciaron la ATP-evocó [Ca 2 +] i respuesta (9% y 7% de los macrófagos, respectivamente).}}

Para evitar cualquier sesgo más análisis se basa en los efectos de la nicotina en todos los macrófagos independientes de si el ATP inducida [Ca ^{2 +] _{i señal fue disminuido, aumentado o sin cambios.}}

el papel de las neuronas en el nicotínico evocó atenuación de la activación de macrófagos

la nicotina activa directamente las neuronas entéricas y se dirigió a la posibilidad de que la activación de las neuronas de cerca por mientérico contribuyó a la atenuada [Ca ^{2 +] i> _{2 +] i señal mediante la nicotina permaneció en la presencia de tetrodotoxina (Figura 2C). Es digno de mención sin embargo, que la proporción de los macrófagos donde la nicotina no alteró ATP evocado [Ca 2 +] i señales se redujeron de manera espectacular (28% frente a 6%). Al mismo tiempo, los macrófagos en el que la nicotina inhibe o potenciada ATP evocados [Ca 2 +] i señales aumentaron de 65% a 71% y del 7% al 23%, respectivamente.}}

caracterización farmacológica del efecto inhibidor de la nicotina sobre los macrófagos residentes de tejido

la activación de macrófagos por ATP y la inhibición de la respuesta de ATP por 100 M de nicotina se registró de manera fiable en cada una de las 21 preparaciones ilustradas en la Figura 2F. Esto nos permitió realizar estudios de antagonistas sin la necesidad de volver a estudiar la respuesta inhibitoria en los macrófagos tratados con los antagonistas. Por otra parte, se reduce así el número de períodos de grabación a un nivel que no comprometía intensidad de la señal y las respuestas ATP reproducibles garantizados. Con el fin de estudiar los nAChR subunidades implicados en el efecto inhibidor de la nicotina, probamos cinco bloqueadores diferentes con las preferencias de subunidades conocidas [17] (Figura 3). El efecto inhibidor de la nicotina sobre evocados-ATP [Ca ^{2 +] _{i respuestas se mantuvo sin cambios en presencia de la ganglionar no selectivo nAChR hexametonio antagonista, los nAChR que prefieren antagonistas de nAChR que prefieren α3β4 mecamilamina antagonista o a7 α-bungarotoxina y metillicaconitina (Figura 3A). Sin embargo, la β2 nAChR que prefieren el antagonista de di-hidro-β-eryhtroidine revirtió el efecto inhibidor de la nicotina sobre evocado-ATP [Ca 2 +] i respuestas en los macrófagos (Figura 3B).}}

Aunque hemos utilizado ABGT a concentraciones que se han descrito para bloquear de forma fiable α7 nAChR en las neuronas y macrófagos alveolares aislados [18], que estaban preocupados de que puede ser capaz de antagonizar el efecto inhibidor de la nicotina debido a la competencia desfavorable en el sitio de unión. Sin embargo, esto parece poco probable ya que incluso a concentraciones de 3 M y 10 M ABGT no fue capaz de revertir el efecto inhibitorio de la nicotina sobre el ATP evocado [Ca ^{2 +] _{i respuestas (Figura 3A). También ABGT no invirtió la atenuación provocada por la nicotina 10 mM (Figura 3C).}}

Etiquetado de β2 pero no a7 nAChR en macrófagos residentes del tejido

Para proporcionar evidencia adicional para la participación de β2 pero no nAChR α7 de nAChR en el efecto inhibidor de la nicotina sobre evocado-ATP [Ca ^{2 +] se realizaron _{i respuestas, etiquetado inmunohistoquímica de ß2 nAChR y etiquetado vital de α7 nAChR por ABGT en macrófagos residentes de la muscular del estómago (Figura 4). La mayoría de los macrófagos residentes de la muscular del estómago se ß2 nAChR inmunorreactivas (Figura 4A) que soporta el efecto antagonista observada de DHBE en la inhibición de las respuestas nicotínico ATP. El anticuerpo utilizado para ß2 nAChR es específico debido a la ausencia de ß2 nAChR inmunoreactividad en un β2 nAChR ratón knockout (Figura 4B).}}

etiquetas vitales de α7 nAChR por ABGT reveló ausencia de α7 nAChR en los macrófagos residentes en el tejido el estómago de ratón (Figura 4C), en contraste, los macrófagos intestinales fueron etiquetados por ABGT (Figura 4D). La falta de α7 nAChR en macrófagos residentes del estómago muscular confirmó la ausencia de antagonismo de a7 bloqueadores de nAChR que prefieren el ABGT y MLA en el efecto inhibidor de la nicotina sobre el ATP evocado [Ca ^{2 +] _{i respuestas en estas células.}}

Discusión

Hasta la fecha, el efecto de la nicotina se ha investigado sólo en macrófagos aislados o líneas celulares de macrófagos. Aquí hemos desarrollado un in vitro
modelo de la preparación del plexo mientérico de músculo del estómago de ratón para estudiar el efecto de la nicotina sobre los macrófagos residentes tejido dentro de su ambiente natural. Por lo tanto, el presente estudio es el primero en demostrar que la nicotina inhibe directamente la activación de los macrófagos residentes tejido a través de la subunidad β2 contienen nAChR y por lo tanto proporciona la base para la señalización funcional entre las neuronas colinérgicas y macrófagos en el intestino. Nuestra conclusión es apoyada por varias líneas de evidencias. En primer lugar, ATP evocado [Ca ^{2 +] _{i transitorios en los macrófagos se reduce significativamente por la nicotina, incluso en presencia de la tetrodotoxina bloqueador de nervio. En segundo lugar, la atenuación inducida por la nicotina de las respuestas de ATP en los macrófagos fue revertida por DHBE, pero no por hexametonio, mecamilamina, ABGT o MLA. Los hallazgos farmacológicos fueron apoyados por la demostración de ß2-positiv pero ABGT-negativas subunidades de nAChR en macrófagos gástricos. En tercer lugar, la mayoría de los macrófagos estaban en proximidad directa de las fibras nerviosas colinérgicas varicosas. Se observó similares proximidad de los macrófagos a las fibras nerviosas en la capa muscular intestinal de rata [3].}}

Nuestro criterio utilizado para definir proximidad entre los macrófagos y las fibras nerviosas colinérgicas (900 nm a distancia) está de acuerdo con el concepto de comunicación extrasináptico . De acuerdo con este concepto una transmisión volumen basado difusión puede ocurrir en 100 nm a distancias micras entre la fuente y el objetivo [19]. Suponemos que la mayoría, si no todos, los nervios colinérgicos en las cercanías de los macrófagos se originó desde los cuerpos celulares neuronales mientérico en base a nuestra observación anterior de que las fibras vagales no se comunica con los macrófagos residentes intestinales [3], esto también es apoyado por los hallazgos que vagal gástrica fibras eferentes casi exclusivamente terminan en ganglios entéricos [20], donde activan la mayoría de las neuronas mientéricas a través de receptores nicotínicos [15].

El CAIP representa un sistema fisiológico para controlar la activación de macrófagos durante condiciones inflamatorias. El efecto antiinflamatorio de la activación CAIP ha demostrado in vivo fotos: por estimulación del nervio vago en modelos de ratón de la sepsis y el íleo postoperatorio [2,3] y in vitro fotos: por la administración de nicotina a aislados , macrófagos estimuladas lipopolisacárido [1-4,21]. En el presente estudio, encontramos que la nicotina reduce el aumento inducido por ATP intracelular de Ca ^{2 + en los macrófagos residentes en el estómago. Curiosamente, este efecto se invirtió por la β2 nAChR subunidad prefiriendo DHBE antagonista sugiere la participación de esta subunidad en la modulación de la nicotina mediada por los macrófagos residentes. Esta observación es consistente con nuestra anterior conclusión de que DHBE invierte la inhibición inducida por la nicotina de factor de necrosis tumoral-α liberación (TNF-α) y el aumento de la fagocitosis en macrófagos peritoneales aislados [6]. En consonancia, la producción de citoquinas de la línea celular de neuroblastoma humano transfectadas de forma estable con nAChR α4β2 se reduce significativamente por el tratamiento previo de la nicotina [22]. Aunque estos datos sugieren que α4β2 nAChR pueden mediar el efecto de la nicotina sobre el aumento inducido por ATP intracelular Ca 2 +, la evidencia reciente indica que las subunidades beta 2 también pueden montar con otras subunidades alfa, incluyendo subunidades a7. Una publicación reciente discusión de las propiedades electrofisiológicas de α7β2 nAChR expresa en líneas de células epiteliales humanas, mostró que bajas concentraciones de DHBE antagoniza α7β2 nAChR a7 nAChR pero no [16]. Estos y otros datos sobre el perfil farmacológico de DHBE sugerirían que DHBE es un antagonista altamente selectivo de los ß2 nAChR, pero no discrimina de manera fiable entre diversos conjuntos de α3, α4 o α7 con β2. Sin embargo, nuestra inmunohistoquímica y etiquetado vital de los macrófagos residentes gástricos no estarían a favor de la participación de α7 nAChR porque macrófagos gástricas no se marcaron mediante ABGT pero expresan la subunidad β2 nAChR.}

Sin embargo, se opta por una interpretación bastante conservadora de nuestros datos y llegar a la conclusión de que nAChR β2 están implicados críticamente en la inhibición de la actividad de los macrófagos de la nicotina, aunque es probable que a la concentración utilizada en nuestro estudio DHBE preferiblemente los bloques α4β2 nAChR. Nuestra preparación es ideal para hacer frente a futuros estudios en la posible contribución de α7β2 nAChR investigando el efecto de la nicotina en los macrófagos residentes tejido de α7 nAChR, ß2 y nAChR α7β2 nAChR doble knock-out ratones. Estrategias similares se deben utilizar para estudiar el significado de un α4β2 nAChR.

Es importante tener en cuenta que la acción antagonista de DHBE no es selectiva para los macrófagos como DHBE, como hexametonium y mecamilamina, también bloquea sinapsis nicotínicos en gástrica mientérico neuronas [15]. Sin embargo, los receptores nicotínicos en macrófagos deben poseer propiedades diferentes a las de las neuronas entéricas ya que ni hexametonio ni mecamilamina invierten la atenuación inducida por la nicotina de las respuestas evocadas por ATP en los macrófagos. Hexametonium y mecamilamina ejercen sus acciones por la obstrucción del poro del canal nicotínico [23-25]. Su incapacidad para invertir la inhibición de la nicotina de los macrófagos puede sugerir la existencia de un nAChR atípica en los macrófagos. De hecho, el registro de Ca ^{2 + transitorios en respuesta a la administración de nicotina reveló aumento de [Ca 2 +] _{i en sólo el 13% de los macrófagos (6 de cada 45 macrófagos; datos no mostrados). Esta población es mucho menor que la proporción de los macrófagos en el que la nicotina modula el ATP evocado [Ca 2 +] i.}}

Abundante evidencia sugiere que α7 nAChR desempeña un papel crucial en la reducción inducida por la nicotina en la producción de citocinas de los macrófagos [2,3,6,26]. Anteriormente, hemos hecho demostrado que la nicotina no logró reducir la producción de TNF-α en macrófagos peritoneales de ratones α7 nAChR knockout [6], mientras que el efecto anti-inflamatoria en el intestino delgado de la estimulación del nervio vago en nuestro modelo de íleo postoperatorio se pierde en estos ratones KO [4]. En el presente estudio, sin embargo, el efecto de la nicotina sobre la activación de macrófagos inducida por ATP no fue bloqueado por el nAChR α7 prefiriendo bloqueadores ABGT y MLA, argumentando en contra de la participación de nAChR a7. Esto se ve apoyado por la falta de etiquetado de los macrófagos del estómago muscular por α7 nAChR que prefieren α-bungarotoxina. En el intestino, sin embargo, sí se observó α-bungarotoxina macrófagos muscularis etiquetados positivos [4 y este estudio], lo que indica diferencias regionales específicos en el fenotipo de estas células inmunes.

A pesar de la aparente falta de ABGT sensible α7 nAChR en nuestro estudio parece contradictorio con nuestros resultados anteriores, que son bastante seguros de que estos datos no son debido a la incapacidad de ABGT para competir por el sitio de unión como la misma concentración utilizada en nuestros bloques de estudio α7 neuronal de nAChR en el cerebro y en

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