Ploche ONE: Nikotín zoslabuje aktiváciu tkanivové makrofágy Resident v žalúdku myšou cez P2 nikotínový receptor acetylcholínu

abstraktné

Pozadie

cholinergný protizápalové cesta je endogénne mechanizmus, ktorým autonómny nervový systém oslabuje aktiváciu makrofágov pomocou nikotínových acetylcholínových receptorov (nAChR). Táto koncepcia však nebola preukázaná na bunkovej úrovni v intaktné tkanive. Za týmto účelom sme študovali vplyv nikotínu na aktiváciu makrofágov rezidentmi v prípravku myši žalúdku pomocou zobrazovacích vápenatého.

metódami

prechodové vápenatého ([Ca ^{2 +] _{i) v rezidentných makrofágov boli zaznamenané v prípravku myší žalúdku obsahujúce myenteric plexus a svalovej vrstvy podľa Fluo-4. Aktivácia makrofágov bolo dosiahnuté podaním fokálna lístkového ATP. Účinky nikotínu na aktiváciu makrofágov boli vyhodnotené a nAChR podieľa sa farmakologicky charakterizovaný. Blízkosť cholinergných nervov na makrofágy bola kvantifikovaná pomocou konfokálna mikroskopie. Vyjadrenie P2 a a7 nAChR bola hodnotená P2 imunohistochémia a fluorofor značeného alfa-bungarotoxin}}

Výsledky

V 83% makrofágov boli zistené cholinergný kŕčové nervové vlákna vo vzdialenostiach. ≪ 900nm. ATP vyvolanú [Ca ^{2 +] _{aj zvýšiť bola významne inhibovaná v 65% alebo 55% makrofágov 100 uM alebo 10 uM nikotínu, resp. Tento inhibičný účinok bol obrátený p2 nAChR prednosť antagonistu dihydro-p-eryhtroidine ale nie hexamethonium (neselektívny nAChR-antagonistu), mekamylamínu (α3β4 nAChR-preferring antagonistu), α-bungarotoxin alebo methyllycaconitine (ako α7 nAChR-preferring antagonista ). Makrofágy v žalúdku expresné β2, ale nie α7 nAChR na úrovni proteínu, zatiaľ čo tie, ktoré v čreve vyjadriť obidva receptorovej podjednotky.}}

Záver

Táto štúdia je prvá v
situ
demonštrácie inhibícia aktivácie makrofágov nikotínom naznačuje funkčné signalizáciu medzi cholínergných neurónov a makrofágy v žalúdku. Tieto údaje naznačujú, že β2 podjednotka nAChR je kriticky zapojený do inhibíciu nikotínu indukovanej týchto rezidentných makrofágov

Citácia :. Némethová A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nikotín zoslabuje aktivácii tkanivových rezidentné makrofágy v žalúdku myšou cez β2 nikotínový receptor acetylcholínu. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10,1371 /journal.pone.0079264

Editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, United States of America

prijatá: 10. júna 2013; Prijaté: 26.septembra 2013; Uverejnené: 01.11.2013

Copyright: © 2013 Némethová et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený grantom z 7. rámcového programu Európskej únie (IPODD), Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 MS; grantom Research Foundation Flámsko (FWO, Odysseus a programu Hercules) do GEB, a pomocou FWO postgraduálne študijný pobyt do PJG. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

V roku 2000, Tracey a spolupracovníci preukázali, že elektrická stimulácia nervu vagus poskytuje silný protizápalový vstup do sleziny. V myšiam modeli sepsa, predominanciou nervovej stimulácie (VNS) viedlo k zníženiu prozápalový produkciu cytokínov, čo je v závislosti na a7 nikotínových acetylcholínových receptorov (nAChR), [1,2] účinok. Tento takzvaný "cholinergný protizápalové dráhy" (Caipi) pôsobí prostredníctvom adrenergných sleziny nervy tvoriacich synaptických podobné kontakty s p2 adrenergné receptor exprimujúce sleziny T-buniek. Následné uvoľňovanie acetylcholínu (ACh) z týchto T-buniek je zodpovedný za protizápalový účinok pravdepodobne prostredníctvom interakcie s α7nAChR exprimujúcich makrofágov [1,2].

V roku 2005 sme poskytli dôkaz, že tiež Caipi upravuje črevnú imunitný systém. V myšiam modeli pooperačný ileus, sme ukázali, že VNS znižuje črevnú manipulácia vyvolané zápalom tenkého čreva, v závislosti na a7 nAChR, ale nezávislý na sleziny [3,4] priaznivý účinok. Tieto údaje naznačujú, že črevný imunitný systém je skôr priamo moduluje vagu nervových zakončení a /alebo črevných neurónov. Ako rezidentný črevnej makrofágy sú hlavnými hráčmi spúšťajúci túto zápalovú reakciu [5], tieto bunky predstavujú najpravdepodobnejší Cieľ Caipi. Štúdia in vitro za použitia izolovaných peritoneálnych makrofágov, periférne krvné mononukleárny bunky odvodené makrofágy alebo makrofágové bunkové línie skutočne hojne preukázané, že nikotín acetylcholínu a znižuje produkciu cytokínov [1-3,6,7] a zvyšovať fagocytózu [6]. Avšak zostáva otázkou, do akej miery sa ich fenotyp naozaj podobá makrofágov rezidentov postihnutých črevných neurónov, najmä v expresiu receptora v makrofágoch môže byť up- alebo down-regulované tak, ako boli izolované z ich prirodzeného prostredia. Preto sme sa rozhodli vyvinúť techniku, ktorá by nám umožnilo študovať vplyv nikotínu na aktiváciu makrofágov bydlisko v ich prirodzenom prostredí. Ako makrofágy aktivuje ATP, známeho nebezpečenstvo signál pre imunitnými bunkami [8,9], odhaľujú nárast intracelulárneho Ca ^{2+, žiť Ca 2+ imaging bol vybraný na štúdium makrofágy bydliskom v neporušenej plochej plechové myš žalúdočné prípravky. To nám umožnilo porovnať ATP evokované Ca 2+ prechodné javy ([Ca 2 +] _{i) v makrofágov nachádzajúcich sa v hladkých vrstvách svalstva pred a po aplikácii nikotínu. Ďalej sme používali niekoľko antagonistov so známymi preferencie pre špecifické nAChR podjednotiek s cieľom poskytnúť ďalšie Mechanistické vhľad do úlohy nikotínové receptory vyjadrujúcich makrofágy pre Caipi v črevách. Tieto farmakologické nálezy boli potvrdené pomocou imunohistochémia. Nakoniec sme analyzovali podiel makrofágov rezidentmi, ktoré sú v tesnej blízkosti cholinergných nervových vlákien.}}

metódami

Ethics Prehlásenie

Všetky myši práca bola vykonaná podľa nemeckých smerníc pre starostlivosť o zvieratá a pohodu (Deutsches Tierschutzgesetz) a schválená bavorskej štátnej etickou komisiou (Regierung Oberbayern, ktorý slúži ako používanie a ošetrovanie výboru pre ústavné pre Technische Universität München) v súlade s § 4 a §11 Nemeckého Tierschutzgesetz pod referenčným číslom 32 -568-2.

Tkanivové vzorky

Male 12-16 týždňov C57BL /6 myší (Charles River, Sulzfeld, Nemecko) bola zabitá cervikálny dislokáciou. Žalúdok bol izolovaný v ľadovo chladnom Krebsovho pufra, ktorý obsahuje (v mM) 117 Náci, 4,7 KCI, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2Po 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2O a 11 glukóza a pH sa upraví na 7,4. Žalúdok bol otvorený pozdĺž veľkého zakrivenia a premyje sa ľadovo chladným Krebs. Pri mikroskopickej kontrole, žalúdok bol pritlačený dole na Sylgard misky a sliznice a podslizničnom tkanive boli opatrne odstránené. Pri pitve sa tkanivo bolo kontinuálne premývané ľadovo chladnému roztoku Krebsovho na zabezpečenie životaschopnosti tkaniva. Iba bol pritlačený prednej alebo zadnej polovice žalúdka na malom Sylgard prstenca so stredovým otvorom 100 x 200 mm ^2.}

zobrazovacie vápenatý

plochých myšou žalúdočné prípravky boli inkubuje v modifikovanom Krebsovom roztoku (117 NaCl, 4,7 KCI, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 NaH 2Po 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2O a 11 glukóza) obsahujúci 30 uM fluorescenčného indikátora vápnik Fluo 4-acetoxymethyl (AM) (Invitrogen) a 1,25 mM probenecidu (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Nemecko) počas 2 hodín pri teplote miestnosti v tme a sýti karbogenem (95% O 2 - 5% CO 2). SYLGARD krúžok bol namontovaný v záznamovej komore s serózna strany brucha smerom na dno komory. Komora bola pripojená k perfúznej systém na to, aby kontinuálne perfúziu s karbogenem odplyňuje roztoku sa pri teplote miestnosti Krebs. Vymývanie dobu 1,5 hodiny sa nechá pred začiatkom pokusu. Tkanivo komora bola namontovaná na obrátenej vhodným pre epifluorescenčné mikroskopom (Zeiss Axiom Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Nemecko) opatreného vysokorýchlostným čiernobiela kamera (Zeiss AxioCam HSM) a softvéru (Zeiss axióma Vision 4.8) pre zber a analýzu. Fluo-4 bol nadšený pomocou modrého dióda emitujúca svetlo (LED) Luxeon III (3W, 470nm dominantné vlnovú dĺžku, Philips LumiLed Phillips, Hambur, Nemecko) a Fluo-4 signály boli detekované s filtrom kockou F26-514 Jasné línie FITC BP (excitácia: HC475 /35, dvojfarebný: 499, emisie: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Nemecko) za použitia X20 cieľ (A-plán, nA = 0,25 Zeiss). Systému meraného relatívnej zmeny fluorescencie (Δ F /F) Fluo-4 sledovanie zmien intracelulárneho vápnika ([Ca ^{2 +] i). Ca 2+ boli zaznamenané prechodové počnúc 3 S pred miestnej správy ATP v celkovej výške 14,5 sa s obnovovacou frekvenciou 2 Hz a expozičným čase 200 ms.}}

Použili sme ATP ako nástroj pre aktiváciu makrofágov, pretože je nebezpečenstvo uvoľnenia signál lokálne v mieste zápalu [8,9], a pretože ATP je známe, že indukuje sekréciu cytokínov z makrofágov prostredníctvom zvýšenia [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) a nikotín (Sigma-Aldrich) boli aplikované lokálne vytlačením tlaku z dvoch mikropipety s trvaním po 200 ms a 10 sec, resp. Postavenie mikropipety zaistené, že vysunutý objemy pokryté identických oblastí tkaniva. Mikropipety boli naplnené 1 mM ATP a 100 uM alebo 10 uM nikotínu rozpusteného v Krebsovom roztoku obsahujúcom 1,25 mM probenecid. Podľa skôr publikovaných kalibračných kriviek, predpokladáme, že každá látka aplikuje tlak vystreľovacie impulzy sa riedi približne 1:10, akonáhle sa dostane do tkaniva [13].

Miestne podávanie ATP a nikotínu nechá meranie odpovedí na viac oblastí (typicky 4-5) v rovnakej tkanive. Postavenie krajov v tkanive bol dokumentovaný pomocou systém súradníc zobrazený na mobilnom mikroskopu fázu. Vplyv nikotínu na ATP indukované prechodových vápnika boli opäť študované v rovnakých oblastiach po pridaní rôznych nAChR antagonistov. Po zaznamenaní odozvy, makrofágy boli vizualizované vitálne inkubáciou tkaniva s allofykocyanin (APC) značené potkania anti-myšou anti-F4 /80 protilátky (1: 250, eBioscience, Frankfurt nad Mohanom, Nemecko) po dobu 1 hodiny, pri teplote miestnosti tmy a sýti karbogenem. Tkanivo sa premýva počas 15 minút. Javisko mikroskop bol premiestnený nájsť oblasti, kde sme zaznamenali vyberať. Snímky značených makrofágy boli získané pomocou červenej LED Z-P4 (3,5 W) budiace zdroj (625 nm dominantná vlnová dĺžka, Seoul Semiconductor) a filtračné kocka F46-006 ET sada filtrov (excitácia: ET 620/60, dvojfarebný: 660, emisie: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Nemecko). Prekrytie Fluo-4 signály a obrazy F4 /80 pozitívna makrofágy nám umožnila analyzovať odpovede v jednotlivých makrofágy.

Imunohistochémia

Ak chcete makrofágov rezidentmi štítok tkanív, sme prvýkrát použili zásadné označovanie protokol je popísané vyššie. Tkanivo potom bola stanovená cez noc pri teplote miestnosti v roztoku obsahujúcom 4% formaldehydu a 0,2% kyseliny pikrová v 0,1 M fosfátovom pufri, premyje 3 x 10 minút vo fosfátovom pufri a nakoniec inkubované po dobu 1 hodiny v roztoku, ktorý obsahuje 0,5% Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% konského séra rozpustený v PBS (všetko od Sigma-Aldrich). Pre označenie cholinergické varixy, tkanivo sa vyliahli cez noc v blokovacím roztoku, obsahujúceho kozí anti-vezikulárnej acetylcholínu transportér (Vachta; 1: 1000, Merck, Millipore, Darmstadt, Nemecko). Tkanivá boli premyté 3 x 10 min v PBS a inkubované po dobu 1,5 - 2 hodiny v blokovacím roztoku, ktorý obsahuje Cy3-značenú kozej anti-protilátky (1: 500; Dianová, Hamburg, Nemecko). Tkanivá boli premyté 3 x 10 minút v PBS a montujú v anti-fade látky (20% PBS /NaN 3, 80% glycerínu) na poly-L-lyzínom potiahnutá sklíčka a posunie s prekrytím pre prezeranie.}

pre označenie p2 nAChR v makrofágoch tkaniva rezidentmi, sliznicami bez žalúdočné celých prípravkov prípojné z divokého typu a p2 nAChR knock-out [14] myši boli fixované po dobu 10 minút v ľadovej chladnému roztoku PBS obsahujúcom 4% paraformaldehydu (PFA) , Tkanivá potom boli premyté 2 x 10 min v PBS a inkubované po dobu 2 hodín v PBS s obsahom 1% proteázy bez albumínu hovädzieho frakcie V albumín (BSA; Serva, Heidelberg, Nemecko) a 10% normálnej somárov sérum (NDS; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Tkanivá boli inkubované po dobu 36 hodín s PBS obsahujúcom 1% BSA, 5% NDS, potkania anti-myší F4 /80 (1: 500, klon BM8, BioLegend, San Diego, USA) a králičie anti-myšou β2 nAChR (1: 200, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Nemecko). Tkanivá boli premyté 3 x 10 min v PBS a inkubované po dobu 1 hodiny v PBS obsahujúcom 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor® 647-značený kozí anti-potkania protilátky (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA) a Cy3 značené oslie anti-králičie protilátkou (1: 1000, Chemicon, Millipore, Billerica, USA). Tkanivá boli premyté 3 x 10 minút v PBS a montujú v pomaly fade činidla (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Belgicko) na poly-L-lyzínom potiahnutá sklíčka a posunie s prekrytím pre viewing.To štítkov α7nAChR v makrofágoch tkaniva rezidentmi, je kus myšieho žalúdka a ileum boli podrobené zásadné označovanie s použitím Cy5 značeného a-bungarotoxin (Invitrogen) pri 0,1 ug /ml v médiu RPMI 1640 (Lonza, Bazilej, Švajčiarsko) pri teplote 4 ° C počas 15 minút [4]. Tkanivá potom boli fixované v PBS obsahujúcom 4% PFA. Sliznice a podslizničnom tkanive boli odstránené a boli tkanivá inkubované po dobu 2 hodín v blokovacej roztok, obsahujúci 1% BSA. Tkanivá potom boli inkubované po dobu 60 hodín v blokovacím roztoku, ktorý obsahuje potkania anti-myší F4 /80 (klon BM8, BioLegend), nasledovaný 3 X 10 min premytí v PBS a inkubované po dobu 1 hodiny v PBS obsahujúcom 1% BSA a Cy3 značená anti-potkania protilátkou (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Nakoniec boli tkanivá premyté 3 x 10 minút v PBS a namontovaný v pomaly fade látky na poly-L-lyzínom potiahnutá sklíčka a posunie s prekrytím pre prezeranie.

konfokálna mikroskopia a analýza obrazu

snímky boli získané pomocou LSM 510 (Carl Zeiss) konfokálního mikroskopu s Plan-Neofluar x40 /1,3 Oil DIC a plánovať Apochromát X63 /1.4 Oil DIC cieľov. Laserové vlnovej dĺžky 543 nm a 633 nm boli použité pre excitáciu fluorofor Cy3 a Cy5 alebo APC, v danom poradí. Cy3 a APC alebo Cy5 signály boli detekované s použitím filtra nastavuje BP 565-615 IR a BP 650-710 IR, resp.

Grafické zásobníky pre kvantitatívnu analýzu pomocou ciele X63 boli skenované s rozlíšením XY 1024 × 1024, ktorá pokrývala plochu 95,5 x 95,5 um ^{2. Prvý a posledný optické rezy boli odobraté v hornej a dolnej časti vonkajšieho povrchu makrofágov. Optická hĺbka každého valčeka bola 900 nm. Dva po sebe nasledujúce plátky prekrývali na 500 nm. Obvykle boli vytvorené medzi 9 a 16 plátky čo má za následok snímanie hĺbky 3.2-6.0 um obsahujúcich medzi 1-3 makrofágy a Vachta pozitívnych vlákien prechodoch makrofágy. Obrázok komíny boli analyzované pomocou Image J Pro.}

snímky s témou p2 a a7 nAChR značené makrofágy boli nasnímané pomocou ciele X63 a skenované s rozlíšením XY 1024 × 1024, ktorá pokrývala rozlohu 95,5 x 95,5 um ^{2. Optická hĺbka obrazov bola 900 nm.}

Pharmacology

Ak chcete zablokovať propagáciu akčného potenciálu v neurónoch, tetrodotoxin (Biotrend, Kolín, Nemecko) bol pridaný k roztoku perfúzie pri 1 uM Krebs. Farmakologické charakterizáciu nasledujúce nikotínovej blokátory boli pridané do roztoku Krebsovho perfúzie tkaniva: 200 uM hexamethonium (Sigma-Aldrich), 100 uM mekamylamínu (Sigma-Aldrich), 10 uM dihydro-β-erythroidine (DHBE, Sigma-Aldrich) , 100 nM, 3 uM a 10 uM α-bungarotoxin (ABGT; Tocris) a 10 nM a 100 nM methyllycaconitine (MLA, Tocris). Hexamethonium, mekamylamínu a DHBE boli testované v koncentráciách, ktoré boli schopné zrušiť nikotínové rýchle excitačné postsynaptické potenciály v morčaťa myenteric neurónov [15] .v použitie 10 nM a 100 nM MLA je založený na koncentrácii, resp používa na blokovanie a7 nAChR obsahujúce podjednotku [16] a použité na inhibíciu IL-6 sekrécie z izolovaných peritoneálnych makrofágov [3].

analýza dát a štatistika

maximálnej relatívnej zmeny fluorescencie (Δ F /F) v reakcii na správa ATP bola vyjadrená ako% zvýšenie nad bazálnej fluorescencie pred podaním ATP. Štatistické analýzy boli vykonané s Sigma Plot 9.0 (System Software lipne, Erkrath, Nemecko). Dáta sú prezentované ako smerodajnú plôch s medián a 25 ^{th a 75 th percentilov, ako aj 10 th a 90 percentil. Nie normálne distribuované párové dáta bola analyzovaná Wilcoxonův párový test. Rozdiely boli považované za štatisticky významné pri P Hotel < 0.05. n
Čísla uvedené v zátvorkách označujú čísla makrofágov /tkanív študoval, teda výsledok na základe nahrávok 20 makrofágov v 5 tkanivách (rovnajúcej sa 5 zvierat) je prezentovaná ako (20/5).}

Výsledky

Spatial vzťah medzi makrofágov tkanivo rezidentmi a cholinergných varixy u myší žalúdka

Použili sme konfokálna mikroskopia pre posúdenie blízkosť medzi F4 /80-pozitívnych makrofágov a Vachta pozitívnych kŕčových cholínergných nervových vlákien v myšiam žalúdku (obrázok 1A). Podrobná analýza ukázala, že 83% z 41 študovaných makrofágy sa nachádzajú v 900 nm na aspoň jeden kŕčových cholínergných nervových vlákien (obrázok 1B-C).

Reprodukovateľnosť ATP vyvolané [Ca 2 +] aj signály v tkanive rezidentných makrofágov

Microejection ATP vyvolanú silný, rýchly nástup [Ca ^{2 +] _{aj prechodné makrofágov, ktoré dosiahla svoj vrchol 8-10 sekúnd po aplikácii nasledoval pomalým návratom k východiskovému stavu [Ca 2 +] aj úrovne (obr 2A a film S1). Vzhľadom na to, že nebola vždy úplné zotavenie k normálu počas doby záznamu, maximálne [Ca 2 +] aj signál bol použitý pre analýzu všetkých pokusov. Žiadna tachyfylaxia bolo pozorované, pretože maximálna amplitúdy [Ca 2 +] aj signál v odozve na druhú dávku ATP, 10 minút po prvej, sa nelíši od pôvodného maximálnej odozvy (obrázok 2b).}}

vplyv nikotínu na [Ca ^{2 +] _{Aj signály tkaniva rezidentný makrofágy}}

na štúdium účinku nikotínu na ATP vyvolané [Ca ^{2+] _{aj signály sme microejected nikotínu po dobu 10 sekúnd a okamžite znovu použitá ATP na rovnakej oblasti. Jeden racionálne použitie nikotínu ako selektívne, non-degradované nAChR agonisty bolo napodobniť aktivácia receptoru nikotínovej uvoľňovaním acetylcholínu z cholinergných neurónov. Analyzuje zmeny v [Ca 2 +] aj vo všetkých makrofágov bolo zistené, že nikotín výrazne znížená vyvolal ATP [Ca 2 +] I signály (obr 2D a F). Podrobnejšia analýza účinkov nikotínu na ATP vyvolanú [Ca 2 +] Aj prechodové odhalila troch populácií makrofágov (obrázok 2D-G). Nikotín pri 10 a 100 uM ATP tlmí vyvolané [Ca 2 +] aj signály v 55% a 65% z makrofágov, resp. Funkcia [Ca 2 +] aj signál, zostala bez zmeny u 36% a 28% makrofágov po aplikácii 10 uM a 100 uM nikotínu, resp. V malej podskupine, 10 uM a 100 uM nikotínu zosilnený ATP vyvolané [Ca 2 +] aj odpoveď (9% a 7% makrofágov, v uvedenom poradí).}}

Aby sa predišlo akejkoľvek skreslenie ďalšia analýza je založená na nikotíne vo všetkých účinkov na makrofágy, nezávisle na tom, či vyvolané ATP [Ca ^{2 +] _{aj signál, sa znižuje, zvýšené alebo nezmenené.}}

Úloha neurónov v nikotínových vyvolalo útlm aktivácia makrofágov

Nikotín priamo aktivuje črevnú neuróny a my sa obrátil na možnosť, že aktivácia neďalekej myenteric neurónov prispelo k oslabenej [Ca ^{2 +] _{i odpovedí u makrofágov. Sme nenašli žiadny dôkaz takéhoto nepriame inhibičné dráhy s pretože útlm ATP-vyvolanej [Ca 2 +] aj signalizovať nikotínu zostal v prítomnosti tetrodotoxin (obrázok 2C). Je pozoruhodné, že aj keď je podiel týchto makrofágov, kde sa nikotín nemení ATP vyvolával [Ca 2 +] aj signály výrazne znížená (28% oproti 6%). V rovnakej dobe, makrofágy, v ktorom nikotín inhibujú alebo potenciované ATP vyvolal [Ca 2 +] aj signály sa zvýšil z 65% na 71% a zo 7% na 23%, v danom poradí.}}

farmakologická charakterizácia inhibičného účinku nikotínu na tkanivové makrofágy rezidentný

aktiváciu makrofágov ATP a inhibícia odozvy ATP o 100 uM nikotínu bola spoľahlivo v každom z 21 prípravkov je znázornené na obrázku 2F. To nám umožnilo vykonávať antagonistov štúdie bez nutnosti restudy inhibičné odpoveď v týchto makrofágov liečených antagonistami. Navyše sme tým znížili počet záznamových obdobia na úroveň, ktorá nebola ohrozená silu signálu a zaručené reprodukovateľné ATP odpovede. Aby bolo možné študovať nAChR-podjednotky zapojené v inhibičného účinku nikotínu, sme testovali päť rôznych blokátory sa známymi podjednotku preferencií [17] (obrázok 3). Inhibičný účinok nikotínu na ATP-vyvolaných [Ca ^{2 +] _{Aj reakcií sa nezmenil v prítomnosti neselektívny gangliových nAChR antagonistu hexamethonium, že α3β4 nAChR-preferujúcich antagonista mekamylamínu alebo a7 nAChR-preferujúcich antagonistov α-bungarotoxin a methyllycaconitine (obrázok 3A). Avšak, β2 nAChR-prednosť antagonista di-hydro-β-eryhtroidine obrátenej inhibičný účinok nikotínu na ATP-vyvolané [Ca 2 +] aj odpovede v makrofágoch (Obrázok 3B).}}

Aj keď sme použili ABGT v koncentráciách, ktoré boli popísané pre spoľahlivé blokovanie a7 nAChR v neurónoch a izolovanej alveolárnych makrofágov [18], boli sme obavy, že to môže byť schopný antagonizovať inhibičného účinku nikotínu v dôsledku nepriaznivého konkurencie na väzobné miesto. Avšak, toto sa zdá nepravdepodobné, pretože aj pri koncentrácii 3 uM a 10 uM ABGT nebol schopný zvrátiť inhibičného účinku nikotínu na ATP vyvolané [Ca ^{2 +] _{i odozvy (obrázok 3A). ABGT sa tiež nemôžu zvrátiť útlm vyvolaný 10 um nikotínu (obrázok 3C).}}

Značenie P2, ale nie a7 nAChR v tkanivovej rezidentných makrofágov

Na získanie dodatočné dôkazy o zapojení P2 nAChR, ale nie a7 nAChR v inhibičného účinku nikotínu na ATP-vyvolané [Ca ^{2 +] _{aj odozvy, imunohistochemické značenie nAChR p2 a vitálne označovanie a7 nAChR od ABGT v rezidentných makrofágov žalúdočných muscularis boli vykonané (pozri obrázok 4). Väčšina rezidentných makrofágov žalúdočných muscularis boli P2 nAChR-imunoreaktívnych (Obrázok 4A), ktorý podporuje pozorovaný antagonistický účinok DHBE na nikotínové inhibíciu odpovede ATP. Použité protilátky pre beta2 nAChR je špecifický tým, že absencia P2 nAChR imunoreaktivitu v P2 nAChR knockout myší (obrázok 4B).}}

Vital označovanie a7 nAChR u ABGT odhalila neprítomnosť a7 nAChR v makrofágoch tkaniva bydliska v myš žalúdka (obrázok 4C), na rozdiel od, črevné makrofágy boli značené ABGT (obrázok 4D). Nedostatok a7 nAChR v rezidentných makrofágov žalúdku muscularis potvrdila neprítomnosť antagonizmu voči a7 nAChR-prednosť blokátory ABGT a MLA na inhibičného účinku nikotínu na ATP vyvolané [Ca ^{2 +] _{Aj odpovede u týchto buniek.}}

Diskusia

K dnešnému dňu, účinok nikotínu bola skúmaná len v izolovaných makrofágoch alebo makrofágových bunkových línií. Tu sme vyvinuli in vitro
modelu myšieho žalúdka svalu myenteric prípravy plexu na štúdium vplyvu nikotínu na makrofágov tkanivo rezidentmi v ich prirodzenom prostredí. Táto štúdia je teda prvá, ktorá ukazuje, že nikotín priamo inhibuje aktiváciu makrofágov tkaniva rezidentných cez p2 podjednotky obsahujúce nAChR, a tým poskytuje základ pre funkčnú signalizáciu medzi cholínergných neurónov a makrofágy v čreve. Náš záver je podporovaný niekoľkých riadkov dôkazov. Po prvé, ATP evokované [Ca ^{2 +] _{aj prechodné javy v makrofágoch je významne znížená o nikotínu aj v prítomnosti nervovej blokátora tetrodotoxin. Po druhé, je útlm nikotín vyvolané ATP reakcií v makrofágy zvrátiť DHBE, ale nie hexamethonium, mekamylamínu, ABGT alebo MLA. Tieto farmakologické nálezy boli podporené demonštrácii p2-pozitív, ale ABGT negatívnych nAChR podjednotiek na žalúdočné makrofágy. Po tretie, väčšina makrofágov bola v bezprostrednej blízkosti kŕčových cholinergných nervových vlákien. Podobne ako u blízkosť makrofágov do nervových vlákien bola pozorovaná u potkanov črevnej muscularis [3].}}

Naším kritériom pre definovanie blízkosť medzi makrofágy a cholínergných nervových vlákien (900 vzdialenosť nm) súhlasí s konceptom extrasynaptického komunikácie , Podľa tohto konceptu môže dôjsť k difúziu na báze prenosu objem pri 100 nm až um vzdialenosti medzi zdrojom a cieľom [19]. Predpokladáme, že väčšina, ak nie všetky, cholinergný nervy v tesnej blízkosti makrofágov pochádzal z myenteric bunkových tiel neurónov na základe našej predchádzajúcej pozorovaní, že vagové vlákna nekontaktovali makrofágy črevnej rezidentný [3] To je tiež podporovaný zistením, podľa ktorého žalúdočné predominanciou eferentných vlákna takmer výlučne ohraničený enterickú ganglií [20], kde aktiváciu väčšinu myenteric neurónov cez nikotínové receptory [15].

Caipi predstavuje fyziologický systém pre riadenie aktivácie makrofágov v priebehu zápalových stavov. Protizápalový účinok aktivácia Caipi bolo preukázané, in vivo
vagu stimulácii nervu v myšiach modeloch sepsy a pooperačnej ileus [2,3] a in vitro
podľa nikotínu podávanie izolované , lipopolysacharidové stimulované makrofágy [1-4,21]. V tejto štúdii sme zistili, že nikotín znižuje nárast ATP vyvolanú intracelulárneho Ca ^{2+ v makrofágov rezidentmi v žalúdku. Je zaujímavé, že tento účinok bol obrátený p2 nAChR podjednotky prednosť antagonistu DHBE čo naznačuje zapojenie tejto podjednotky na nikotíne sprostredkované moduláciou makrofágov rezidentov. Toto pozorovanie je v súlade s našou predchádzajúcou zistenie, že DHBE obráteného inhibíciu nikotín vyvolané TNF-a (TNF-a) uvoľnenie a zvýšenej fagocytózy v izolovaných peritoneálnych makrofágov [6]. V rade, produkcia cytokínov ľudského neuroblastómu bunkové línie stabilne transfekované α4β2 nAChR je významne znížená nikotínu predbežnej úpravy [22]. Aj keď sú tieto údaje naznačujú, že α4β2 nAChR môže sprostredkovať účinky nikotínu na ATP-indukovanej zvýšenie intracelulárneho Ca 2+, nedávny dôkaz ukazuje, že p2 podjednotky môžu tiež zostaviť s inými alfa podjednotky, vrátane a7 podjednotiek. Nedávna publikácia diskutovať o elektrofyziologické vlastnosti α7β2 nAChR vyjadrené v ľudských epiteliálnych bunkových línií, ukázali, že nízke koncentrácie DHBE antagonizovaný α7β2 nAChR a7 nAChR, ale nie [16]. Tieto a ďalšie údaje o farmakologický profil DHBE by naznačovalo, že DHBE je vysoko selektívny antagonista beta2 nAChR, ale nie je spoľahlivo rozlíšiť medzi rôznymi zostavami alfa3, a4 alebo a7 s p2. Avšak naše imunohistochemické a vitálne značenie makrofágov žalúdočných rezidentmi by nemala uprednostňovať zapojenie a7 nAChR, pretože žalúdočné makrofágy neboli označené ABGT ale vyjadril P2 nAChR podjednotku.}

Napriek tomu sa rozhodnúť pre pomerne konzervatívny interpretácii našich dát a k záveru, že P2 nAChR sú kriticky podieľajú na nikotíne inhibíciu aktivity makrofágov, aj keď je pravdepodobné, že v koncentrácii použitej v našej štúdii DHBE s výhodou blokmi α4β2 nAChR. Naša príprava je ideálne, aby sa v ďalších štúdiách na možný príspevok α7β2 nAChR skúmaním účinku nikotínu v makrofágov tkanivo rezidentov z a7 nAChR, P2 nAChR a α7β2 nAChR double knock-out myší. Podobné stratégie by mali byť použité na štúdium významu ako α4β2 nAChR.

Je dôležité si uvedomiť, že antagonistický účinok DHBE nie je selektívny pre makrofágy ako DHBE, ako hexamethonium a mekamylamínu, tiež blokuje nikotínových synapsií v žalúdku myenteric neuróny [15]. Avšak nikotínové receptory na makrofágoch, musí mať iné vlastnosti ako tie, ktoré v enterálnej neurónov, pretože ani hexamethonium ani mekamylamínu obrátenej indukované útlm nikotínu ATP vyvolané reakciou na makrofágy. Hexamethonium a mekamylamínu uplatňujú svoje činy tým, upchatie pórov nikotínové kanála [23-25]. Ich neschopnosť zvrátiť nikotínu inhibíciu makrofágov môžu naznačovať existenciu atypického nAChR v makrofágy. V skutočnosti, záznam Ca ^{2+ prechodné javy v reakcii na nikotíne podaní ukázali zvýšené [Ca 2 +] _{i len 13% z makrofágov (6 z 45 makrofágov, dáta nie sú uvedené). Táto populácia je omnoho menšie, že podiel makrofágov, v ktorom nikotín modulovaných ATP evokované [Ca 2 +] i.}}

množstvo dôkazov naznačuje, že α7 nAChR hrajú kľúčovú úlohu pri znižovaní nikotínu-indukovanej produkcie cytokínov makrofágy [2,3,6,26]. Predtým sme skutočne preukázané, že nikotín sa nepodarilo zníženie produkcie TNF-a v peritoneálnych makrofágoch α7 nAChR knockout myší [6], vzhľadom k tomu, protizápalovým účinkom v tenkom čreve nervu vagus stimulácia v našom modeli pooperačnej ileus je stratený v nich KO myši [4]. V tejto štúdii sa však účinok nikotínu na ATP-indukovanej aktivácie makrofágov nebol blokovaný a7 nAChR preferring blokátory ABGT a MLA, namietať proti zapojenie a7 nAChR. Tento prístup je ďalej podporovaný nedostatkom označovanie žalúdka muscularis makrofágov a7 nAChR-preferujúcich alfa-bungarotoxin. V čreve, ale my sme pozorovať alfa-bungarotoxin pozitívne značené muskulárnej makrofágy [4 a túto štúdiu], čo ukazuje rozdiely špecifický pre určitý región fenotypu týchto buniek imunitného systému.

Aj keď je zrejmý nedostatok ABGT citlivá α7 nAChR v našej štúdii sa objaví v rozpore s našimi predchádzajúcimi poznatkami, sme celkom istí, že tieto údaje nie sú v dôsledku neschopnosti ABGT súťažiť o väzobné miesto ako rovnakej koncentrácii, použité v našej štúdii blokoch neurónov α7 nAChR v mozgu a v izolované alveolárna makrofágy [18].

• Ploche ONE: Elektroakupunktúra u ST36 zlepšuje vyprázdňovanie žalúdka a zachráni siete intersticiálne bunky Cajalových v žalúdku diabetických krýs
• Ploche ONE: Tonic a fázovým kontrakcie hladkého svalstva nie je regulovaná podľa PKCα - CPI-17 Cesta na prasacej žalúdočné dutine a Fundus