PLoS ONE: Никотин Аттенюирует Активация ткани резидентными макрофагами в желудке мышей через β 2 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

Абстрактный

Фон
<р> Холинергическая противовоспалительный путь является эндогенным механизмом, с помощью которого вегетативная нервная система ослабляется активацию макрофагов с помощью никотиновых рецепторов ацетилхолина (нАХР). Эта концепция, однако, не была продемонстрирована на клеточном уровне в интактной ткани. С этой целью мы изучили влияние никотина на активацию макрофагов в препарате мыши желудка с помощью визуализации кальция.

Методы

Переходные процессы кальция ([Ca ^{2 +] <суб> я) в резидентных макрофагах были зарегистрированы в препарате желудка мыши, содержащей сплетение мышечной оболочки кишечника и мышечные слои, Fluo-4. Активация макрофагов была достигнута путем введения фокальной слоеного АТФ. Влияние никотина на активации макрофагов оценивали и нАХР участие было фармакологически охарактеризован. Близость холинергических нервов макрофагами определяли количественно с помощью конфокальной микроскопии. Выражение β 2 и А7 нАХР оценивали с помощью бета 2 иммуногистохимии и флуорофора-меченый альфа-бунгаротоксина}

Результаты
<р> В 83% макрофагов холинергическая варикозные нервные волокна были обнаружены на расстояниях &Лт;. 900 нм. АТФ индуцированное [Са ^{2 +] <суб> я увеличить значительно тормозится в 65% или 55% макрофагов или 100 мкМ 10 мкМ никотина соответственно. Это тормозящее действие было отменено бета 2 нАХР предпочитая антагонист дигидро-бета-eryhtroidine но не гексаметония (неселективный нАХР-антагонист), мекамиламина (α3β4 нАХР-предпочтя антагонист), α-бунгаротоксина или methyllycaconitine (оба α7 антагонист нАХР-предпочтя ). Макрофаги в желудке выразить β2, но не α7 нАХР на уровне белка, в то время как в кишечнике выражают как субъединиц рецептора.}

Заключение
<р> Это исследование является первым в
<ЕМ> Situ
демонстрация ингибирования активации макрофагов под действием никотина предполагая функциональную передачу сигналов между холинергических нейронов и макрофагов в желудке. Полученные данные свидетельствуют о том, что β2 субъединицу нАХР критически вовлечен в никотин-индуцированное ингибирование этих резидентов макрофагов
<р> Цитирование:. Nemethova A, K Мишель, Гомес-Пинилья PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Никотин Аттенюирует Активация тканей резидентными макрофагами в желудке мышей через β2 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов. PLoS ONE 8 (11): e79264. DOI: 10.1371 /journal.pone.0079264
<р> Редактор: Иветт Tache, Калифорнийский университет, Лос-Анджелес, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 10 июня 2013 года; Принято: 26 сентября, 2013 года; Опубликовано: 1 ноября 2013
<р> Copyright: © 2013 Nemethova и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана грантом 7-й рамочной программы Европейского союза (IPODD), Дойче Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 MS; грантом исследовательского фонда Фландрии (FWO, Одиссей и программы Hercules) в ГЭБ, и с помощью FWO постдокторской исследовательского общения с PJG. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

В 2000 году Трэйси и его коллеги показали, что электрическая стимуляция блуждающего нерва обеспечивает сильную противовоспалительную вклад в селезенке. В мышиной модели сепсиса, электростимуляция блуждающего нерва (ВНС) привело к снижению провоспалительных цитокинов, продукцию эффект зависимой от А7 никотиновых рецепторов ацетилхолина (nAChRs) [1,2]. Это так называемый "холинергической противовоспалительное пути" (CAIP) действует через адренергические селезеночной нервов делает синаптические-подобные контакты с β 2-адренергических рецепторов, экспрессирующих селезеночных Т-клеток. Последующее высвобождение ацетилхолина (АХ) из этих Т-клеток отвечает за противовоспалительный эффект, предположительно, взаимодействуя с α7nAChR-экспрессирующих макрофагов [1,2].
<Р> В 2005 году мы представили доказательства, что CAIP также модулирует кишечную иммунную систему. В мышиной модели послеоперационной непроходимости, мы показали, что ВНС снижается кишечную манипуляция индуцированное воспаление тонкой кишки, благоприятный эффект зависимой от А7 нАХР но независимо от селезенки [3,4]. Эти данные свидетельствуют о том, что иммунная система кишка, а непосредственно модулируется вагусных нервных окончаний и /или кишечными нейронов. Поскольку кишечные макрофаги резиденты являются основными игроками запускающие этот воспалительный ответ [5], эти клетки представляют собой наиболее вероятной мишенью из CAIP. В пробирке исследования с использованием выделенных перитонеальных макрофагов, периферических клеток получают макрофаги мононуклеарные или макрофаг клеточные линии действительно обильно продемонстрировали, что ацетилхолин и никотин снижают выработку цитокинов [1-3,6,7] и увеличить фагоцитоза [6]. Тем не менее, остается под вопросом, в какой степени их фенотип действительно имеет сходство с резидентных макрофагов, страдающих кишечными нейронов, особенно в качестве экспрессии рецептора в макрофагах может быть вверх или вниз регулируется, как они были выделены из их природной среды. Поэтому мы решили разработать метод, который позволил бы нам изучить влияние никотина на активацию макрофагов в их естественной среде. Как активированными макрофагами АТФ, хорошо известный сигнал опасности для иммунных клеток [8,9], показывают увеличение внутриклеточного Са ^{2+, Са жить 2 + визуализация была выбрана для изучения макрофаги резидентов в неповрежденной плоской листовых заготовок желудка мыши. Это позволило нам сравнить АТФ вызывал Са 2+ ([Ca 2 +] <суб> я) в макрофагах, расположенных в слоях гладких мышц до и после нанесения никотина. Кроме того, мы использовали несколько антагонистов с известными преференциях для конкретных подразделений нАХР, с тем чтобы обеспечить дальнейшее механистических понимание роли рецептора никотина, выражающих макрофаги для CAIP в кишечнике. Эти фармакологические данные были подтверждены с помощью иммуногистохимии. И, наконец, мы проанализировали долю макрофагов, которые находятся в непосредственной близости от холинергических нервных волокон.}

Методы

Заявление по этике
<р> Вся работа мышь была проведена в соответствии с немецкими руководящими принципами для ухода за животными и благосостояния (Deutsches Tierschutzgesetz) и утвержден Баварской государственной комиссии по вопросам этики (Regierung Верхней Баварии, который служит по уходу и использованию комитета Institutional для Technische Universität München) в соответствии с § 4 и §11 Deutsches Tierschutzgesetz под номером ссылки 32 -568-2.

образцы тканей
<р> Мужчина 12-16 недель мышей C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Германия) были убиты путем смещения шейных позвонков. Желудок был собран в ледяной Кребса буфере, содержащем (в мМ) 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl <югу> 2 6 H <югу> 2O, 1.2 NaH <суб> 2PO <суб> 4, 25 NaHCO <суб> 3, 2,5 CaCl <суб> 2 2 Н <суб> 2O и 11 глюкозы и рН доводили до 7,4. Желудок был открыт вдоль большой кривизны и промывали охлажденным льдом Кребса. При микроскопическом инспекции, желудок был прижат вниз на Sylgard блюдо и слизистую оболочку и подслизистую были тщательно удалены. Во время диссекции, ткань непрерывно перфузию льдом раствор Кребса, чтобы обеспечить жизнеспособность ткани. Только передняя или задняя половина желудка была приколота на маленьком Sylgard кольцо с центральным отверстием 100 х 200 мм ^2.

Кальций изображений
<р> Плоские препараты желудка лист Мышиные инкубируют в модифицированном растворе Кребса (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl <югу> 2 6 H <югу> 2O, 1.2 NaH <суб> 2PO <суб> 4, 20 NaHCO <югу> 3, 2.5 CaCl <суб> 2 2 Н <суб> 2O и 11 глюкоза), содержащей 30 мкМ флуоресцентного индикатора кальция Fluo 4-ацетоксиметил (AM) (Invitrogen) и 1,25 мМ пробенецида (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Германия) в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте и загазованности с карбогена (95% O <суб> 2 - 5% CO <суб> 2). Sylgard кольцо было установлено в регистрирующей камере с серозной стороны желудка, обращенной к нижней части камеры. Камера была подключена к системе перфузии, чтобы включить непрерывную перфузию с карбогена-загазованности раствором Кребса при комнатной температуре. Размыв течение 1,5 ч было разрешено перед началом эксперимента. Камера ткань была установлена ​​на перевернутом эпифлуоресцентной микроскоп (Zeiss Axio наблюдатель A1, Carl Zeiss, Jena, Германия), снабженном высокоскоростной монохромной камеры (Цейсс AxioCam HSM) и программное обеспечение (Zeiss Axio видения 4.8) для сбора и анализа. Fluo-4 был возбужден с использованием синего света на светодиодах (LED) Luxeon III (3W, 470nm доминирующую длину волны, Philips Lumiled, Филипс, Hambur, Германия) сигналы и Fluo-4 были обнаружены с помощью фильтра куба F26-514 яркая линия FITC BP (возбуждение: HC475 /35, дихроичный: 499, эмиссия: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Тюбинген, Германия) с использованием цели X20 (A-Plan, NA = 0,25, Цейс). Система измеренные относительные изменения флуоресценции (Δ F /F) из Fluo-4 мониторинга изменений в внутриклеточного кальция ([Са 2 +] <суб> я). Ca 2 + Переходные процессы были записаны, начиная 3 с до местного введения АТФ в общей сложности на 14,5 сек с частотой кадров с частотой 2 Гц и времени экспозиции 200 мс.
<р> Мы использовали АТФ в качестве инструмента для активации макрофагов, поскольку он представляет собой сигнал опасности выпущен локально на месте воспаления [8,9], а с АТФ, как известно, вызывают секрецию цитокинов из макрофагов с помощью увеличения [Са 2 +] <суб> я [10-12].
<р> АТФ (Sigma-Aldrich) и никотин (Sigma-Aldrich) были локально применены выбросом давления из двух микропипетками с длительностью 200 мс и 10 сек, соответственно. Положение микропипетками гарантируется, что выброшенные объемы покрытые идентичные области ткани. В микропипетки были заполнены 1 мМ АТФ и 100 мкМ или 10 мкМ никотина, растворенного в растворе Кребса, содержащим 1,25 мМ пробенецида. В соответствии с ранее опубликованными калибровочных кривых, мы полагаем, что любое вещество применяется импульсами выталкивания давление будет разбавляться примерно 1:10, как только он достигнет ткани [13].
<Р> Местное введение АТФ и никотина допускается измерение ответов в нескольких областях (обычно 4-5) в той же самой ткани. Положение областей в ткани была документирована с использованием системы координат, отображаемой на мобильном столике микроскопа. Влияние никотина на АТФ индуцированного переходными кальция снова изучали в тех же регионах после добавления различных нАХР антагонистов. После записи ответов, макрофаги визуализировали витальной инкубации ткани с аллофикоцианина (APC) меченным анти-мышиных анти-F4 /80 антител (1: 250, eBioscience, Франкфурт, Германия) в течение 1 ч, при комнатной температуре в темный и загазованности с карбогена. Ткань промывали в течение 15 минут. Столик микроскопа была приложена, чтобы найти области, где мы записали с. Изображения меченых макрофагов были приобретены с использованием красного Z-LED P4 (3,5 Вт) источник возбуждения (625 нм доминирующая длина волны, Seoul Semiconductor) и светофильтров F46-006 ET набор фильтров (возбуждение: ET 620/60, дихроичный: 660, выбросов: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Тюбинген, Германия). Наложение сигналов и изображений F4 /80 положительного макрофагами Fluo-4 позволило нам проанализировать ответы в отдельных макрофагов.

Immunohistochemistry
<р> Для резидентных макрофагов метка ткани, мы впервые использовали жизненно маркировки протокол, описанный выше. Затем ткань фиксировали в течение ночи при комнатной температуре в растворе, содержащем 4% формальдегида и 0,2% пикриновой кислоты в 0,1 М фосфатном буфере, промывали 3 х 10 минут в фосфатном буфере и, наконец, инкубировали в течение 1 часа в растворе, содержащем 0,5% Тритон Х- 100, 0,1% NaN <суб> 3, 4% лошадиной сыворотки, растворенного в PBS (все от компании Sigma-Aldrich). Для того, чтобы пометить холинергической варикоз, ткань инкубировали в течение ночи в блокирующем растворе, содержащем козий анти-везикулярного ацетилхолина транспортером (VAChT; 1: 1000; Мерк-Millipore, Дармштадт, Германия). Ткани промывали 3 х 10 мин в PBS и инкубировали в течение 1,5 - 2 ч в блокирующем растворе, содержащем Cy-3-меченными анти-козьего антитела (1: 500; Дианова, Hamburg, Germany). Ткани промывали 3 х 10 минут в PBS, и смонтированный в анти-выцветанию вещества (20% PBS /NaN <суб> 3, 80% глицерина) поли L-лизина-покрытием слайдами и для просмотра покрывали.
<р> для обозначения В2- Nachr в резидентных макрофагов ткани, слизистые оболочки, свободной от желудочных целых препаратов монтировании дикого типа и β 2 нАХР выбивание [14] мышей фиксировали в течение 10 мин в ледяном растворе PBS, содержащем 4% параформальдегида (PFA) , Затем ткани промывали 2 х 10 мин в PBS и инкубировали в течение 2 ч в PBS, содержащем 1% протеазы свободной Альбумин бычьей фракция V альбумина (БСА; Серва, Heidelberg, Germany) и 10% нормальной ослиной сыворотки (НСР; Jackson ImmunoResearch, штат Пенсильвания, США). Ткани инкубируют в течение 36 ч с ФБР, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина, 5% НСР анти-мышиных F4 /80 (1: 500; клон BM8, BioLegend, Сан-Диего, США) и кроличьи антитела против мышиных β2 нАХР (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Гейдельберг, Германия). Ткани промывали 3 х 10 мин в PBS и инкубировали в течение 1 ч в PBS, содержащем 1% БСА, 5% НСР, Alexa Fluor® 647-меченых козьего анти-крысиного антитела (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Пенсильвания, США) и Cy-3 маркированы осла против кроличьих антител (1: 1000; Chemicon, Millipore, Биллерика, США). Ткани промывали 3 х 10 минут в PBS, и смонтированный в замедленной выцветанию реагента (Invitrogen, Life Technologies, Гент, Бельгия) на слайдах поли-L-лизин-покрытием и покрывали для этикеток viewing.To α7nAChR в резидентных макрофагов тканей, A часть живота мыши и подвздошной были подвергнуты витальной маркировки с использованием Cy5-меченый альфа-бунгаротоксина (Invitrogen) в количестве 0,1 мкг /мл в среде RPMI 1640 (Lonza, Базель, Швейцария) при температуре 4 ° с в течение 15 мин [4]. Затем ткани фиксировали в PBS, содержащем 4% PFA. Слизистая и подслизистая были удалены, а ткани инкубировали в течение 2 ч в блокирующем растворе, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина. Затем ткани инкубируют в течение 60 ч в блокирующем растворе, содержащем анти-мышиных F4 /80 (клон BM8, BioLegend), а затем 3 х 10 мин промывок в PBS и инкубировали в течение 1 ч в PBS, содержащем 1% БСА и Cy-3 маркированы анти-крысиного антитела (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, штат Пенсильвания, США). И, наконец, ткани промывали 3 х 10 минут в PBS, и смонтированный в замедленной выцветанию вещества на слайдах поли-L-лизин-покрытием и для просмотра покрывали.

конфокальной микроскопией и анализ изображений
<р> изображения были получены с использованием LSM 510 (Carl Zeiss) с конфокальной микроскопии План-Neofluar x40 /1.3 Oil DIC и Plan Apochromat x63 /1.4 Oil DIC целей. Лазерные длины волн 543 нм и 633 нм были использованы для возбуждения флуорофоров Cy3 и APC или Cy5, соответственно. Cy3 и APC или Cy5 сигналы были обнаружены с помощью фильтра устанавливает BP 565-615 ИК и BP 650-710 ИК соответственно.

стеки изображений для количественного анализа с использованием цели x63 были отсканированы с разрешением XY 1024 × 1024, которая охватывает территорию площадью 95,5 × 95,5 мкм ^{2. Первый и последний оптические срезы были взяты в верхней и нижней части наружной поверхности макрофага. Оптическая глубина каждого среза была 900 нм. Два последовательных ломтиков перекрыта для 500 нм. Как правило, между 9 и 16 ломтиков были получены в результате глубину сканирования 3.2-6.0 мкм, содержащих от 1-3 макрофаги и VAChT положительных волокон пропуска через макрофаги. стеки изображения были проанализированы с помощью изображения J Pro.
<р> Изображения β 2 и А7 нАХР-меченых макрофагов были приняты с использованием цели x63 и отсканированы с разрешением XY 1024 × 1024, которая охватывает территорию площадью 95,5 × 95,5 мкм 2. Оптическая глубины изображения был 900 нм.}

Фармакология
<р> Чтобы блокировать распространения потенциала действия в нейронах, тетродотоксин (Biotrend, Кельн, Германия) добавляли к перфузионного раствора Кребса в концентрации 1 мкМ. Для фармакологической характеристики следующие никотиновые блокираторах К раствору добавляли Кребса перфузии ткани: 200 мкМ гексаметоний (Sigma-Aldrich), 100 мкМ Mecamylamine (Sigma-Aldrich), 10 мкМ дигидро-β-erythroidine (DHBE; Sigma-Aldrich) , 100 нМ, 3 мкМ и 10 мкМ α-бунгаротоксина (ABGT; Tocris) и 10 нМ и 100 нМ methyllycaconitine (MLA, Tocris). Гексаметоний, Mecamylamine и DHBE испытывали в концентрациях, которые были способны уничтожить никотиновые быстрые возбуждающие постсинаптические потенциалы в морских свинок нейронов мышечной оболочки кишечника [15] .The использование 10 нМ и 100 нМ MLA основано на концентрации соответственно используется для блокирования А7 субъединицу, содержащую Nachr [16] и использованы для ингибирования секреции IL-6 из изолированных макрофагах [3].

анализ данных и статистика
<р> максимальные относительные изменения флуоресценции (Δ F /F) в ответ на было выражено введение АТФ как увеличение выше базальной флуоресценции% перед введением АТФ. Статистический анализ проводили с Sigma Plot 9.0 (Systat Software Inc, Erkrath, Германия). Данные представлены в виде усов участков с медианой и 25 ^{й и 75 й процентили, а также 10 и 90 й процентили. Не нормально распределенные данные спаренные были проанализированы Критерий Уилкоксона. Различия считались статистически значимыми при P
&л; 0.05. N
Числа, приведенные в скобках указывают число макрофагов /тканей изученные, т.е. результат, основанный на записях 20 макрофагов в тканях 5 (равное 5 животных) представлена ​​в виде (20/5).}

Результаты

Пространственная взаимосвязь между резидентных макрофагов тканей и холинергических варикоз в желудке мыши
<р> Мы использовали конфокальной микроскопии для оценки близости между F4 /80-положительных макрофагов и VAChT-положительных варикозного холинергических нервных волокон в желудке мыши (Рис. 1А) Детальный анализ показал, что 83% из 41 исследованных макрофагами расположены в пределах 900 нм, по меньшей мере, один варикозным холинергические нервных волокон (рис 1B-C).

Воспроизводимость АТФ вызывала [Са 2 +] <суб> I сигналы в ткани резидентных макрофагов

Microejection АТФ вызывало сильное, быстрое начало [Са ^{2 +] <подразделам> я переходная в макрофагах, которые достигли своего пика на 8-10 сек после нанесения с последующим медленным возвращением к исходным [Са 2 +] <суб> I уровни (рис 2A и Movie S1). Так как не всегда было полное восстановление к исходному уровню в течение периода записи, максимальная [Са 2 +] <суб> я сигнал использовался для анализа всех экспериментов. Ни один тахифилаксии не наблюдалось, так как максимальная амплитуда [Са 2 +] <суб> I сигнал в ответ на второй введения АТФ, через 10 минут после первой, не отличалась от исходного максимального ответа (Фигура 2В).}

влияние никотина на [Са ^{2 +] <суб> I сигналы в ткани резидентными макрофагами
<р> Для изучения влияния никотина на АТФ вызвавший [Са 2 +] <суб> I сигналы мы microejected никотин в течение 10 сек и сразу же вновь применен АТФ на том же регионе. Один рационально использовать никотин в качестве селективного, Неискаженный нАХР агониста имитировать никотиновую активацию рецептора путем высвобождение ацетилхолина из холинергических нейронов. Анализируя изменения в [Са 2 +] <суб> я во всех макрофагов показало, что никотин значительно снижается АТФ вызывал [Са 2 +] <суб> I сигналы (рис 2D и F). Более детальный анализ влияния никотина на АТФ-индуцированной [Са 2 +] <суб> I Переходные процессы выявлены три популяции макрофагов (рис 2D-G). Никотин на 10 и 100 мкМ уменьшал АТФ-вызываемую [Са 2 +] <югу> I сигналы в 55% и 65% макрофагов, соответственно. [Са 2 +] <суб> я сигнал оставался неизменным в 36% и 28% макрофагов после применения 10 мкМ и 100 мкМ никотина соответственно. В небольшой группе, 10 мкМ и 100 мкМ никотина усиливал АТФ-вызванных [Са 2 +] <суб> я отклика (9% и 7% макрофагов, соответственно).
<Р> Чтобы избежать любой смещения дальнейший анализ основан на никотиновые воздействия на всех макрофагов, независимых от индуцированных ли АТФ [Са 2 +] <суб> я сигнал уменьшается, увеличивается или без изменений.}

Роль нейронов в никотиновой вызванных ослабление активации макрофагов
<р> Никотин непосредственно активирует нейроны энтеральной и мы рассмотрели возможность, что активация близкого по нейронов мышечной оболочки кишечника способствует ослабленным [Са ^{2 +] <подразделам> I ответов в макрофагах. Мы не нашли никаких доказательств для такого косвенного тормозящего пути, так как ослабление АТФ [Са вызывал 2 +] <суб> я сигнал от никотина остается в присутствии тетродотоксин (рис 2C). Следует отметить, однако, что доля тех макрофагов, где никотин не изменяло АТФ вызывал [Са 2 +] <суб> I сигналы были резко сократилось (28% против 6%). В то же время, макрофаги, в которых никотин ингибируется или потенциирующие АТФ вызывала [Са 2 +] _{I сигналы увеличилась с 65% до 71% и от 7% до 23%, соответственно.}}

Фармакологическая характеристика тормозящее действие никотина на тканевые макрофаги резидентные
<р> активация макрофагов АТФ и ингибирование реакции АТФ 100 мкМ никотина достоверно записана в каждом из 21 препаратов, показанных на рисунке 2F. Это позволило нам выполнить антагонисты исследования без необходимости сдвинувшим ингибирующего реакцию в тех макрофагов, обработанных антагонистами. Кроме того, мы тем самым уменьшается число периодов записи до уровня, который не поставить под угрозу уровень сигнала и гарантированные воспроизводимые АТФ ответы. Для изучения Nachr-субъединиц, участвующих в тормозящее воздействие никотина, мы протестировали пять различных блокаторов с известными субъединиц предпочтениями [17] (рисунок 3). Тормозящее действие никотина на АТФ-вызванных [Са 2 +] <подразделам> Я ответов был неизменным в присутствии неселективного ганглионарной нАХР антагониста гексаметония, что α3β4 Nachr-предпочитающие антагонист Mecamylamine или А7 антагонисты Nachr-предпочтя α-бунгаротоксина и methyllycaconitine (фиг.3А). Тем не менее, β2 антагонист нАХР-предпочитающих ди-гидро-β-eryhtroidine обратный ингибирующее действие никотина на АТФ-[Са вызывал 2 +] <суб> I ответы в макрофагах (рис 3б).
<р> Хотя мы использовали ABGT при концентрациях, которые были описаны надежно блокировать А7 Nachr в нейронах и изолированных альвеолярных макрофагов [18], мы были обеспокоены тем, что это может быть не в состоянии противодействовать угнетающее действие никотина из-за неблагоприятной конкуренции на участке связывания. Тем не менее, это кажется маловероятным, потому что даже при концентрациях 3 мкМ и 10 мкМ ABGT не смог переломить угнетающее действие никотина на АТФ вызывал [Са 2 +] <суб> I ответы (рис 3А). ABGT сделал также не обратить вспять ослабление вызываемую 10 мкМ никотина (рис 3C).

Маркировку β 2, но не А7 Nachr в ткани резидентных макрофагов

Для того, чтобы предоставить дополнительные доказательства причастности β 2 нАХР но не А7 нАХР в тормозящее влияние никотина на АТФ-Са [вызывал ^{2 +] были выполнены <суб> I ответы, иммуногистохимическое маркировка В2- Nachr и жизненно важную маркировку А7 нАХР путем ABGT в резидентных макрофагов желудка мышечной (Рисунок 4). Большинство резидентов макрофагов желудка были мышечной Nachr β 2-иммунореактивных (рис 4а), поддерживающий наблюдаемое антагонистическое действие DHBE на никотиновой ингибирования реакций АТФ. Используемое антитело для В2- Nachr специфичен из-за отсутствия В2- Nachr иммунореактивности в β 2 нАХР нокаутных мышей (рис 4В).
<Р> Vital маркировка А7 нАХР по ABGT выявил отсутствие А7 нАХР в резидентных макрофагов ткани в желудок мыши (рис 4C), В отличие от этого, кишечные макрофаги метили ABGT (рис 4D). Отсутствие А7 нАХР в желудке мышечной резидентных макрофагов подтвердили отсутствие антагонизма А7 Nachr-предпочитая блокаторы ABGT и MLA на тормозящее воздействие никотина на АТФ вызывал [Са 2 +] <суб> Я ответы в этих клетках.}

Обсуждение

на сегодняшний день влияние никотина было исследовано только в изолированных макрофагах или макрофагов клеточных линий. Здесь мы разработали в пробирке
модель желудка мыши мышц-мышечной оболочки кишечника препарата сплетение для изучения влияния никотина на резидентных макрофагов ткани в их естественной среде обитания. Это настоящее исследование, поэтому первым, чтобы показать, что никотин непосредственно ингибирует активацию макрофагов ткани через β 2 субъединицей, содержащей Nachr и, таким образом, обеспечивает основу для функциональной сигнализации между холинергических нейронов и макрофагов в кишечнике. Наш вывод подтверждается несколькими линиями доказательств. Во-первых, АТФ вызывала [Са ^{2 +] <суб> I Переходные процессы в макрофагах значительно снижается под действием никотина, даже в присутствии нервного блокатора тетродотоксин. Во-вторых, ослабление никотин индуцированных реакций АТФ в макрофагах было отменено DHBE, но не гексаметония, мекамиламина, ABGT или MLA. Фармакологические результаты были поддержаны демонстрации β 2-Позитив но ABGT-отрицательных нАХР субъединиц на желудочную макрофагов. В-третьих, большинство макрофагов в непосредственной близости от варикозного расширения холинергических нервных волокон. Аналогичная близость макрофагов к нервных волокон наблюдалась в кишечной мышечной крысы [3].
<Р> Наш критерий, используемый для определения непосредственной близости между макрофагами и холинергических нервных волокон (900 нм расстояние) согласуется с концепцией внесинаптического коммуникации , В соответствии с этой концепцией диффузия на основе передачи объема может происходить при 100 нм до мкм расстояния между источником и мишенью [19]. Мы предполагаем, что большинство, если не все, холинергические нервы в непосредственной близости от макрофагов возник из мышечной оболочки кишечника тел нервных клеток, основанные на предыдущем наблюдении, что блуждающие волокна не контактируют кишечные макрофаги резидентные [3], Это также подтверждается находками, что желудочный блуждающего эфферентные волокна почти исключительно заканчиваются кишечно ганглиев [20], где они активируют большинство нейронов через мышечной оболочки кишечника никотиновых рецепторов [15].
<р> CAIP представляет собой физиологическую систему контроля активации макрофагов при воспалительных условиях. Противовоспалительный эффект активации CAIP было показано <ЕМ> В естественных условиях Ру по блуждающего нерва в мышиных моделях сепсиса и послеоперационной непроходимости [2,3] и в пробирке Ру по никотиновой введения изолированным , липополисахарида -stimulated макрофаги [1-4,21]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что никотин уменьшил АТФ-индуцированное увеличение внутриклеточного Са 2+ в резидентных макрофагов в желудке. Интересно, что этот эффект был отменено нАХР β 2 субъединицы предпочитая антагонист DHBE предполагая причастность этой субъединицы в никотиновой опосредованной модуляции резидентных макрофагов. Это наблюдение согласуется с нашим предыдущим выводом, что DHBE обращенно никотин-индуцированного ингибирования фактора некроза опухоли-альфа (TNF-alpha) высвобождения и повышение фагоцитоза в изолированных макрофагах [6]. В линии, продукция цитокинов из линии клеток нейробластомы человека, стабильно трансфицированные α4β2 нАХР значительно снижается никотиновой предварительной обработки [22]. Хотя эти данные свидетельствуют о том, что α4β2 nAChRs может опосредовать влияние никотина на АТФ-индуцированное увеличение внутриклеточного Са 2+, последние данные свидетельствуют о том, что β 2 субъединицы также могут собираться с другими альфа субъединицы, в том числе А7 субъединиц. В недавней публикации обсуждают электрофизиологические свойства α7β2 нАХР экспрессируется в эпителиальных клеточных линиях человека, показали, что низкие концентрации DHBE противодействует α7β2 нАХР но не А7 Nachr [16]. Эти и другие данные о фармакологическом профиле DHBE бы предположить, что DHBE является весьма селективным антагонистом β 2 Nachr но достоверно не дискриминировать между различными собраниями а3, или α 4 β 2 А7 с. Тем не менее, наша иммуногистохимическое и жизненно маркировка желудочных резидентных макрофагов не способствуют вовлечению А7 нАХР потому, что желудочные макрофаги не метили ABGT но выразил Nachr субъединицу β 2.
<р> Тем не менее, мы выбираем довольно консервативной интерпретации наших данных и сделать вывод, что β 2 Nachr критически участвуют в никотиновой ингибирования активности макрофагов, хотя вполне вероятно, что при концентрации, используемой в нашем исследовании DHBE предпочтительно блокирует α4β2 нАХР. Наш препарат идеально подходит для решения в будущих исследованиях возможного вклада α7β2 нАХР, исследуя влияние никотина в резидентных макрофагов ткани от А7 нАХР, β 2 Nachr и α7β2 Nachr двойных мышей нокаут-системе. Подобные стратегии должны быть использованы для изучения значимости с α4β2 нАХР.
<Р> Важно отметить, что антагонистическое действие DHBE не является селективным для макрофагов как DHBE, как гексаметония и мекамиламина, также блокирует никотиновые синапсы в желудочном нейронов мышечной оболочки кишечника [15]. Тем не менее, никотиновые рецепторы на макрофагах должны обладать различными свойствами, чем те, в кишечно нейронов, так как ни гексаметони, ни Mecamylamine вспять никотина индуцированный ослабление АТФ-вызвали ответы макрофагов. Гексаметония и Mecamylamine оказывают свои действия закупоривания пор никотиновой канала [23-25]. Их неспособность переломить никотина ингибирование макрофагов может предполагать существование нетипичной нАХР в макрофагах. Действительно, запись Ca 2+ в ответ на приема никотина показали увеличение [Са 2 +] <суб> я только 13% макрофагов (6 из 45 макрофагах, данные не приведены). Это население значительно меньше, что доля макрофагов, в которых никотин модулировавшую АТФ вызывала [Са 2 +] <суб> I.
<р> Обильные данные свидетельствуют о том, что α7 нАХР играет решающую роль в снижении никотина индуцированное макрофагами продукции цитокинов [2,3,6,26]. Ранее мы действительно, показали, что никотин не удалось снизить выработку ФНО-альфа в перитонеальных макрофагах α7 нАХР нокаутных мышей [6], в то время как противовоспалительный эффект в тонкой кишке стимуляции блуждающего нерва в нашей модели послеоперационной непроходимости теряется в них мышей KO [4]. В настоящем исследовании, однако, влияние никотина на АТФ-индуцированной активации макрофагов не был блокирован А7 нАХР, предпочитающего блокаторы ABGT и ГНД, выступая против участия А7 nAChRs. Это дополнительно подтверждается отсутствием маркировки желудка макрофагов мышечной А7 нАХР-предпочитая альфа-бунгаротоксина. В кишечнике, тем не менее, мы сделали наблюдать альфа-бунгаротоксина положительные меченые макрофаги [мышечная 4, и это исследование], с указанием конкретных регионов различия в фенотипе этих иммунных клеток.
<Р> Несмотря на то очевидное отсутствие ABGT чувствительных α7 нАХР в нашем исследовании, представляется противоречащим наших предыдущих выводов, мы вполне уверены, что эти данные не из-за неспособности ABGT конкурировать за сайт связывания в той же концентрации, используемой в нашем исследовании блоков нейронная α7 нАХР в головном мозге и в}

• PLoS ONE: Электроакупунктура на ST36 опорожнение желудка Улучшает и выручает Сетей интерстициальных клеток Кахале…
• PLoS ONE: Тоник и Фазовые Smooth Muscle стягивание не Регулируется PKCα - CPI-17 Тропинка в Свиной Желудок Антрум и Fundus