Фон
<р> Холинергическая противовоспалительный путь является эндогенным механизмом, с помощью которого вегетативная нервная система ослабляется активацию макрофагов с помощью никотиновых рецепторов ацетилхолина (нАХР). Эта концепция, однако, не была продемонстрирована на клеточном уровне в интактной ткани. С этой целью мы изучили влияние никотина на активацию макрофагов в препарате мыши желудка с помощью визуализации кальция.
Переходные процессы кальция ([Ca 2 +] <суб> я) в резидентных макрофагах были зарегистрированы в препарате желудка мыши, содержащей сплетение мышечной оболочки кишечника и мышечные слои, Fluo-4. Активация макрофагов была достигнута путем введения фокальной слоеного АТФ. Влияние никотина на активации макрофагов оценивали и нАХР участие было фармакологически охарактеризован. Близость холинергических нервов макрофагами определяли количественно с помощью конфокальной микроскопии. Выражение β 2 и А7 нАХР оценивали с помощью бета 2 иммуногистохимии и флуорофора-меченый альфа-бунгаротоксина
Результаты
<р> В 83% макрофагов холинергическая варикозные нервные волокна были обнаружены на расстояниях &Лт;. 900 нм. АТФ индуцированное [Са 2 +] <суб> я увеличить значительно тормозится в 65% или 55% макрофагов или 100 мкМ 10 мкМ никотина соответственно. Это тормозящее действие было отменено бета 2 нАХР предпочитая антагонист дигидро-бета-eryhtroidine но не гексаметония (неселективный нАХР-антагонист), мекамиламина (α3β4 нАХР-предпочтя антагонист), α-бунгаротоксина или methyllycaconitine (оба α7 антагонист нАХР-предпочтя ). Макрофаги в желудке выразить β2, но не α7 нАХР на уровне белка, в то время как в кишечнике выражают как субъединиц рецептора.
Финансирование:. Эта работа была поддержана грантом 7-й рамочной программы Европейского союза (IPODD), Дойче Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 MS; грантом исследовательского фонда Фландрии (FWO, Одиссей и программы Hercules) в ГЭБ, и с помощью FWO постдокторской исследовательского общения с PJG. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
В 2000 году Трэйси и его коллеги показали, что электрическая стимуляция блуждающего нерва обеспечивает сильную противовоспалительную вклад в селезенке. В мышиной модели сепсиса, электростимуляция блуждающего нерва (ВНС) привело к снижению провоспалительных цитокинов, продукцию эффект зависимой от А7 никотиновых рецепторов ацетилхолина (nAChRs) [1,2]. Это так называемый "холинергической противовоспалительное пути" (CAIP) действует через адренергические селезеночной нервов делает синаптические-подобные контакты с β 2-адренергических рецепторов, экспрессирующих селезеночных Т-клеток. Последующее высвобождение ацетилхолина (АХ) из этих Т-клеток отвечает за противовоспалительный эффект, предположительно, взаимодействуя с α7nAChR-экспрессирующих макрофагов [1,2].
<Р> В 2005 году мы представили доказательства, что CAIP также модулирует кишечную иммунную систему. В мышиной модели послеоперационной непроходимости, мы показали, что ВНС снижается кишечную манипуляция индуцированное воспаление тонкой кишки, благоприятный эффект зависимой от А7 нАХР но независимо от селезенки [3,4]. Эти данные свидетельствуют о том, что иммунная система кишка, а непосредственно модулируется вагусных нервных окончаний и /или кишечными нейронов. Поскольку кишечные макрофаги резиденты являются основными игроками запускающие этот воспалительный ответ [5], эти клетки представляют собой наиболее вероятной мишенью из CAIP. В пробирке исследования с использованием выделенных перитонеальных макрофагов, периферических клеток получают макрофаги мононуклеарные или макрофаг клеточные линии действительно обильно продемонстрировали, что ацетилхолин и никотин снижают выработку цитокинов [1-3,6,7] и увеличить фагоцитоза [6]. Тем не менее, остается под вопросом, в какой степени их фенотип действительно имеет сходство с резидентных макрофагов, страдающих кишечными нейронов, особенно в качестве экспрессии рецептора в макрофагах может быть вверх или вниз регулируется, как они были выделены из их природной среды. Поэтому мы решили разработать метод, который позволил бы нам изучить влияние никотина на активацию макрофагов в их естественной среде. Как активированными макрофагами АТФ, хорошо известный сигнал опасности для иммунных клеток [8,9], показывают увеличение внутриклеточного Са 2+, Са жить 2 + визуализация была выбрана для изучения макрофаги резидентов в неповрежденной плоской листовых заготовок желудка мыши. Это позволило нам сравнить АТФ вызывал Са 2+ ([Ca 2 +] <суб> я) в макрофагах, расположенных в слоях гладких мышц до и после нанесения никотина. Кроме того, мы использовали несколько антагонистов с известными преференциях для конкретных подразделений нАХР, с тем чтобы обеспечить дальнейшее механистических понимание роли рецептора никотина, выражающих макрофаги для CAIP в кишечнике. Эти фармакологические данные были подтверждены с помощью иммуногистохимии. И, наконец, мы проанализировали долю макрофагов, которые находятся в непосредственной близости от холинергических нервных волокон.
Заявление по этике
<р> Вся работа мышь была проведена в соответствии с немецкими руководящими принципами для ухода за животными и благосостояния (Deutsches Tierschutzgesetz) и утвержден Баварской государственной комиссии по вопросам этики (Regierung Верхней Баварии, который служит по уходу и использованию комитета Institutional для Technische Universität München) в соответствии с § 4 и §11 Deutsches Tierschutzgesetz под номером ссылки 32 -568-2.
образцы тканей
<р> Мужчина 12-16 недель мышей C57BL /6 (Charles River, Sulzfeld, Германия) были убиты путем смещения шейных позвонков. Желудок был собран в ледяной Кребса буфере, содержащем (в мМ) 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl <югу> 2 6 H <югу> 2O, 1.2 NaH <суб> 2PO <суб> 4, 25 NaHCO <суб> 3, 2,5 CaCl <суб> 2 2 Н <суб> 2O и 11 глюкозы и рН доводили до 7,4. Желудок был открыт вдоль большой кривизны и промывали охлажденным льдом Кребса. При микроскопическом инспекции, желудок был прижат вниз на Sylgard блюдо и слизистую оболочку и подслизистую были тщательно удалены. Во время диссекции, ткань непрерывно перфузию льдом раствор Кребса, чтобы обеспечить жизнеспособность ткани. Только передняя или задняя половина желудка была приколота на маленьком Sylgard кольцо с центральным отверстием 100 х 200 мм 2.
стеки изображений для количественного анализа с использованием цели x63 были отсканированы с разрешением XY 1024 × 1024, которая охватывает территорию площадью 95,5 × 95,5 мкм 2. Первый и последний оптические срезы были взяты в верхней и нижней части наружной поверхности макрофага. Оптическая глубина каждого среза была 900 нм. Два последовательных ломтиков перекрыта для 500 нм. Как правило, между 9 и 16 ломтиков были получены в результате глубину сканирования 3.2-6.0 мкм, содержащих от 1-3 макрофаги и VAChT положительных волокон пропуска через макрофаги. стеки изображения были проанализированы с помощью изображения J Pro.
<р> Изображения β 2 и А7 нАХР-меченых макрофагов были приняты с использованием цели x63 и отсканированы с разрешением XY 1024 × 1024, которая охватывает территорию площадью 95,5 × 95,5 мкм 2. Оптическая глубины изображения был 900 нм.
анализ данных и статистика
<р> максимальные относительные изменения флуоресценции (Δ F /F) в ответ на было выражено введение АТФ как увеличение выше базальной флуоресценции% перед введением АТФ. Статистический анализ проводили с Sigma Plot 9.0 (Systat Software Inc, Erkrath, Германия). Данные представлены в виде усов участков с медианой и 25 й и 75 й процентили, а также 10 и 90 й процентили. Не нормально распределенные данные спаренные были проанализированы Критерий Уилкоксона. Различия считались статистически значимыми при P
&л; 0.05. N
Числа, приведенные в скобках указывают число макрофагов /тканей изученные, т.е. результат, основанный на записях 20 макрофагов в тканях 5 (равное 5 животных) представлена в виде (20/5).
Результаты
Пространственная взаимосвязь между резидентных макрофагов тканей и холинергических варикоз в желудке мыши
<р> Мы использовали конфокальной микроскопии для оценки близости между F4 /80-положительных макрофагов и VAChT-положительных варикозного холинергических нервных волокон в желудке мыши (Рис. 1А) Детальный анализ показал, что 83% из 41 исследованных макрофагами расположены в пределах 900 нм, по меньшей мере, один варикозным холинергические нервных волокон (рис 1B-C).
Microejection АТФ вызывало сильное, быстрое начало [Са 2 +] <подразделам> я переходная в макрофагах, которые достигли своего пика на 8-10 сек после нанесения с последующим медленным возвращением к исходным [Са 2 +] <суб> I уровни (рис 2A и Movie S1). Так как не всегда было полное восстановление к исходному уровню в течение периода записи, максимальная [Са 2 +] <суб> я сигнал использовался для анализа всех экспериментов. Ни один тахифилаксии не наблюдалось, так как максимальная амплитуда [Са 2 +] <суб> I сигнал в ответ на второй введения АТФ, через 10 минут после первой, не отличалась от исходного максимального ответа (Фигура 2В).
влияние никотина на [Са 2 +] <суб> I сигналы в ткани резидентными макрофагами
<р> Для изучения влияния никотина на АТФ вызвавший [Са 2 +] <суб> I сигналы мы microejected никотин в течение 10 сек и сразу же вновь применен АТФ на том же регионе. Один рационально использовать никотин в качестве селективного, Неискаженный нАХР агониста имитировать никотиновую активацию рецептора путем высвобождение ацетилхолина из холинергических нейронов. Анализируя изменения в [Са 2 +] <суб> я во всех макрофагов показало, что никотин значительно снижается АТФ вызывал [Са 2 +] <суб> I сигналы (рис 2D и F). Более детальный анализ влияния никотина на АТФ-индуцированной [Са 2 +] <суб> I Переходные процессы выявлены три популяции макрофагов (рис 2D-G). Никотин на 10 и 100 мкМ уменьшал АТФ-вызываемую [Са 2 +] <югу> I сигналы в 55% и 65% макрофагов, соответственно. [Са 2 +] <суб> я сигнал оставался неизменным в 36% и 28% макрофагов после применения 10 мкМ и 100 мкМ никотина соответственно. В небольшой группе, 10 мкМ и 100 мкМ никотина усиливал АТФ-вызванных [Са 2 +] <суб> я отклика (9% и 7% макрофагов, соответственно).
<Р> Чтобы избежать любой смещения дальнейший анализ основан на никотиновые воздействия на всех макрофагов, независимых от индуцированных ли АТФ [Са 2 +] <суб> я сигнал уменьшается, увеличивается или без изменений.
Роль нейронов в никотиновой вызванных ослабление активации макрофагов
<р> Никотин непосредственно активирует нейроны энтеральной и мы рассмотрели возможность, что активация близкого по нейронов мышечной оболочки кишечника способствует ослабленным [Са 2 +] <подразделам> I ответов в макрофагах. Мы не нашли никаких доказательств для такого косвенного тормозящего пути, так как ослабление АТФ [Са вызывал 2 +] <суб> я сигнал от никотина остается в присутствии тетродотоксин (рис 2C). Следует отметить, однако, что доля тех макрофагов, где никотин не изменяло АТФ вызывал [Са 2 +] <суб> I сигналы были резко сократилось (28% против 6%). В то же время, макрофаги, в которых никотин ингибируется или потенциирующие АТФ вызывала [Са 2 +] I сигналы увеличилась с 65% до 71% и от 7% до 23%, соответственно.
Маркировку β 2, но не А7 Nachr в ткани резидентных макрофагов
Для того, чтобы предоставить дополнительные доказательства причастности β 2 нАХР но не А7 нАХР в тормозящее влияние никотина на АТФ-Са [вызывал 2 +] были выполнены <суб> I ответы, иммуногистохимическое маркировка В2- Nachr и жизненно важную маркировку А7 нАХР путем ABGT в резидентных макрофагов желудка мышечной (Рисунок 4). Большинство резидентов макрофагов желудка были мышечной Nachr β 2-иммунореактивных (рис 4а), поддерживающий наблюдаемое антагонистическое действие DHBE на никотиновой ингибирования реакций АТФ. Используемое антитело для В2- Nachr специфичен из-за отсутствия В2- Nachr иммунореактивности в β 2 нАХР нокаутных мышей (рис 4В).
<Р> Vital маркировка А7 нАХР по ABGT выявил отсутствие А7 нАХР в резидентных макрофагов ткани в желудок мыши (рис 4C), В отличие от этого, кишечные макрофаги метили ABGT (рис 4D). Отсутствие А7 нАХР в желудке мышечной резидентных макрофагов подтвердили отсутствие антагонизма А7 Nachr-предпочитая блокаторы ABGT и MLA на тормозящее воздействие никотина на АТФ вызывал [Са 2 +] <суб> Я ответы в этих клетках.
Обсуждение
на сегодняшний день влияние никотина было исследовано только в изолированных макрофагах или макрофагов клеточных линий. Здесь мы разработали в пробирке
модель желудка мыши мышц-мышечной оболочки кишечника препарата сплетение для изучения влияния никотина на резидентных макрофагов ткани в их естественной среде обитания. Это настоящее исследование, поэтому первым, чтобы показать, что никотин непосредственно ингибирует активацию макрофагов ткани через β 2 субъединицей, содержащей Nachr и, таким образом, обеспечивает основу для функциональной сигнализации между холинергических нейронов и макрофагов в кишечнике. Наш вывод подтверждается несколькими линиями доказательств. Во-первых, АТФ вызывала [Са 2 +] <суб> I Переходные процессы в макрофагах значительно снижается под действием никотина, даже в присутствии нервного блокатора тетродотоксин. Во-вторых, ослабление никотин индуцированных реакций АТФ в макрофагах было отменено DHBE, но не гексаметония, мекамиламина, ABGT или MLA. Фармакологические результаты были поддержаны демонстрации β 2-Позитив но ABGT-отрицательных нАХР субъединиц на желудочную макрофагов. В-третьих, большинство макрофагов в непосредственной близости от варикозного расширения холинергических нервных волокон. Аналогичная близость макрофагов к нервных волокон наблюдалась в кишечной мышечной крысы [3].
<Р> Наш критерий, используемый для определения непосредственной близости между макрофагами и холинергических нервных волокон (900 нм расстояние) согласуется с концепцией внесинаптического коммуникации , В соответствии с этой концепцией диффузия на основе передачи объема может происходить при 100 нм до мкм расстояния между источником и мишенью [19]. Мы предполагаем, что большинство, если не все, холинергические нервы в непосредственной близости от макрофагов возник из мышечной оболочки кишечника тел нервных клеток, основанные на предыдущем наблюдении, что блуждающие волокна не контактируют кишечные макрофаги резидентные [3], Это также подтверждается находками, что желудочный блуждающего эфферентные волокна почти исключительно заканчиваются кишечно ганглиев [20], где они активируют большинство нейронов через мышечной оболочки кишечника никотиновых рецепторов [15].
<р> CAIP представляет собой физиологическую систему контроля активации макрофагов при воспалительных условиях. Противовоспалительный эффект активации CAIP было показано <ЕМ> В естественных условиях Ру по блуждающего нерва в мышиных моделях сепсиса и послеоперационной непроходимости [2,3] и в пробирке Ру по никотиновой введения изолированным , липополисахарида -stimulated макрофаги [1-4,21]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что никотин уменьшил АТФ-индуцированное увеличение внутриклеточного Са 2+ в резидентных макрофагов в желудке. Интересно, что этот эффект был отменено нАХР β 2 субъединицы предпочитая антагонист DHBE предполагая причастность этой субъединицы в никотиновой опосредованной модуляции резидентных макрофагов. Это наблюдение согласуется с нашим предыдущим выводом, что DHBE обращенно никотин-индуцированного ингибирования фактора некроза опухоли-альфа (TNF-alpha) высвобождения и повышение фагоцитоза в изолированных макрофагах [6]. В линии, продукция цитокинов из линии клеток нейробластомы человека, стабильно трансфицированные α4β2 нАХР значительно снижается никотиновой предварительной обработки [22]. Хотя эти данные свидетельствуют о том, что α4β2 nAChRs может опосредовать влияние никотина на АТФ-индуцированное увеличение внутриклеточного Са 2+, последние данные свидетельствуют о том, что β 2 субъединицы также могут собираться с другими альфа субъединицы, в том числе А7 субъединиц. В недавней публикации обсуждают электрофизиологические свойства α7β2 нАХР экспрессируется в эпителиальных клеточных линиях человека, показали, что низкие концентрации DHBE противодействует α7β2 нАХР но не А7 Nachr [16]. Эти и другие данные о фармакологическом профиле DHBE бы предположить, что DHBE является весьма селективным антагонистом β 2 Nachr но достоверно не дискриминировать между различными собраниями а3, или α 4 β 2 А7 с. Тем не менее, наша иммуногистохимическое и жизненно маркировка желудочных резидентных макрофагов не способствуют вовлечению А7 нАХР потому, что желудочные макрофаги не метили ABGT но выразил Nachr субъединицу β 2.
<р> Тем не менее, мы выбираем довольно консервативной интерпретации наших данных и сделать вывод, что β 2 Nachr критически участвуют в никотиновой ингибирования активности макрофагов, хотя вполне вероятно, что при концентрации, используемой в нашем исследовании DHBE предпочтительно блокирует α4β2 нАХР. Наш препарат идеально подходит для решения в будущих исследованиях возможного вклада α7β2 нАХР, исследуя влияние никотина в резидентных макрофагов ткани от А7 нАХР, β 2 Nachr и α7β2 Nachr двойных мышей нокаут-системе. Подобные стратегии должны быть использованы для изучения значимости с α4β2 нАХР.
<Р> Важно отметить, что антагонистическое действие DHBE не является селективным для макрофагов как DHBE, как гексаметония и мекамиламина, также блокирует никотиновые синапсы в желудочном нейронов мышечной оболочки кишечника [15]. Тем не менее, никотиновые рецепторы на макрофагах должны обладать различными свойствами, чем те, в кишечно нейронов, так как ни гексаметони, ни Mecamylamine вспять никотина индуцированный ослабление АТФ-вызвали ответы макрофагов. Гексаметония и Mecamylamine оказывают свои действия закупоривания пор никотиновой канала [23-25]. Их неспособность переломить никотина ингибирование макрофагов может предполагать существование нетипичной нАХР в макрофагах. Действительно, запись Ca 2+ в ответ на приема никотина показали увеличение [Са 2 +] <суб> я только 13% макрофагов (6 из 45 макрофагах, данные не приведены). Это население значительно меньше, что доля макрофагов, в которых никотин модулировавшую АТФ вызывала [Са 2 +] <суб> I.
<р> Обильные данные свидетельствуют о том, что α7 нАХР играет решающую роль в снижении никотина индуцированное макрофагами продукции цитокинов [2,3,6,26]. Ранее мы действительно, показали, что никотин не удалось снизить выработку ФНО-альфа в перитонеальных макрофагах α7 нАХР нокаутных мышей [6], в то время как противовоспалительный эффект в тонкой кишке стимуляции блуждающего нерва в нашей модели послеоперационной непроходимости теряется в них мышей KO [4]. В настоящем исследовании, однако, влияние никотина на АТФ-индуцированной активации макрофагов не был блокирован А7 нАХР, предпочитающего блокаторы ABGT и ГНД, выступая против участия А7 nAChRs. Это дополнительно подтверждается отсутствием маркировки желудка макрофагов мышечной А7 нАХР-предпочитая альфа-бунгаротоксина. В кишечнике, тем не менее, мы сделали наблюдать альфа-бунгаротоксина положительные меченые макрофаги [мышечная 4, и это исследование], с указанием конкретных регионов различия в фенотипе этих иммунных клеток.
<Р> Несмотря на то очевидное отсутствие ABGT чувствительных α7 нАХР в нашем исследовании, представляется противоречащим наших предыдущих выводов, мы вполне уверены, что эти данные не из-за неспособности ABGT конкурировать за сайт связывания в той же концентрации, используемой в нашем исследовании блоков нейронная α7 нАХР в головном мозге и в
Ученые превращают кровь группы A в универсальную кровь типа O,
Глицирризиновая кислота как кандидат в лекарство от COVID-19
Вакцинация против ротавируса не связана с риском сахарного диабета 1 типа
Анализ крови на микробную ДНК может предупредить о раке
Гигиена полости рта и тяжесть COVID-19 - связь
Бактерии в родовых путях снижают риск рака яичников
Использование FLUOstar Omega для изучения новых кишечных бактерий, которые могут влиять на наше здоровье
Группа микробной биологии и метагеномики Института диамантина Квинслендского университета использует микропланшетный ридер BMG LABTECH FLUOstar Omega для разработки новых методов изучения микробиома к
Отметка потенциальных молекулярных предикторов ответа на биологическую терапию при язвенном колите
Некоторые люди, страдающие заболеваниями кишечника, такими как язвенный колит, не реагируют на традиционно используемые биологические методы лечения. В таких случаях, персонализированный прогноз терап
Глицирризиновая кислота как кандидат в лекарство от COVID-19
Терапии для противодействия ущербу, причиненному тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), были немногочисленными и далекими друг от друга, несмотря на усилия по