PLoS ONE: Nikotin slabi Aktivacija tkiva rezidentnim makrofagima u miša želuca kroz P2 razgradnja Receptor

Sažetak pregled

Pozadina pregled

kolinergički protuupalno put je endogeni mehanizam kojim autonomni živčani sustav umanjuje aktiviranje makrofaga preko nikotinske receptore za acetilkolin (nAChR). Ovaj koncept je, međutim, nije se pokazalo na staničnoj razini u zdravog tkiva. U tu svrhu, mi smo proučavali učinak nikotina na aktivaciju rezidentnih makrofaga u pripremi miša želuca pomoću kalcijevog slike. Pregled

Metode

Kalcij prijelazne ([Ca ^{2 +] _{i) u rezidentnim makrofagima snimljeni su u preparatu mišu želuca sadrži myenteric plexus i mišićnih slojeva Fluo-4. Aktivaciju makrofaga postignuta je žarišna lisnato uprave ATP-a. Učinci nikotina na aktivaciju makrofaga su ocijenjeni i nAChR uključeni su farmakološki karakterizirani. Blizina kolinergičkih živaca u makrofage je kvantificirana konfokalnom mikroskopijom. Izražavanje P2 i α7 nAChR je procijenjena P2 imunohistokemijski i fluorofornoj-tagged a-bungarotoxin pregled}}

Rezultati pregled

U 83% makrofaga kolinergički proširenih živčana vlakna su otkrivene na udaljenosti. ≪ 900nm. ATP inducirano [Ca ^{2 +] _{i povećanje je bila značajno inhibirana s 65% ili 55% od strane makrofaga 100 uM ili 10 uM, odnosno nikotina. Ovaj inhibitorni učinak je obrnut od P2 nAChR radije antagonista dihidro-P-eryhtroidine ali ne heksametonij (neselektivni nAChR-antagonist) mecamylamine (α3β4 nAChR-preferirajući antagonista), α-bungarotoxin ili methyllycaconitine (oba α7 antagonist nAChR-preferirajući ). Makrofagima u želucu izraziti β2 ali ne α7 nAChR na razini proteina, dok su one u crijevima izraziti obje podjedinice receptora. Pregled}}

Zaključak pregled

Ova studija je prva na pregled situ pregled demonstraciju inhibicije aktivacije makrofaga nikotin sugerirajući funkcionalne signala između kolinergičkih neurona i makrofaga u želucu. Podaci pokazuju da je β2 podgrupu nAChR je kritički uključen u nikotinom inducirane inhibicije tih rezidentnih makrofaga pregled

Izvor:. Nemethova A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nikotin slabi Aktivacija tkiva rezidentnim makrofagima u miša želuca kroz β2 razgradnja receptora. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10,1371 /journal.pone.0079264 pregled

Urednik: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, United States of America pregled

Primljeno: 10. lipnja 2013. godine; Prihvaćeno: 26. rujna 2013; Objavljeno: 1. studenoga 2013 pregled

Copyright: © 2013 Nemethova et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane grant od Europske unije 7. okvirnog programa (izraz ipodd), Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 na MS; po priznanju Research Foundation Flanders (FWO, Odiseja i Hercules programa) na Geb, a po FWO postdoktorskog istraživačkog zajedništvo u PJG. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

u 2000. godini, Tracey i suradnici pokazali su da električna stimulacija živca vagusa pruža snažno protuupalno ulaz u slezeni. U mišjem modelu sepse, vagalna živčani podražaj (VNS) dovodi do smanjene proizvodnje upalnih citokina, učinak ovisi o α7 nikotinskih acetilkolinskih receptora (nAChR) [1,2]. Ovaj takozvani "kolinergički protuupalno put" (CAIP) djeluje kroz adrenergičkih slezene živce izradu sinaptičkih nalik kontakte s P2 adrenergičkih receptora-izražavanje slezene T-stanica. Naknadno otpuštanje acetilkolina (ACh) od ovih T-stanica odgovorno je za anti-upalni učinak vjerojatno interakcijom s α7nAChR-izražavanje makrofaga [1,2]. Pregled

U 2005. godini pružili smo dokaz da je CAIP također modulira imunološki sustav crijeva. U mišjem modelu postoperativni ileus, pokazali smo da VNS smanjen intestinalni upravljačkog inducirane upale tankog crijeva, koristan učinak ovisi o α7 nAChR, ali nezavisno od slezene [3,4]. Ovi podaci ukazuju na to da je crijevo imunološki sustav, a izravno je modulirana izlučivanja živčanih završetaka i /ili enteričke neurona. Kao stanovnik crijevne makrofagi su glavni igrači pokreću ovaj upalni odgovor [5], te stanice predstavljaju najvjerojatniji cilj je CAIP. In vitro ispitivanjima izolirane peritonealnih makrofaga periferne krvi mononuklearnih stanica izvedene iz makrofaga i makrofaga stanične linije doista su pokazali da obilno acetilkolin i nikotin smanjenje proizvodnje citokina [1-3,6,7] i povećati fagocitozu [6]. Ipak, ostaje upitno koliko je njihov fenotip jako podsjeća na rezidentnim makrofagima pogođene enteričkim neurona, a posebno kao izraz receptora u makrofagima može biti gore ili dolje regulirana kako su izolirani iz njihovog prirodnog okruženja. Dakle, odlučili smo razviti tehniku ​​koja će nam omogućiti da proučavaju učinak nikotina na aktivaciju rezidentnih makrofaga u njihovom prirodnom okruženju. Kao makrofaga aktiviraju ATP, poznati signal za opasnost za stanice imunološkog sustava [8,9], otkrivaju povećanje intracelularne Ca ^{2 +, žive Ca 2 + slikanje izabran je za proučavanje boravištem makrofage u netaknut stan list preparati miša želudac. To nam je omogućilo da usporedite ATP evocirani Ca 2 + prijelazne ([Ca 2 +] _{i) u makrofagima se nalaze u glatkim slojevima mišića prije i nakon primjene nikotina. Mi i dalje koristio nekoliko antagonisti s poznatim sklonostima za specifične nAChR podjedinica u cilju pružanja daljnje mehaničkog uvida u ulogama nikotinske receptore izražavaju makrofage za CAIP u crijevima. Ove farmakološke rezultati potvrđeni su imunohistokemijski. Konačno, analizirali smo dio rezidentnih makrofaga koji su u neposrednoj blizini hlinergičnih živčanih vlakana. Pregled}}

Metode

Izjava Etika pregled

Sve miša rad proveden je u skladu s njemačkim smjernicama za uzgoj životinja njegu i skrb (Deutsches Tierschutzgesetz) i odobren od strane bavarske državne etičkog povjerenstva (Regierung Oberbayern, koji služi kao njega i uporaba odbora Institucionalno za Technische Universität München) prema § 4 i §11 Deutsches Tierschutzgesetz pod poslovnim brojem 32 -568-2. pregled

uzorci tkiva

Muški 12-16 tjedana C57BL /6 miševa (Charles River, Sulzfeld, Njemačka) su ubijeni cervikalnom dislokacijom. Trbuh dobivenih u ledenom Krebsovom puferu koji sadrži (u mM) 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6H 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 25 NaHCOj 3, 2,5 CaClz 2 2 H 2O i glukoza 11, a pH podesi na 7,4. Želudac se otvoreni uzduž veće zakrivljenosti i isprani s ledeno hladnim Krebs. Mikroskopskim pregledom, želudac je zabodena dolje na sylgard posudu i sluznica i submukoza su pažljivo uklonjene. Tijekom disekcije tkivo kontinuirano perfundirali s ledeno hladnom Krebsovu otopinu kako bi se osiguralo vijabilnost tkiva. Samo prednji ili stražnji pola želuca je zabodena na malom sylgard prsten sa središnjim otvorom od 100 x 200 mm ^{2. Pregled}}

Kalcij slike pregled

Ravni lim miš u trbuhu su pripreme inkubirani u modificiranom Krebs-ovom otopinom (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaClz 2 2 'H sub> 2O i glukoza 11), koji sadrži 30 uM s fluorescentnim indikatorom kalcij Fluo 4-acetoksimetil (am) (Invitrogen), te 1,25 mM probenecida (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Njemačka) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi, u mraku i gaziran s karbogenom (95% O 2-5% CO 2). Sylgard je prsten montiran u komoru za snimanje s seroznog strane želuca okrenut prema dnu komore. Komora je spojen na perfuzijskog sustava kako bi se omogućilo kontinuirano perfuzija s karbogenom-oplinjava Krebsovoj otopini pri sobnoj temperaturi. Period ispiranja od 1,5 sata ostavljena prije početka eksperimenta. Komora tkivo je montiran na obrnuti epifluorescentnim mikroskopom (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Njemačka) koji je opremljen s visoke brzine crno-bijelog kamerom (Zeiss AxioCam HSM) i softvera (Zeiss Axio Vision 4.8) za nabavu i analizu. Fluo-4 je bio uzbuđen koristeći plavu svjetlost dioda (LED) LUXEON III (3W, 470nm dominantan valnu duljinu, Philips Lumiled Phillips Hambur, Njemačka) i fluo-4 signali su otkrivena s filter kocke F26-514 Bright Line FITC BP (ekscitacija: HC475 /35, dichroic: 499 emisija: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Njemačka) upotrebom x20 cilja (A-plan, NA = 0,25, Zeiss). Sustav izmjerene relativne promjene fluorescencije (Δ F /F) Fluo-4 praćenje promjena intracelularne kalcija ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + zabilježeni su prijelazne započinje 3 S Prije lokalne uprave ATP za ukupno 14,5 sekundi sa frame rate od 2 Hz i duljini izloženosti od 200 ms. pregled}}

Mi smo koristili ATP kao alat za aktivaciju makrofaga, budući da je signal za opasnost objavljen lokalno na mjestu upale [8,9], a od ATP je poznato da potiču lučenje citokina iz makrofaga putem povećanja [Ca ^{2 +] _{i [10-12]. pregled}}

ATP (Sigma-Aldrich) i nikotin (Sigma-Aldrich) lokalno se nanosi pomoću tlačnog izbacivanja iz dva mikropipeta s trajanjem od 200 ms i 10 sec, respektivno. Položaj mikropipeta osigurano da izbaci količine pokrivene identične regije tkiva. A mikropipete napunjene su s 1 mM ATP-a i 100 uM do 10 uM nikotina otopljenog u Krebs-ovoj otopini koja sadrži 1,25 mM probenecida. Prema ranije objavljenim kalibracijskih krivulja, procijenili smo da je bilo koja tvar primjenjuje tlak ejekcijskom impulsa će biti razrijeđena za oko 1:10 nakon što dosegne tkiva [13]. Pregled

Lokalna uprava ATP i nikotina dozvoljeno mjerenje odgovora na više dijelova (obično 4-5) u istom tkivu. Položaj regije u tkivu je dokumentirano koristeći koordinatni sustav prikazan na mobilnoj mikroskopa. Učinak nikotina na ATP inducirana kalcij prijelazne ponovno ispitivani su u istim područjima nakon dodatka različitih nAChR antagonista. Nakon snimanja odgovora, makrofagi su vizualizirani vitalnih inkubacijom tkiva s alofikocijaninom (APC) -labelled štakorski anti-mišji anti-F4 /80 antitijela (1: 250, eBioscience, Frankfurt, Njemačka) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi u mraku i gaziran s karbogenom. Tkivo je isprano na 15 minuta. Mikroskop faza je premještati kako bi pronašli regije u kojima je zabilježen iz. Slike s oznakom makrofaga dobiveni su upotrebom crvene Z-LED P4 (3,5 W) izvor uzbude (625 nm dominantna valna duljina, Seoul Semiconductor) i filter kocka F46-006 ET-filter (ekscitacija: ET 620/60, dichroic: 660, emisija: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Njemačka). Preklapanje od fluo-4 signala i slike F4 /80 pozitivnom makrofaga nam je omogućilo da analizirati odgovore u pojedinim makrofaga. Pregled

Imunohistokem pregled

Za naljepnice tkiva rezidentnih makrofaga, prvo smo koristili vitalnu etiketiranje protokol opisan gore. Tkivo je zatim fiksirano preko noći pri sobnoj temperaturi u otopinu koja je sadržavala 4% formaldehida i 0.2% pikrinske kiseline u 0.1 M fosfatnom puferu, isprani 3 x 10 minuta u fosfatnom puferu i konačno inkubirana tijekom 1 sata u otopini koja je sadržavala 0,5% Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% konjskog seruma otopljen u PBS (sve od tvrtke Sigma-Aldrich). Za označavanje kolinergičnu varicosities, tkivo se inkubira preko noći u otopini koja sadrži blokirajuće kozjeg anti-vezikularne acetilkolina transporter (VAChT, 1: 1000, Merck-Millipore, Darmstadt, Njemačka). Tkiva su isprani 3 x 10 min u PBS i inkubirani 1,5 - 2 sata u otopini koja sadrži blokirajuće Cy3-označenog anti-kozje antitijelo (1: 500; Dianova, Hamburg, Njemačka). Tkiva su isprane 3 x 10 minuta u PBS i stavljeni u anti-izbljeđivanja supstance (20% PBS /NaN 3, 80% glicerola), na poli-l-lizin-obložene stakalca i pokriju za gledanje. Pregled}

Označavanje p2 nAChR u rezidentnim makrofagima tkiva, sluznice bez želučane cijelih montiranje pripravcima iz divljeg tipa i p2 nAChR nokaut [14] su miševi fiksirani 10 minuta u ledeno hladnoj PBS otopine koja sadrži 4% paraformaldehida (PFA) , Tkiva su zatim isprani 2 x 10 min u PBS i inkubirani kroz 2 sata u PBS koji sadrži 1% bez proteaze Albumin goveđeg frakcija V albumina (BSA, Serva, Heidelberg, Njemačka) i 10% normalnom magaraca seruma (NDS, Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, SAD). Tkiva su inkubirani 36 sati s PBS koji sadrži 1% BSA, 5% NDS, štakorski anti-mišji F4 /80 (1: 500; klon BM8, BioLegend, San Diego, USA) i zečjeg protiv mišjeg β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Njemačka). Tkiva su isprane 3 x 10 min u PBS i inkubirane tijekom 1 sata u PBS koji sadrži 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor® 647-obilježenim kozjim anti-štakorski protutijelo (1: 1000, Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA) i Cy3-obilježeni magarećim anti-zečje antitijelo (1: 1000, Chemicon, Millipore, Billerica, USA). Tkiva su isprane 3 x 10 minuta u PBS i stavljeni u sporo izbljeđivanja reagensa (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Belgija) poli-L-lizinom obložene stakalca i pokriju za viewing.To oznaka α7nAChR u rezidentnim makrofagima tkiva, A komad miša želudac i tanko podvrgnuti su vitalni označavanje pomoću Cy5-obilježenog a-bungarotoxin (Invitrogen) na 0,1 ug /ml u RPMI 1640 mediju (Lonza, Basel, Švicarska) pri 4 ° C tijekom 15 min. [4] Tkiva su zatim fiksirane u PBS koji sadrži 4% PFA. Mukozi i submukozi su uklonjeni, a tkiva su inkubirani tijekom 2 sata u otopinu za blokiranje koja sadrži 1% BSA. Tkiva su zatim inkubirane 60 sata sa otopinom za blokiranje koji sadrži štakorski anti-mišji F4 /80 (klon BM8, BioLegend), a zatim 3 x 10 min ispiranja u PBS i inkubirane 1 sat u PBS koji sadrži 1% BSA i Cy3-obilježenim antitijela protiv štakora (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, SAD). Konačno, tkiva su isprane 3 x 10 minuta u PBS i stavljeni u sporo izbljeđivanja tvari na poli-L-lizinom obložene stakalca i pokriju za gledanje. Pregled

Konfokalna mikroskopija i analiza slike pregled

Slike su skupljene pomoću LSM 510 (Carl Zeiss) konfokalnog mikroskop s Plan-Neofluar x40 /1.3 ulje DIC i plan Apochromat X63 /1.4 ciljevima ulje DIC. Laserski valne duljine 543 nm i 633 nm korišten je za pobudu fluorofora Cy3 i Cy5 APC ili, respektivno. Cy3 i APC ili CY5 signali su detektirani pomoću filtra postavlja BP 565-615 IR i BP 650-710 IR, respektivno. pregled

Slika hrpe za kvantitativne analize pomoću cilj X63 je skeniran sa XY rezolucijom od 1024 × 1024 koji je pokrivao površinu od 95,5 × 95,5 lm ^{2. Prvi i posljednji optički odresci su uzeti na vrhu i na dnu vanjske površine makrofag. Optički dubina svaki rez je 900 nm. Dva uzastopna kriške preklapale za 500 nm. Obično, između 9 i 16 odresci su generirani rezultiralo dubine skeniranja od 3.2-6.0 um sadrže između 1-3 makrofaga i VAChT pozitivni vlakana križanja makrofaga. Slika hrpe analizirani su pomoću slika J Pro. Pregled}

Slike P2 i α7 nAChR obilježenih makrofagi su snimljene cilj X63 i skeniran s XY rezolucijom od 1024 × 1024 koji je pokrivao površinu od 95,5 × 95,5 lm ^{2. Optička dubina slika bila 900 nm. Pregled}

Pharmacology pregled

Blokiranje širenje akcijskog potencijala u neuronima, tetrodotoksin (Biotrend, Köln, Njemačka) doda se u perfuzijom Krebsovom otopinu na 1 uM. Za farmakološku karakterizaciju sljedeći nikotinske blokatori su dodani u Krebsovom otopinom perfuziju tkiva: 200 uM heksametonij (Sigma-Aldrich), 100 uM mecamylamine (Sigma-Aldrich), 10 uM dihidro-β-erythroidine (DHBE, Sigma-Aldrich) , 100 nM, 3 uM i 10 uM α-bungarotoxin (ABGT, Tocris) i 10 nM i 100 nM methyllycaconitine (MLA, Tocris). Heksametonij, mecamylamine i DHBE su ispitani u koncentracijama koje su u mogućnosti da ukine nikotinske brzo podražajna postsinaptička potencijale u zamorca myenteric neurona [15] .The korištenje od 10 nM i 100 nM MLA se temelji na koncentracijom koristi za blokiranje α7 podjedinica sadrži nAChR [16] i koristiti za inhibiciju sekrecije IL-6 s izoliranim peritonealni makrofagi [3]. pregled

analiza podataka i statistika pregled

maksimalne relativne promjene fluorescencije (Δ F /f) kao odgovor na ATP davanje izraženo je kao% povećanja gore bazalnoj fluorescenciji prije ATP davanje. Statističke analize provedene su sa Sigma Plot 9,0 (Systat Software Inc., Erkrath, Njemačka). Podaci su prikazani kao zalistak zemljišta sa medijana, a 25 ^{og i 75 og percentila kao i 10 -og i 90 -og percentila. Nije normalno distribuirani u paru podaci analizirani su i Wilcoxonovim rank test. Razlike su smatrane za statistički značajne na P izvoznici < 0.05. n pregled Brojevi dani u zagradama označavaju broj makrofaga /tkiva studirao, odnosno rezultat baziraju na snimkama 20 makrofaga u 5 tkiva (jednak 5 životinja) prikazan kao (20/5). Pregled}

Rezultati

Prostorni odnos između rezidentnih tkiva makrofaga i hlinergičnih proširenja žila u mišjim želucu pregled

Mi smo koristili konfokalne mikroskopije procijeniti blizinu između F4 /80-pozitivnih makrofaga i VAChT pozitivnih proširenih hlinergičnih živčanih vlakana u miša želucu (Slika 1A). Detaljna analiza pokazala je da 83% od 41 makrofaga proučavali su udaljeni 900 nm do najmanje jednu proširenih kolinergički živaca vlakana (Slika 1B-C). Pregled

Ponovljivost ATP evociranih [Ca ^{2 +] _{i signali u tkivu rezidentnim makrofagima}}

Microejection ATP inducirane jak, brz početak [Ca ^{2 +] _{i prolazno u makrofagima koja je dosegla svoj vrhunac 8-10 sekundi nakon primjene slijedi na sporom povratku u početku [Ca 2 +] i razina (Slika 2A i Film S1). Budući da nije uvijek bio potpuni oporavak na bazične razine tijekom razdoblja za snimanje, maksimalni [Ca 2 +] i signal je bio korišten za analizu svih pokusa. Ne tahifilaksija uočeno od maksimalne amplitude [Ca 2 +] i signal kao odgovor na drugom ATP uprave, 10 minuta nakon prve, ne razlikuje se od prvog maksimalnog odgovora (slika 2B). pregled}}

učinak nikotina na [Ca ^{2 +] _{I signali u tkiva rezidentni makrofagi}}

Kako bi se ispitalo djelovanje nikotina na ATP evocirani [Ca ^{2+] _{i signali smo microejected nikotina tijekom 10 sekundi i odmah ponovno nanijeti ATP na istoj regiji. Jedan racionalno korištenje nikotin kao selektivni ne-degradirani nAChR agonist je bilo oponašaju aktivaciju nikotinskih receptora prema otpuštanja acetilkolina iz kolinergičkih neurona. Analizirajući promjene u [Ca 2 +] ja u svim makrofaga pokazala da nikotin značajno smanjena ATP evocirani [Ca 2 +] i signali (Slika 2D i F). Detaljnija analiza učinaka nikotina na ATP-inducirane [Ca 2 +] i prijelazne otkrila tri populacija makrofaga (Slika 2D-G). Nikotin na 10 i 100 uM prigušuje ATP-evocirani [Ca 2 +] I signali u 55% i 65% makrofaga, respektivno. Izbornik [Ca 2 +] i signal je ostao nepromijenjen u 36% i 28% makrofaga nakon primjene 10 uM i 100 uM nikotina. U maloj podgrupi, 10 uM i 100 uM nikotin potencirati ATP-evocirani [Ca 2 +] i odgovor (9% i 7% makrofaga, respektivno). Pregled}}

Da bi se izbjegla bilo pristranost daljnja analiza se temelji na nikotin učinke na svim makrofaga, neovisno o bilo inducirano ATP [Ca ^{2 +] _{i signal je smanjena, povećana ili nepromijenjena. pregled}}

Uloga neurona u nikotinskom evocirani prigušenje aktivacije makrofaga Netlogu

Nikotin neposredno aktivira unutrašnje neurone i uputili smo se na mogućnost da aktivacija u neposrednoj blizini-po myenteric neurona pridonijeli usporeno [Ca ^{2 +] _{i odgovora u makrofagima. Nismo pronašli nijedan dokaz za takav posredan inhibitorni puta jer je prigušenje ATP-evocirane [Ca 2 +] i signal od nikotina ostao u prisustvu tetrodotoksina (Slika 2C). Važno je napomenuti da iako je udio onih makrofaga, gdje nikotin ne mijenja ATP evocirani [Ca 2 +] i signali su drastično smanjena (28% u odnosu na 6%). U isto vrijeme, makrofagi u kojem nikotin inhibirani ili potencira ATP evocirani [Ca 2 +] I signali povećao se s 65% na 71%, a od 7% do 23%, respektivno. Pregled}}

farmakološka karakterizacija inhibitorni učinak nikotina na tkivo Obitavajući makrofagi

aktivaciju makrofaga ATP i inhibiciju ATP odgovora 100 uM nikotina pouzdano zabilježen u svaku od 21 pripravaka koji su prikazani na slici 2F. To nam je omogućilo izvođenje antagonisti studije, bez potrebe za restudy inhibicijskog odgovora u tim makrofagima tretiranih antagonista. Osim toga, mi na taj način smanjio broj razdoblja snimanja na razinu koja nije kompromis jačinu signala i zajamčena ponovljive ATP odgovora. U želji da se prouči nAChR podjedinice su uključeni u inhibitorni učinak nikotina, testirali smo pet različitih blokatora s poznatim sklonostima podjedinica [17] (Slika 3). Inhibitorni učinak nikotina na ATP-evociranih [Ca ^{2 +] _{i odgovora ostala je nepromijenjena u prisustvu neselektivne ganglijski nAChR antagonističke heksametonij, a α3β4 nAChR-preferirajući antagonist mecamylamine ili α7 antagonista nAChR-preferirajući α-bungarotoxin i methyllycaconitine (Slika 3A). Međutim, β2 nAChR-preferirajući antagonist di-hidro-β-eryhtroidine obrnuo inhibicijski učinak nikotina na ATP-evocirane [Ca 2 +] I odgovora u makrofazima (Slika 3B). pregled}}

Iako smo se ABGT u koncentracijama koje su opisane pouzdano blokirati α7 nAChR u neuronima i izoliranih alveolarnih makrofaga [18], bili smo zabrinuti da svibanj biti u mogućnosti da antagonizira inhibitorni učinak nikotina zbog nepovoljnog tržišnog natjecanja na mjestu vezanja. Međutim, to se čini malo vjerojatno, jer čak i pri koncentraciji od 3 um i 10 um ABGT nije bio u mogućnosti da preokrenu inhibitorni učinak nikotina na ATP evocirani [Ca ^{2 +] _{i odgovore (slika 3A). ABGT također nije preokrenuti slabljenje potaknutog 10 uM nikotina (Slika 3C).}}

Označavanje P2 ali ne α7 nAChR u tkivu rezidentnim makrofagima

Kako bi osigurao dodatne dokaze za sudjelovanje P2 nAChR ali ne α7 nAChR u inhibitorni učinak nikotina na ATP-evocirane [Ca ^{2 +] su provedena _{i odgovori, imunohistokemijski označavanje p2 nAChR i ključnu označavanje α7 nAChR by ABGT u rezidentnim makrofagima želuca muscularis (Slika 4). Većina rezidentni makrofagi iz želuca muscularis su P2 nAChR-imunološki reaktivne (slika 4a) koji podržava uočeni antagonistički učinak DHBE na nikotinske inhibiciju ATP odgovora. Korištena protutijela za P2 nAChR je specifična zbog nepostojanja P2 nAChR imunoreaktivnost u P2 nAChR knockout miš (slika 4b). Pregled}}

Vital označavanje α7 nAChR strane ABGT otkrila odsustvo α7 nAChR u rezidentnih tkiva makrofaga u miša želudac (Slika 4C), u suprotnosti, crijevne makrofazi obilježene ABGT (slika 4D). Nedostatak α7 nAChR u želucu muscularis rezidentnim makrofagima potvrdilo odsutnost antagonizmom α7 nAChR-preferirajući blokatora ABGT i MLA na inhibitorni učinak nikotina na ATP izazvana [Ca ^{2 +] I odgovora u ovim stanicama. pregled}

Rasprava pregled

Do sada je učinak nikotina je ispitivan samo u izoliranim makrofagima ili makrofaga staničnim linijama. Ovdje smo razvili In vitro
model miša želuca pripreme pleksusa muscle-myenteric proučavati učinak nikotina na rezidentnih tkiva makrofaga u svom prirodnom okruženju. Ovo ispitivanje je, dakle, prvi pokazati da nikotin izravno inhibira aktivaciju rezidentnih tkiva makrofaga kroz P2 podjedinice nAChR i na taj način daje osnovu za funkcionalnu signalizaciju između kolinergičke neurone i makrofaga u crijevima. Naš zaključak je podržan od strane nekoliko linija dokaza. Prvo, ATP evocirani [Ca ^{2 +] _{i prijelazne u makrofagima se znatno smanjuje nikotin čak iu prisutnosti živaca bloker tetrodotoksina. Drugo, nikotinom izazvan prigušenje ATP odgovora u makrofage je obrnuta pomoću DHBE, ali ne heksametonij, mecamylamine, ABGT ili MLA. Farmakološka rezultati su podržani od strane demonstracija P2-positiv ali ABGT-negativnih nAChR podjedinica na želučane makrofaga. Treće, većina makrofaga su bili u neposrednoj blizini proširenih hlinergičnih živčanih vlakana. Slično blizina makrofaga do živčanih vlakana zabilježeno je u crijevnom muscularis štakora [3]. Pregled}}

Naš kriterij za definiranje blizina između makrofaga i hlinergičnih živčanih vlakana (900 nm udaljenosti) se slaže s konceptom ekstrasinaptičke komunikacije , Prema ovom konceptu difuzija temelji prijenos zvuk može se pojaviti na 100 nm do ĩm udaljenosti između izvora i cilja [19]. Pretpostavljamo da većina, ako ne i sve, hlinergičnih živaca u neposrednoj blizini do makrofaga potječe iz myenteric živčanih stanica tijela na temelju naših prethodnih promatranja da vagusa vlakna ne kontaktiraju crijevne rezidentni makrofagi [3], to je također podržan od otkrića da želučana vagalna eferentnih vlakna gotovo isključivo završavaju u gastroinertne ganglijima [20], gdje se aktivirao većinu myenteric neurona putem nikotinskih receptora [15]. pregled

CAIP predstavlja fiziološku sustav za kontrolu aktivaciju makrofaga tijekom upalnih stanja. Protuupalni učinak CAIP aktivacije Pokazano in vivo pregled po vagalnog stimulacijom živca u mišjim modelima sepse i postoperativni ileus [2,3] i in vitro pregled od nikotina davanja izolirane , lipopolisaharidnih -stimulated makrofagi [1-4,21]. U ovom istraživanju, otkrili smo da nikotin smanjuje na ATP-induciranu povećanje intracelularne Ca ^{2 + u rezidentnim makrofagima u želucu. Zanimljivo, ovo djelovanje reverzno je P2 nAChR podjedinica preferirajući antagonistom DHBE što ukazuje na uključenost ove podjedinice u nikotinom posredovane modulacijom rezidentnih makrofaga. Ovo opažanje je u skladu s našim prethodnim nalazom da DHBE poništenja nikotin-inducirana inhibicija faktora nekroze tumora-a (TNF-a) izdavanjem i povećanu fagocitozu u izoliranim peritonealni makrofagi [6]. U redu, proizvodnja citokina ljudskog neuroblastoma stanične linije stabilno transfektirane s α4β2 nAChR značajno smanjena od nikotina predobradom [22]. Iako ovi podaci ukazuju na to da α4β2 nAChR može posredovati učinak nikotina na ATP-inducirane povećanje intracelularne Ca 2 +, novi dokazi ukazuju da je P2 podjedinice može sastaviti s drugim su a podjedinica, uključujući α7 podjedinica. Nedavna publikacija raspravlja o elektroSziološke svojstva α7β2 nAChR izražena u ljudskim staničnim linijama epitelnih pokazala da niske koncentracije DHBE antagonizirati α7β2 nAChR, ali ne α7 nAChR [16]. Ove i druge podatke o farmakološki profil DHBE sugeriraju da DHBE je visoko selektivan antagonist P2 nAChR, ali se ne može pouzdano razlikovati između različitih sklopova α3, α4 ili α7 s P2. Međutim, naš imunohistokemijski i vitalni označavanje želučanih rezidentni makrofagi ne bi pogodovati uključenost α7 nAChR zbog želučanih makrofagi nisu obilježene ABGT, ali je izrazio P2 nAChR podjedinica. pregled}

Ipak, mi se odlučiti za prilično konzervativnom tumačenju naših podataka i zaključiti da je P2 nAChR se kritički uključen u nikotinu inhibicije makrofaga aktivnosti iako je vjerojatno da je u koncentraciji koja se koristi u našoj studija DHBE mogućnosti blokova α4β2 nAChR. Naše pripreme idealan je za rješavanje u budućim studijama mogući doprinos α7β2 nAChR ispitivanjem učinka nikotina u rezidentnih tkiva makrofaga iz α7 nAChR, P2 nAChR i α7β2 nAChR dvostruki knock-out miševi. Slične strategije treba koristiti za proučavanje značenja u α4β2 nAChR. Pregled

To je važno imati na umu da je antagonistička djelovanje DHBE nije selektivan za makrofage što DHBE, kao heksametonij i mecamylamine, također blokira nikotinske sinapsi u želučanom myenteric neuroni [15]. Ipak, nikotinski receptori na makrofagima moraju imati različita svojstva od onih u enteričke neuronima jer ni heksametonij, niti mecamylamine preinačio induciranog gušenja nikotin ATP-evociranih odgovora u makrofagima. Heksametonij i mecamylamine pokazuju svoje radnje začepljenja pore nikotinske kanala [23-25]. Njihova nesposobnost da preokrenu nikotina inhibicije makrofaga može sugerirati postojanje atipičnog nAChR u makrofagima. Doista, snimanje Ca ^{2 + pokazale su povećanu prijelazne odgovor na primjenu nikotina [Ca 2 +] _{i samo 13% od makrofaga (6 od 45 makrofaga, podaci nisu prikazani). Ova populacija je mnogo manji da je udio makrofaga u kojoj nikotin moduliranih ATP evocirani [Ca 2 +] i. pregled}}

Obilje dokaza sugerira da α7 nAChR ima ključnu ulogu u smanjenju izazvan nikotinom u proizvodnji makrofaga citokina [2,3,6,26]. Prethodno smo doista pokazale kako nikotin uspjela smanjiti proizvodnju TNF-a u peritonealnim makrofagima u α7 nAChR knockout miševa [6], dok anti-upalni učinak u tankom crijevu vagus stimulacijom živaca u našem modelu postoperativni ileus je izgubljen u tim KO miševi [4]. U ovom istraživanju, međutim, učinak nikotina na ATP-inducirane aktivacije makrofaga nije bio blokiran od strane α7 nAChR preferiraju blokatori ABGT i MLA, tvrdeći protiv uključivanja α7 nAChR. To dodatno podupire nedostatka označavanje želuca muscularis makrofagima α7 nAChR-preferirajući a-bungarotoxin. U crijevu, međutim, nismo promatrati a-bungarotoxin pozitivne označeni muscularis makrofage [4 i ovu studiju], što ukazuje na razlike u fenotipu ovih stanica imunološkog sustava na određenoj regiji. Pregled

Iako je očit nedostatak ABGT osjetljivih α7 nAChR u našoj studiji pojavljuje u suprotnosti s našim prethodnim nalazima, mi smo prilično sigurni da su ti podaci ne zbog nemogućnosti ABGT da se natječu za mjesta vezanja kao istoj koncentraciji koja se koristi u našim studijskim blokove neurona α7 nAChR u mozgu i