PLoS ONE: Nikotin Dämpft Aktivierung von Gewebe Makrophagen in der Maus Magen durch den β2 nikotinischen Acetylcholin Receptor

Abstrakt

Hintergrund

Die cholinerge antiinflammatorische Weg ist ein endogener Mechanismus, mit dem die vegetative Nervensystem dämpft Makrophagenaktivierung über nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR). Dieses Konzept ist jedoch nicht auf zellulärer Ebene in intaktem Gewebe nachgewiesen. Zu diesem Zweck haben wir die Wirkung von Nikotin auf die Aktivierung von Makrophagen in einem Maus-Magen Herstellung mittels Calcium Imaging untersucht.

Methoden

Calcium Transienten ([Ca ^{2 +] _{i) in Makrophagen wurden in einem Maus-Magen Zubereitung, die Plexus myentericus und Muskelschichten von Fluo-4 aufgezeichnet. Die Aktivierung von Makrophagen wurde durch fokale puff Verabreichung von ATP erreicht. Die Effekte von Nikotin auf die Aktivierung von Makrophagen wurden beurteilt und die nAChR wurde pharmakologisch gekennzeichnet beteiligt. Die Nähe der cholinergen Nerven zu Makrophagen wurde durch konfokale Mikroskopie quantifiziert. Die Expression von β2 und α7 nAChR wurde von β2 Immunhistochemie und Fluorophor-markierten α-Bungarotoxin ausgewertet}}

Ergebnisse |

In 83% der Makrophagen cholinergen Krampfadern Nervenfasern in Abständen <nachgewiesen wurden;. 900nm. Die ATP-induzierten [Ca ^{2 +] _{erhöhe ich in 65% oder 55% der Makrophagen durch 100 uM oder 10 uM Nikotin signifikant gehemmt sind. Diese hemmende Wirkung wurde durch die β2 nAChR bevorzugen Antagonist Dihydro-β-eryhtroidine umgekehrt aber nicht durch Hexamethonii (nicht-selektiven nAChR-Antagonist), Mecamylamin (α3β4 nAChR-bevorzugende Antagonist), α-Bungarotoxin oder Methyllycaconitine (beide α7 nAChR-bevorzugende Antagonist ). Makrophagen im Magen ausdrücken β2 aber nicht α7 nAChR auf Protein-Ebene, während die im Darm beide Rezeptoruntereinheiten exprimieren.}}

Fazit

Diese Studie ist die erste in
ist situ
Nachweis einer Inhibition der Makrophagenaktivierung durch Nikotin darauf hindeutet funktionelle Signalisierung zwischen cholinergen Neuronen und Makrophagen in den Magen. Die Daten legen nahe, dass die β2-Untereinheit des nAChR in der Nikotin-induzierte Hemmung dieser Makrophagen kritisch beteiligt ist

Citation. Nemethova A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nikotin Dämpft Aktivierung von Gewebe-Makrophagen in der Maus Magen durch den β2 nikotinischen Acetylcholinrezeptors. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10.1371 /journal.pone.0079264

Editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 10. Juni 2013 beginnen; Akzeptiert: 26. September 2013 beginnen; Veröffentlicht: 1. November 2013

Copyright: © 2013 Nemethova et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit durch einen Zuschuss von der Europäischen Union 7. Rahmenprogramm (IPODD), von der Deutschen Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 MS unterstützt wurde; durch einen Zuschuss von der Research Foundation Flanders (FWO, Odysseus und Hercules-Programm) GEB und durch eine FWO Postdoc Forschungsstipendiums PJG. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

im Jahr 2000 Tracey und Mitarbeiter zeigten, dass die elektrische Stimulation des Nervus vagus zur Milz eine stark entzündungshemmende Eingang verfügt. In einem Mausmodell für Sepsis, Vagusnerv-Stimulation (VNS) führte zu einer verringerten proinflammatorischen Cytokin-Produktion, ein Effekt, abhängig von α7 nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) [1,2]. Diese sogenannte "cholinergen entzündungshemmende Weg" (CAIP) betreibt über adrenergen Nerven splenic synaptic-like Kontakte mit β2-adrenergen Rezeptor-exprimierenden Milz-T-Zellen zu machen. Die anschließende Freisetzung von Acetylcholin (ACH) aus diesen T-Zellen ist verantwortlich für die entzündungshemmende Wirkung vermutlich mit α7nAChR-exprimierenden Makrophagen interagieren [1,2].

Im Jahr 2005 haben wir Beweise dafür, dass die CAIP auch moduliert die intestinale Immunsystem. In einem Mausmodell der postoperativen Ileus, zeigten wir, dass VNS intestinalen manipulations induzierte Entzündung des Dünndarms, eine vorteilhafte Wirkung in Abhängigkeit von α7-nAChR aber unabhängig von der Milz [3,4] reduziert. Diese Daten legen nahe, dass der Darm Immunsystem eher direkt durch Vagus-Nervenenden moduliert und /oder magensaftresistenten Neuronen. Als Resident Darm-Makrophagen die wichtigsten Akteure Auslösung dieser Entzündungsreaktion [5] sind, stellen diese Zellen das wahrscheinlichste Ziel des CAIP. In-vitro-Untersuchungen unter Verwendung von isolierten peritonealen Makrophagen, peripheren mononukleären Blutzellen stamm haben in der Tat Makrophagen oder Makrophagenzellinien reichlich demonstriert, dass Acetylcholin und Nikotin Zytokinproduktion reduzieren [1-3,6,7] und erhöhen Phagozytose [6]. Dennoch bleibt es fraglich, inwieweit ihre Phänotyp ähnelt wirklich, dass der Makrophagen durch Darm Neuronen betroffen, vor allem als Rezeptor-Expression in Makrophagen Up- sein kann oder herunterreguliert, wie sie aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert wurden. Deshalb haben wir beschlossen, eine Technik zu entwickeln, die uns die Wirkung von Nikotin auf die Aktivierung von Makrophagen in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren erlauben würde. Da Makrophagen durch ATP, einem bekannten Gefahrensignal für Immunzellen [8,9] aktiviert wird, eine Erhöhung der intrazellulären Ca offenbaren ^{2 +, leben Ca 2 + wurde Bildgebung die Makrophagen in intakten Wohnung zu studieren gewählt Blatt Maus Magen-Präparate. Dies erlaubte uns, ATP evozierte Ca 2 + Transienten ([Ca 2 +] _{i) in Makrophagen in den glatten Muskelschichten vor und nach der Anwendung von Nikotin befindet sich zu vergleichen. Wir weiterverwendet mehrere Antagonisten mit bekannten Vorlieben für bestimmte nAChR-Untereinheiten, um weitere mechanistische Einblicke in die Rolle von Nikotin-Rezeptor zur Verfügung zu stellen Makrophagen für die CAIP im Darm exprimiert. Diese pharmakologischen Befunde wurden durch Immunhistochemie bestätigt. Schließlich untersuchten wir den Anteil der Makrophagen, die in unmittelbarer Nähe von cholinergen Nervenfasern sind.}}

Methoden

Ethik Statement

Alle Maus Arbeit durchgeführt wurde, nach den deutschen Richtlinien für die Tierpflege und Tierschutz (Deutsches Tierschutzgesetz) und der bayerischen Staatsethikkommission (Regierung Oberbayern, die für die Technische Universität München als Institutional Care und Verwenden Committee dient) zugelassen nach § 4 und § 11 Deutsches Tierschutzgesetz unter der Nummer 32 -568-2.

Gewebeproben

Male 12-16 Wochen alt C57Bl /6-Mäuse (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) wurden durch Genickbruch getötet. Der Magen wurde in eiskaltem Krebs-Puffer enthält (in mM) 117 NaCl geerntet, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2 O, 1,2 NaH 2PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2 O und 11 Glukose und auf pH 7,4 eingestellt. Der Magen wurde entlang der größeren Krümmung und gewaschen mit eiskaltem Krebs eröffnet. Unter mikroskopische Untersuchung wurde der Magen auf einem Sylgard Gericht festgenagelt und die Mukosa und Submukosa wurden sorgfältig entfernt. Während der Präparation wurde das Gewebe kontinuierlich mit eiskaltem Krebs-Lösung perfundiert Lebensfähigkeit des Gewebes sicherzustellen. Nur der vordere oder hintere Hälfte des Magens auf einem kleinen Sylgard Ring mit einer zentralen Öffnung von 100 x 200 mm gepinnt ^2.}

Calcium Imaging

Flachblatt Maus Magen Vorbereitungen waren in modifizierter Krebs-Lösung inkubiert (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2 O, 1,2 NaH 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2 O und 11 glucose) 30 &mgr; M des fluoreszierenden Calciumindikator Fluo 4-acetoxymethyl (aM) (Invitrogen) und 1,25 mM Probenecid (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Deutschland) für 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln enthält, und mit Carbogen (- 5% CO 2 95% O 2) begast. Der Sylgard Ring wurde in der Aufzeichnungskammer mit Serosaseite des Magens gegenüber dem Boden der Kammer angebracht. Die Kammer wurde mit dem Perfusionssystem in Verbindung bei Raumtemperatur kontinuierliche Perfusion mit Carbogen begast-Krebs-Lösung zu ermöglichen. Eine Auswaschung Zeitraum von 1,5 h wurde vor Beginn des Experiments erlaubt. Die Gewebekammer wurde auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskope (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Deutschland) montiert mit einem High-Speed-Monochrom-Kamera ausgestattet (Zeiss AxioCam HSm) und Software (Zeiss AxioVision 4.8) zur Erfassung und Analyse. Fluo-4 war begeistert, ein blaues Licht emittierende Diode (LED) Luxeon III mit (3W, 470nm dominante Wellenlänge, Philips Lumiled, Phillips, Hambur, Deutschland) und Fluo-4-Signale wurden mit einem Filterwürfel F26-514 helle Linie FITC BP entdeckt (Anregung: HC475 /35, dichroitische: 499, Emission: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Deutschland) unter Verwendung von X20 Ziel (A-Plan, NA = 0,25, Zeiss). Das System gemessenen relativen Veränderungen in der Fluoreszenz (Δ F /F) von Fluo-4 Überwachung von Änderungen des intrazellulären Calciums ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + Transienten wurden beginnend aufgezeichnet 3 s vor die lokale Verabreichung von ATP für insgesamt 14,5 s mit einer Bildrate von 2 Hz und Belichtungszeit von 200 ms.}}

Wir verwendeten ATP als Werkzeug für die Makrophagenaktivierung, da es ein Gefahrensignal lokal an der Stelle der Entzündung freigesetzt wird, [8,9] und da ATP bekannt ist Zytokin-Sekretion aus Makrophagen durch Zunahme von [Ca induzieren ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) und Nikotin (Sigma-Aldrich) durch Druckausstoß lokal angewendet wurden aus zwei Mikro mit einer Dauer von 200 ms und 10 sec, respectively. Die Position der Mikropipetten dafür gesorgt, dass die ausgestoßenen Mengen identischen Gewebebereiche bedeckt. Die Mikropipetten wurden mit 1 mM ATP und 100 &mgr; M oder 10 &mgr; M Nikotin in Krebs-Lösung, enthaltend 1,25 mM Probenecid gelöst gefüllt. Nach den bisher veröffentlichten Kalibrierungskurven, schätzen wir, dass jeder durch Druckausstoßimpulse angelegt Substanz um etwa 01.10 verdünnt werden, sobald sie in das Gewebe erreicht [13].

Die lokale Verabreichung von ATP und Nikotin erlaubt Messung von Antworten an mehreren Regionen (typischerweise 4-5) in dem gleichen Gewebe. Die Lage der Bereiche in dem Gewebe wurde dokumentiert, das System auf dem Mobilmikroskoptisch angezeigte Koordinate verwendet wird. Die Wirkung von Nikotin auf ATP induzierte Calciumtransienten wurden erneut in den gleichen Regionen nach der Zugabe von verschiedenen nAChR-Antagonisten untersucht. (250, eBioscience, Frankfurt am Main, Deutschland 1) für 1 h bei Raumtemperatur in Nach Aufzeichnung der Antworten wurden Makrophagen durch vital Inkubation des Gewebes mit Allophycocyanin (APC) -markierten Ratten-Anti-Maus-Anti-F4 /80 Antikörper sichtbar gemacht die dunkle und mit Carbogen begast. Das Gewebe wurde für 15 Minuten gewaschen. Der Mikroskoptisch wurde neu positioniert die Regionen zu finden, wo wir aus aufgezeichnet. ET 620/60, dichroitische: Bilder von markierten Makrophagen wurden mit roten Z-LED P4 (3,5 W) Anregungsquelle (625 nm dominante Wellenlänge, Seoul Semiconductor) und Filterwürfel F46-006 ET-Filtersatz (Anregung erworben 660, Emission: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Deutschland). Die Überlagerung von Fluo-4 Signale und Bilder von F4 /80 positive Makrophagen konnten wir die Antworten in den einzelnen Makrophagen zu analysieren.

Immunhistochemie

Zur Kennzeichnung der Makrophagen Gewebe resident, verwendeten wir zunächst die entscheidende Kennzeichnung oben beschriebenen Protokoll. Das Gewebe wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur in einer Lösung, enthaltend 4% Formaldehyd und 0,2% Pikrinsäure in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert, gewässert 3 X 10 Minuten in Phosphatpuffer und schließlich für 1 h in einer Lösung, die 0,5% Triton X- inkubiert 100, 0,1% NaN _{3, 4% Pferdeserum in PBS gelöst (alle von Sigma-Aldrich). Um cholinerge varicosities etikettieren wurde das Gewebe über Nacht in der Blockierungslösung, enthaltend Ziege-anti-vesikulären Acetylcholintransporter inkubiert (VAChT; 1: 1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Deutschland). Die Gewebe wurden 3 × 10 min in PBS gewaschen und für 1,5 inkubiert - 2 h in der Blockierungslösung, enthaltend Cy3-markierten Anti-Ziege-Antikörper (1: 500; Dianova, Hamburg, Deutschland). Die Gewebe wurden 3 × 10 Minuten lang in PBS gewaschen und montiert in anti-fade Substanz (20% PBS /NaN 3, 80% Glycerol) auf poly-L-Lysin beschichtete Objektträger und einem Deckglas für die Anzeige.}

Um Magen-β2 nAChR in Gewebe Makrophagen, Schleimhaut freie ganze Berg Zubereitungen aus Wildtyp und ß2 nAChR Knock-out [14] Mäuse wurden für 10 min in eiskaltem PBS-Lösung, die 4% Paraformaldehyd (PFA) beschriften . Die Gewebe wurden gewaschen und dann 2 x 10 min in PBS gewaschen und für 2 h in PBS, enthaltend 1% proteasefreies Albumin Bovine Fraction V Albumin (BSA; Serva, Heidelberg, Deutschland) und 10% normalem Eselserum (NDS; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Die Gewebe wurden für 36 h inkubiert, mit PBS, enthaltend 1% BSA, 5% NDS, Ratte-anti-Maus-F4 /80 (1: 500; clone BM8, BioLegend, San Diego, USA) und Kaninchen-anti-Maus-β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Deutschland). Die Gewebe wurden 3 × 10 min in PBS gewaschen und für 1 h in PBS, enthaltend 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor ® 647-markiertem Ziege-anti-Ratte-Antikörper inkubiert (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA) und Cy3-markiertem Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, USA). Die Gewebe wurden 3 × 10 Minuten lang in PBS gewaschen und montiert in slow-Fade-Reagenz (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Belgien) auf poly-L-Lysin beschichtete Objektträger und für viewing.To Etikett α7nAChR in Gewebe Makrophagen deckt, a Stück Maus Magen und Ileum wurden für 15 min bei 0,1 &mgr; g /ml in RPMI 1640-Medium (Lonza, Basel, Schweiz) bei 4 ° C lebenswichtiger Kennzeichnung mittels Cy5-markierten α-Bungarotoxin (Invitrogen) unterzogen [4]. Die Gewebe wurden fixiert dann in PBS 4% PFA enthält. Die Mukosa und Submukosa wurden entfernt und die Gewebe wurden in Blocking-Lösung enthaltend 1% BSA für 2 h inkubiert. Die Gewebe wurden dann für 60 h inkubiert, in Blockierungslösung, enthaltend Ratten-anti-Maus-F4 /80 (Klon BM8, BioLegend), gefolgt von 3 x 10 min Waschen in PBS und inkubiert für 1 h in PBS, enthaltend 1% BSA und Cy3-markiertem anti-Ratte-Antikörper (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Schließlich wurden die Gewebe gewaschen 3 × 10 Minuten lang in PBS und montiert in Substanz langsam verblassen auf Poly-L-Lysin-beschichtete Folien und Eindecken für die Anzeige.

Die konfokale Mikroskopie und Bildanalyse

Die Bilder wurden mit einem LSM 510 (Carl Zeiss) konfokalen Mikroskop mit Plan-Neofluar x40 /1.3 Öl DIC und Planapochromat x63 /1.4 Öl DIC Ziele erworben. Laser mit Wellenlängen von 543 nm und 633 nm wurden für die Anregung der Fluorophore Cy3 und APC oder Cy5 verwendet, respectively. Cy3 und APC oder Cy5 Signale erkannt wurden unter Verwendung des Filters setzt BP 565-615 IR und BP 650-710 IR sind.

Bild-Stacks für die quantitative Analyse der x63 Ziel unter Verwendung wurden mit einer XY-Auflösung von 1024 × 1024 abgetastet, die eine Fläche von 95,5 × 95,5 &mgr; m bedeckt ^{2. Die erste und die letzte optische Scheiben wurden an der Oberseite und der Unterseite der Außenfläche eines Makrophagen aufgenommen. Die optische Tiefe von jeder Scheibe betrug 900 nm. Zwei aufeinanderfolgende Scheiben überlappt für 500 nm. Normalerweise zwischen 9 und 16 Scheiben wurden resultierenden erzeugt in einer Scantiefe von 3,2 bis 6,0 &mgr; m, die zwischen 1-3 Makrophagen und VAChT positive Fasern Kreuzung Makrophagen. Bildstapeln wurden unter Verwendung von Bild J Pro analysiert.}

Bilder von β2 und α7 nAChR-markierten Makrophagen wurden die x63 Ziel aufgenommen mit und gescannt mit einer XY-Auflösung von 1024 × 1024, die eine Fläche von 95,5 × 95,5 &mgr; m bedeckt ^{2. Die optische Tiefe der Bilder betrug 900 nm.}

Pharmakologie

Aktionspotential Ausbreitung in Neuronen zu blockieren, Tetrodotoxin (Biotrend, Köln, Deutschland) wurde bei 1 &mgr; M auf die Perfusion Krebs-Lösung gegeben. Für die pharmakologische Charakterisierung wurden folgende nikotinischen Blockern zur Krebs-Lösung gegeben Perfusion des Gewebes: 200 uM Hexamethonium (Sigma-Aldrich), 100 uM Mecamylamin (Sigma-Aldrich), 10 uM dihydro-β-erythroidine (DHBE; Sigma-Aldrich) , 100 nM, 3 um und 10 um α-Bungarotoxin (ABGT; Tocris) und 10 nM und 100 nM Methyllycaconitine (MLA, Tocris). Hexamethonium, Mecamylamin und DHBE wurden in den getesteten Konzentrationen in der Lage waren zu nikotinischen schnell exzitatorischen postsynaptischen Potentiale in guinea pig myentericus Neuronen abzuschaffen [15] .Die Verwendung von 10 nM und 100 nM MLA auf Konzentration basiert jeweils verwendeten α7 -Untereinheit zu blockieren nAChR enthaltend [16] und verwendet, IL-6-Sekretion aus isolierten peritoneale Makrophagen zu inhibieren [3].

Datenanalyse und Statistik

Die maximale relative Veränderungen in der Fluoreszenz (Δ F /F) als Antwort auf ATP Verwaltung wurde als% Anstieg über basale Fluoreszenz vor ATP Verabreichung ausgedrückt. Die statistischen Analysen wurden mit Sigma Plot 9.0 (Systat Software Inc, Erkrath, Deutschland) durchgeführt. Die Daten werden als Whisker-Plots mit dem Median präsentiert und die 25 ^{th und 75 Perzentile sowie die 10 th und 90 Perzentile. Nicht normal verteilt gepaarte Daten analysiert wurden von der Wilcoxon-Rank-Test unterzeichnet. Unterschiede waren statistisch signifikant betrachtet in P
< 0,05. N
in Klammern angegebenen Zahlen zeigen Zahlen von Makrophagen /Gewebe untersucht, dh ein Ergebnis basierend auf den Aufzeichnungen von 20 Makrophagen in 5 Geweben (gleich 5 Tiere) als (20/5) dargestellt.}

Ergebnisse |

räumliche Beziehung zwischen Gewebe Makrophagen und cholinergen Varikositäten in Maus Magen

Wir haben die konfokale Mikroskopie, die die Umgebung zwischen F4 /80-positive Makrophagen und VAChT-positive Krampf cholinergen Nervenfasern zu beurteilen in der Maus Magen (1A). Eine detaillierte Analyse ergab, dass 83% der 41 untersuchten Makrophagen befinden sich innerhalb von 900 nm bis mindestens einen Krampf cholinergen Nervenfaser (Abbildung 1B-C).

Die Reproduzierbarkeit von ATP evozierte [Ca 2 +] i-Signale in Gewebe Makrophagen

Microejection von ATP induziert ein starkes, schnelles Einsetzen [Ca ^{2 +] _{i transient in Makrophagen, die ihren Höhepunkt 8-10 Sekunden nach der Anwendung erreicht, gefolgt durch eine langsame Rückkehr zu den Ausgangsdaten [Ca 2 +] i Ebenen (2A und Film-S1). Da es nicht immer vollständige Genesung auf das Ausgangsniveau während der Aufzeichnungsperiode war, die maximale [Ca 2 +] i wurde das Signal für die Analyse von allen Experimenten verwendet. Keine Tachyphylaxie wurde, da die maximale Amplitude beobachtet [Ca 2 +] i Signal in Reaktion auf eine zweite ATP Verabreichung 10 Minuten nach der ersten, nicht von der anfänglichen maximalen Antwort unterscheiden (2B).}}

Wirkung von Nikotin auf [Ca ^{2 +] _{i-Signale in Gewebe Makrophagen}}

Um die Wirkung von Nikotin auf die ATP-Studie hervorgerufen [Ca ^{2 +] _{i Signale, die wir microejected Nikotin für 10 Sekunden und sofort ATP auf derselben Region erneut angewandt. Eine rationale Nikotin als selektive, nicht-abgebauten nAChR-Agonisten zu verwenden, wurde durch die Freisetzung von Acetylcholin aus cholinergen Neuronen nikotinischen Rezeptoraktivierung zu imitieren. Die Analyse der Veränderungen in [Ca 2 +] i in allen Makrophagen zeigten, dass Nikotin reduziert signifikant die ATP-evozierte [Ca 2 +] i-Signale (2D und F). Eine detailliertere Analyse der Effekte von Nikotin auf ATP-induzierte [Ca 2 +] i Transienten ergab drei Populationen von Makrophagen (2D-G). Nikotin bei 10 und 100 uM abgeschwächte die ATP-evozierte [Ca 2 +] i Signale in 55% und 65% der Makrophagen, respectively. Die [Ca 2 +] I-Signal in 36% und 28% der Makrophagen nach der Applikation von 10 uM und 100 uM Nicotin, jeweils unverändert. In einer kleinen Untergruppe 10 um und 100 um Nikotin potenziert die ATP-evozierte [Ca 2 +] i-Antwort (9% und 7% der Makrophagen, respectively).}}

jeder zu vermeiden Bias weitere Analyse von Nikotin Auswirkungen auf alle Makrophagen unabhängig basiert, ob der ATP-induzierte [Ca ^{2 +] _{I-Signal verringert wurde, erhöht oder unverändert.}}

Rolle von Neuronen im nikotinischen evozierten Dämpfung der Aktivierung
Makrophagen

Nikotin aktiviert direkt magensaftresistenten Neuronen und wir angesprochen, die Möglichkeit, dass die Aktivierung von der Nähe von myentericus Neuronen auf die abgeschwächte [Ca ^{2 +] beigetragen _{i Antworten in Makrophagen. Wir fanden keinen Beweis für einen solchen indirekten Hemmstoff, weil die Dämpfung des ATP-evozierte [Ca 2 +] i Signal durch Nikotin blieb in Gegenwart von Tetrodotoxin (Abbildung 2C). Bemerkenswert ist jedoch, dass der Anteil dieser Makrophagen wo Nikotin nicht ATP veränderte evozierte [Ca 2 +] i Signale wurden dramatisch reduziert (28% gegenüber 6%). Zur gleichen Zeit, Makrophagen, in der evozierten Nikotin gehemmt oder potenziert ATP [Ca 2 +] i Signale von 65% auf 71% erhöht, und von 7% bis 23% betragen.}}

pharmakologische Charakterisierung der inhibitorischen Wirkung von Nikotin auf Gewebe Makrophagen

die Aktivierung von Makrophagen durch ATP und die Hemmung der ATP-Antwort von 100 &mgr; M Nikotin zuverlässig in jeder der 21 aufgenommen wurde Präparationen in 2F veranschaulicht. Dies erlaubte uns, Antagonisten Untersuchungen ohne die Notwendigkeit durchzuführen, die inhibitorische Reaktion in diesen Makrophagen mit den Antagonisten behandelt restudy. Außerdem konnten wir dadurch die Anzahl der Aufzeichnungszeiten auf ein Niveau, das nicht die Signalstärke und garantiert reproduzierbare ATP Reaktionen beeinträchtigen. Um die nAChR-Untereinheiten in der inhibitorischen Wirkung von Nikotin beteiligt zu untersuchen, testeten wir fünf verschiedenen Blockern mit bekannten Untereinheit Präferenzen [17] (Bild 3). Die hemmende Wirkung von Nikotin auf ATP-evozierte [Ca ^{2 +] _{i Reaktionen unverändert in Anwesenheit des nicht-selektiven ganglionic nAChR-Antagonisten Hexamethonium, die α3β4 nAChR-bevorzugende Antagonist Mecamylamin oder α7-nAChR-bevorzugende Antagonisten α-Bungarotoxin und Methyllycaconitine (3A). Jedoch umgekehrt das β2 nAChR-bevorzugende Antagonist di-hydro-β-eryhtroidine die inhibitorische Wirkung von Nikotin auf ATP-evozierte [Ca 2 +] i Antworten in Makrophagen (3B).}}

Obwohl verwendeten wir ABGT bei Konzentrationen, die beschrieben wurden, um zuverlässig α7-nAChR in Neuronen und isoliert Alveolarmakrophagen Block [18] Wir waren besorgt, dass es nicht in der Lage sein kann, den inhibitorischen Effekt von Nikotin zu antagonisieren aufgrund ungünstiger Wettbewerb an der Bindungsstelle. Dies scheint jedoch unwahrscheinlich, da selbst bei Konzentrationen von 3 uM und 10 uM ABGT nicht in der Lage war die inhibitorische Wirkung von Nikotin auf ATP umkehren evozierten [Ca ^{2 +] _{i Antworten (3A). ABGT hat umgekehrt auch nicht die Dämpfung von 10 &mgr; M Nikotin hervorgerufen (3C).}}

Die Markierung von β2 aber nicht nAChR a7 in Gewebe Makrophagen

zusätzliche Beweise für die Beteiligung von β2 nAChR Um aber nicht nAChR von α7 in die hemmende Wirkung von Nikotin auf die ATP-evozierte [Ca ^{2 +] _{i Antworten, immunhistochemischen Markierung von &bgr; 2 nAChR und vital Kennzeichnung von α7 nAChR durch ABGT in Makrophagen von Magen Muscularis durchgeführt wurden (Abbildung 4). Die Mehrheit der residenten Makrophagen von Magen muscularis wurden &bgr; 2 nAChR-immunoreaktive (4A) die beobachtete antagonistische Wirkung auf nikotinische DHBE Hemmung der ATP-Antworten zu unterstützen. Der verwendete Antikörper für nAChR &bgr; 2 spezifisch ist wegen der Abwesenheit von &bgr; 2 nAChR-Immunreaktivität in einem β2 nAChR-Knockout-Maus (4B).}}

Vital Kennzeichnung von α7-nAChR durch ABGT ergab Abwesenheit von α7-nAChR in Gewebe Makrophagen in die Maus Magen (4C), Im Gegensatz dazu wurden intestinalen Makrophagen durch ABGT (4D) markiert. Der Mangel an α7 nAChR im Magen muscularis Makrophagen bestätigte das Fehlen des Antagonismus von α7 nAChR-bevorzugende Blocker ABGT und MLA auf die hemmende Wirkung von Nikotin auf die ATP-evozierte [Ca ^{2 +] _{i Antworten in diesen Zellen.}}

Diskussion

Bis heute hat die Wirkung von Nikotin wurde nur in isolierten Makrophagen oder Makrophagen-Zelllinien untersucht. Hier haben wir eine In-vitro-
Modell der Maus Bauchmuskel-Plexus myentericus Vorbereitung entwickelt, um die Wirkung von Nikotin auf Gewebe Makrophagen in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Die vorliegende Studie ist daher die erste, dass Nikotin direkt Aktivierung nAChR hemmt zeigen Gewebe Makrophagen durch β2-Untereinheit enthält, und liefert damit die Grundlage für die funktionelle Signalisierung zwischen cholinergen Neuronen und Makrophagen im Darm. Unsere Schlussfolgerung ist durch mehrere Linien von Beweisen unterstützt. Erstens ATP evozierten [Ca ^{2 +] _{i Transienten in Makrophagen signifikant durch Nikotin selbst in Gegenwart des Nervs blocker Tetrodotoxin verringert. Zweitens wurde die nikotininduzierten Dämpfung von ATP Reaktionen in Makrophagen durch DHBE rückgängig gemacht, nicht aber durch Hexamethonium, Mecamylamin, ABGT oder MLA. Die pharmakologischen Befunde wurden durch die Demonstration von β2-positiv, aber ABGT negative nAChR-Untereinheiten auf die Magen-Makrophagen unterstützt. Drittens war die Mehrheit der Makrophagen in unmittelbarer Nähe von Krampfadern cholinergen Nervenfasern. Ähnliche Nähe von Makrophagen zu Nervenfasern wurde in den Rattendarm muscularis beobachtet [3].}}

verwendet Unser Kriterium Nähe zwischen Makrophagen und cholinergen Nervenfasern (900 nm Abstand) stimmt mit dem Konzept der extrasynaptischen Kommunikation zu definieren . Nach diesem Konzept ein diffusionsbasierte Volumendurchlässigkeit bei 100 nm bis &mgr; m Abstand zwischen der Quelle und dem Ziel [19] erfolgen. Wir gehen davon aus, dass die meisten, wenn nicht alle, cholinergen Nerven in unmittelbarer Nähe zu Makrophagen von myenteric neuronalen Zellkörpern entstanden auf der Grundlage unserer früheren Beobachtung, dass Vagusfasern nicht in Kontakt mit Darm-Makrophagen [3] Dies ist auch durch die Ergebnisse, dass Magen-Vagus unterstützt wird Efferenzen enden fast ausschließlich in magensaftresistenten Ganglien [20], wo sie die Mehrheit der myentericus Neuronen durch Nicotin-Rezeptoren [15] aktivieren.

Die CAIP stellt eine physiologische System Makrophagenaktivierung bei entzündlichen Bedingungen zu steuern. Die entzündungshemmende Wirkung von CAIP Aktivierung wurde isoliert gezeigt in vivo und Videos Vagusnervstimulation in Mausmodellen der Sepsis und postoperativen Ileus [2,3] und in vitro und Videos Nikotinverabreichung Lipopolysaccharid stimulierten Makrophagen [1-4,21]. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass Nikotin die ATP-induzierten Anstieg der intrazellulären Ca ^{2+ in Makrophagen im Magen reduziert. Interessanterweise wurde dieser Effekt durch die β2 nAChR-Untereinheit bevorzugen Antagonist DHBE was die Beteiligung dieser Untereinheit in der Nikotin-vermittelte Modulation der residenten Makrophagen umgekehrt. Diese Beobachtung ist konsistent mit unseren früheren Feststellung, dass DHBE Nikotin-induzierte Hemmung der Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) Freisetzung und erhöhte Phagocytose in isolierte peritoneale Makrophagen umgekehrt [6]. In Linie, Linie Zytokin-Produktion von humanen Neuroblastom-Zellen stabil mit α4β2 nAChR transfiziert wird wesentlich durch Nikotin Vorbehandlung reduziert [22]. Obwohl diese Daten nahe, dass α4β2 nAChRs kann die Wirkung von Nikotin auf den ATP-induzierte Anstieg der intrazellulären Ca vermitteln 2+ zeigt neuere Beweise, dass β2-Untereinheiten auch mit anderen α-Untereinheiten, einschließlich der α7-Untereinheiten zusammenstellen kann. Eine aktuelle Publikation zum Ausdruck gebrachten in humanen epithelialen Zelllinien zeigten die elektrophysiologischen Eigenschaften von α7β2 nAChR diskutieren, dass niedrige Konzentrationen von DHBE α7β2 nAChR antagonisiert aber nicht nAChR a7 [16]. Diese und andere Daten auf dem pharmakologischen Profil von DHBE würde vorschlagen, dass DHBE ein hoch selektiver Antagonist von &bgr; 2 nAChR ist, aber unterscheidet nicht zuverlässig zwischen verschiedenen Anordnungen von α3, α4 und β2 α7 mit. Aber unsere immunhistochemischen und vital Kennzeichnung von Magen-Makrophagen nicht Beteiligung von α7 nAChR begünstigen, weil Magen-Makrophagen nicht durch ABGT markiert wurden, aber die β2 nAChR-Untereinheit ausgedrückt.}

Dennoch entscheiden wir uns für eine eher konservative Interpretation unserer Daten und schließen daraus, dass nAChR β2 in Nikotin Hemmung der Makrophagenaktivität kritisch beteiligt, obwohl es wahrscheinlich ist, dass bei der Konzentration in unserer Studie DHBE verwendet vorzugsweise Blöcke α4β2 nAChR. Unsere Vorbereitung ist ideal in zukünftigen Studien den möglichen Beitrag von α7β2 nAChR zu adressieren geeignet durch die Wirkung von Nikotin im Gewebe Makrophagen von α7 nAChR untersuchen, &bgr; 2 nAChR und α7β2 nAChR Doppel-Knockout-Mäusen. Ähnliche Strategien sollten die Bedeutung eines α4β2 nAChR zu studieren verwendet werden.

Es ist wichtig, dass die antagonistische Wirkung von DHBE zu beachten, für Makrophagen als DHBE nicht selektiv ist, wie Hexamethonii und Mecamylamin, blockiert auch Nikotin Synapsen im Magen myentericus Neuronen [15]. Gleichwohl müssen die Nikotin-Rezeptoren auf Makrophagen besitzen andere Eigenschaften als in magensaftresistenten Neuronen, da weder Hexamethonii noch mecamylamine das Nikotin induzierte Dämpfung der Reversed ATP hervorgerufenen Reaktionen in Makrophagen. Hexamethonii und mecamylamine ihre Handlungen ausüben, indem sie die Pore des Nikotin Kanal verstopfen [23-25]. Ihre Unfähigkeit, die Nikotin Hemmung von Makrophagen umkehren kann die Existenz eines atypischen nAChR in Makrophagen vorschlagen. Tatsächlich Aufnahme von Ca ^{2 + Transienten in Reaktion auf Nikotinverabreichung erhöht ergab [Ca 2 +] _{in i nur 13% der Makrophagen (6 aus 45 Makrophagen, Daten nicht gezeigt). Diese Population ist viel kleiner, dass der Anteil von Makrophagen in denen Nikotin die ATP moduliert evozierten [Ca 2 +] i.}}

Viele Hinweise legen nahe, dass α7 nAChR spielt eine entscheidende Rolle bei der Nikotin-induzierte Reduktion der Makrophagen-Zytokin-Produktion [2,3,6,26]. Früher haben wir in der Tat gezeigt, dass Nikotin gescheiterten TNF-α-Produktion in peritonealen Makrophagen von α7-nAChR-knockout-Mäusen [6], während die entzündungshemmende Wirkung in den Dünndarm des Vagusnervstimulation in unserem Modell der postoperativen Ileus zu reduzieren, ist in diese verloren KO-Mäuse [4]. In der vorliegenden Studie ist jedoch die Wirkung von Nikotin auf die ATP-induzierte Aktivierung von Makrophagen wurde durch die α7 nAChR lieber Blocker ABGT und MLA nicht blockiert, mit dem Argument gegen die Beteiligung von α7 nAChR. Dies wird weiterhin durch das Fehlen von Markierung von Magen muscularis Makrophagen von α7-nAChR-bevorzugende α-Bungarotoxin unterstützt. Im Darm haben wir jedoch α-Bungarotoxin positiv markierten muscularis Makrophagen [4 und diese Studie] beobachten, regionsspezifische Unterschiede im Phänotyp dieser Immunzellen anzeigt.

Obwohl der offensichtliche Mangel an ABGT empfindlichen α7 nAChR in unserer Studie erscheint im Widerspruch zu unseren früheren Befunden, wir sind sehr zuversichtlich, dass diese Daten nicht aufgrund der Unfähigkeit von ABGT für die Bindungsstelle als die gleiche Konzentration in unserer Studie Blöcke neuronalen α7 nAChR im Gehirn verwendet, um im Wettbewerb und in isoliert Alveolarmakrophagen [18].

• PLoS ONE: Elektroakupunktur bei ST36 Verbessert die Magenentleerung und Rettungen Networks von interstitiellen Zellen von Cajal im Magen von diabetischen Ratten
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