PLOS NËMMEN: Nikotin Attenuates Activatiounscode vum Ray Residentepräiser Macrophages an der Mouse Mo duerch d'β2 Nicotinic Acetylcholine Receptor

Wat VerfÜgung

Background VerfÜgung

D'cholinergic anti-demagogesch Passerelle ass eng endogenous Mechanismus vun deenen der autonomic nervös System attenuates macrophage Aktivéierung via nicotinic acetylcholine kenne (nAChR). Dëst Konzept huet awer net op engem bewosst Niveau vun intakt Otemschwieregkeeten Gewise ginn. Fir dat Enn, hunn mir den Effet vun Nikotin op der Aktivatioun vun résident macrophages zu enger Maus Mo. Opbereedung vun heescht vun Kalzium Imaging studéiert. VerfÜgung

Method VerfÜgung

Kalzium transients ([Ca 2 +] _{i) an résident macrophages sech zu enger Maus Mo. Opbereedung wouvun myenteric plexus a Fleesch Schichten vun Fluo-4 opgeholl. Aktivatioun vun macrophages war vun Brennwäit Zigrette Administratioun vum ATP erreecht. D'Auswierkunge vun Nikotin op Aktivatioun vun macrophages sech bewäert an der nAChR war pharmacologically charakteriséiert Équipe. D'Atomkraaftwierk vu cholinergic Bank- zu macrophages war vun confocal microscopy laachen. Ausdrock vun β2 an α7 nAChR war vun β2 immunohistochemistry an fluorophore-afp ​​α-bungarotoxin bewäert VerfÜgung}

Resultater VerfÜgung

An 83% vun macrophages cholinergic Varicen Nerve Faseren um Distanzen &dra fonnt goufen;. 900nm. D'ATP entschlof [Ca 2 +] _{Erhéijung ech war zu 65% oder 55% vun macrophages vun 100μM oder 10μM Nikotin vill inhibited, bzw.. Dëst inhibitory Effekt war vun der β2 nAChR wéilt neien dihydro-β-eryhtroidine réckgängeg awer net vun hexamethonium (Net-selektiv nAChR-neien), mecamylamine (α3β4 nAChR-wéilt neien), α-bungarotoxin oder methyllycaconitine (souwuel α7 nAChR-wéilt neien ). Macrophages am Mo. auszedrécken β2 awer net α7 nAChR um FAQ Niveau, iwwerdeems déi am Daarm souwuel receptor subunits auszedrécken. VerfÜgung}

Conclusioun VerfÜgung

Dës Etude d'éischt zu VerfÜgung ass situ VerfÜgung Manifestatioun vun enger inhibition vun macrophage Aktivatioun vun Nikotin suggeréiert funktionell sécher tëscht cholinergic Zelle an macrophages an de Moo. D'Daten hindeit, datt d'β2 subunit vun der nAChR am Nikotin-entschlof inhibition vun dësen résident macrophages kritesch Équipe ass VerfÜgung

Fro:. Nemethova A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nikotin Attenuates Activatiounscode vum Ray Residentepräiser Macrophages an der Mouse Mo duerch d'β2 Nicotinic Acetylcholine Receptor. PLoS NËMMEN 8 (11): e79264. Doi: 10.1371 /journal.pone.0079264 VerfÜgung

Redakter: Yvette Tache, Universitéit vu Kalifornien, Los Angeles, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung

Arnaque: 10 Juni, 2013; Akzeptéiert: 26. September, 2013; Publizéiert: November 1, 2013 VerfÜgung

Copyright: © 2013 Nemethova et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dës Aarbecht duerch Subventiounen aus der Europäescher Unioun 7. Rummbedéngunge plangen (IPODD), déi Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 zu MS ënnerstëtzt gouf; duerch Subventiounen vun der Research Foundation Flandern (FWO, Odysseus an Hercules Programm) zu GEB, a vun engem FWO postdoctoral Fuerschung ënnerteneen ze PJG. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

am Joer 2000, Tracey an Luxlait bewisen, dass elektresch Stimulatioun vun der vagus Nerve der Mëlz engem mächtegst anti-demagogesch Input gëtt. An enger Maus Modell vun sepsis, vagal Nerve Stimulatioun (VNS) schéinen ofgeholl pro-demagogesch cytokine Produktioun, en Effekt ofhängeg op α7 nicotinic acetylcholine kenne (nAChRs) [1,2]. Dëse sougenannte "cholinergic anti-demagogesch Passerelle" (CAIP) bedreiwt duerch adrenergic splenic Bank- synaptic-wëll Kontakter mat β2 adrenergic receptor-ausdrécken splenic T-Zellen nees. Kierzunge release vun acetylcholine (ach) aus dësen T-Zellen ass responsabel fir d'Anti-demagogesch Effekt viraussiichtlech déi mat α7nAChR-ausdrécken macrophages proposéiert [1,2]. VerfÜgung

An 2005, da gëtt de Beweis, datt d'CAIP och modulates der intestinal immun System. An enger Maus Modell vun Thes ileus, awer mir dass VNS intestinal Manipulatioun-entschlof inflammation vun de klenge Daarm, engem virdeelhaft Effekt ofhängeg op α7 nAChR awer onofhängeg vun der Mëlz [3,4] reduzéiert. Dës Donnéeë hindeit, datt d'GUT immun System ass zimlech direkt vun vagal Nerve Affixen modulated an /oder enteric Zelle. Als Awunner intestinal macrophages der Haaptrei Spiller ausléisen dëser demagogesch Äntwert [5] sinn, vertrieden dësen Zellen d'Wahrscheinlechkeet Zil vun der CAIP. Kënschtlech Studie mat eenzele peritoneal macrophages, Randerscheinung Blutt mononuclear Zell-ofgeleet hunn zwar macrophages oder macrophage Zell Linnen Iwwerfloss hunn bewisen, dass acetylcholine an Nikotin cytokine Produktioun reduzéieren [1-3,6,7] an Erhéijung phagocytosis [6]. Trotzdem bleift et Foul zu wat fir engem Mooss hir phenotype gläicht wierklech, datt vun der résident macrophages vun enteric Zelle betraff sinn, grad wéi receptor Ausdrock vun macrophages Bastelen kann oder erof-reegelen wéi si aus hirer natierlecher Ëmwelt isoléiert ginn hunn. Dofir hu mer décidéiert eng Technik ze entwéckelen, déi eis den Effet vun Nikotin op der Aktivatioun vun résident macrophages an hirer natierlecher Ëmwelt ze studéieren géif erlaben. Als macrophages vum ATP, e bekannt Gefor Signal fir immun Zellen [8,9] ausgeléist, eng Hausse vun intracellular Ca definitiven 2+, liewen Ca 2+ war Imaging der résident macrophages zu intakt flaach ze studéieren an dëse Match gaangen Drécken Maus Mo. Préparatiounen. Dat erlaabt eis ATP dësen Ca 2+ transients ([Ca 2 +] _{i) an macrophages am Fonctionnéieren Muskel Schichten ier an der Uwendung vun Nikotin wellkomm ze vergläichen. Mir weider benotzt puer antagonists mat bekannt Preferenzen fir spezifesch nAChR subunits fir weider mechanistic Abléck an d'Rollen vun Nikotin receptor fir macrophages fir d'CAIP an der GUT ausdrécken. Dës pharmacological Conclusiounen sech duerch immunohistochemistry confirméiert. Endlech, analyséiert mir den Undeel vun résident macrophages datt an direkter Noperschaft vun cholinergic Nerve Faseren sinn. VerfÜgung}

Method VerfÜgung

IFLA- breakpoint VerfÜgung

All Maus Aarbecht gehaal huet no der däitscher Richtlinnen fir Déieren egal an Wuel (Däitsche Tierschutzgesetz) a vun de nom Staat Ethik Kommitee (Regierung Oberbayern, déi fir de Rosalie Universität München wéi den institutionnelle Care an Benotzt Comité versuergt) guttgeheescht no §4 an §11 Däitsche Tierschutzgesetz ënnert der Referenz Nummer 32 -568-2. VerfÜgung

Ray Echantillon VerfÜgung

Männlech 12-16 Wochen al C57Bl /6 Mais (Charles River, Sulzfeld, Däitschland) waren déi cervical dislocation ëmbruecht. De Mo war an Äis-kal Krebs gefiermt wou (am mm) 117 NaCl recoltéiert, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 sin 2PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 H 2O an 11 Zocker a seng Taktik ze pH 7.4. De Mo ass laanscht de gréissere curvature an Katakombe mat Äis-kal Krebs opgemaach. Ënner microscopic Inspektioun, war de Mo op engem sylgard Plat bereien verwandelt an der mucosa an submucosa waren extra geläscht. Während der dissection, war d'Otemschwieregkeeten kontinuéierlech mat Äis-kal Krebs Léisung perfused zu Nuetsvolen vun der Otemschwieregkeeten suergen. Nëmmen war d'anterior oder posterior Halschent vun de Mo op eng kleng sylgard Ring mat engem verdeckte Ouverture vun 100 x 200 mm bereien 2. VerfÜgung}

Kalzium Imaging VerfÜgung

flaach Blat Maus Mo. Préparatiounen sech zu geännert Krebs Léisung incubated (117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 H 2O, 1,2 sin 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2 h 2O an 11 Zocker) 30 μM vun der unisse Kalzium Luucht Fluo 4-acetoxymethyl (aM) (Invitrogen) an 1,25 mm probenecid (Fläch-Aldrich, Schnelldorf, Däitschland) fir 2 h bei Raumtemperatur am däischteren wouvun a mat carbogen (- 5% CO 2 95% O 2) gassed. D'sylgard Ring war an der Sortie Chamber mat serosal Ofwiersäit vun de Mo. konfrontéiert ënnen vun der Chambre Descher. D'Chamber huet zu der perfusion System verbonne bei Raumtemperatur kontinuéierlech perfusion mat carbogen-gassed Krebs Léisung ze erméiglechen. A washout Period vun 1,5 h war virum Ufank vun der Experimenter erlaabt. D'Otemschwieregkeeten Chamber war op en Inverted epifluorescence microscope (König Axio Observateur A1, Carl König, Jena, Däitschland) montéiert mat enger héijer Vitesse gestiermt Kamera equipéiert (König AxioCam HSm) a Software (König Axio Vision 4,8) fir Acquisitioun an Analyse. Fluo-4 Supporteren eng blo Luucht Emissiounen Prêt (LED) Luxeon III benotzt (3W, 470nm dominant Wellelängt, Philips Lumiled, Phillips, Hambur, Däitschland) an Fluo-4 Signaler sech mat engem Filter Potenz F26-514 Bright Linn FITC BP fonnt (excitation: HC475 /35, dichroic: 499, Emissiounsniwwelen: HC530 /43, AHF Analysentechnik, Tübingen, Däitschland) mat X20 Zil (A-Plan, NA = 0,25, König). De System gemooss relativ Ännerungen am fluorescence (Δ F /F) vun Fluo-4 iwwerwaacht Ännerungen am intracellular Kalzium ([Ca 2 +] i). Ca 2+ transients sech ab opgeholl 3 s ier lokal Administratioun vum ATP fir eng total vun 14,5 s mat engem Bezuchssystem Zënssaz vun 2 Hz an aussetzt Zäit vun 200 ms. VerfÜgung}

Mir benotzt ATP als Outil fir macrophage Aktivéierung well et eng Gefor Signal lokalen um Site vun inflammation verëffentlecht ass [8,9] an zënter ATP bekannt ass fir cytokine secretion aus macrophages via Erhéijung vun [Ca induce 2 +] _{i [10-12]. VerfÜgung}

ATP (Fläch-Aldrich) an Nikotin (Fläch-Aldrich) vun Drock Spëtzt lokalen applizéiert sech aus zwee micropipettes mat durations vun 200 ms an 10 sec, bzw.. D'Positioun vun der micropipettes gesuergt datt d'ausgestouss Bänn identesch Otemschwieregkeeten Regiounen iwwerzunn. D'micropipettes sech mat 1 mm ATP an 100 μM oder 10 μM Nikotin an Krebs Léisung mat 1,25 mm probenecid opgeléist gefëllt. Laut virdrun publizéiert Eechung Kéiren, schätzen mer dass keen vun Drock Spëtzt éischter applizéiert Substanz gëtt vun ongeféier 1:10 verdënntem ginn eemol ass de Otemschwieregkeeten erreecht [13]. VerfÜgung

lokaler Administratioun vum ATP an Nikotin erlaabt Miessung vun Äntwerte op verschidde Regiounen (normalerweis 4-5) an der selwechter Otemschwieregkeeten. D'Positioun vun de Regiounen an de Otemschwieregkeeten dokumentéiert de System op den Handy microscope Etapp ugewisen koordinéieren benotzt. Den Effet vun Nikotin op ATP entschlof Kalzium transients waren nees an der selwechter Regioun no Zousätzlech vun verschiddenen nAChR antagonists studéiert. (: 250, eBioscience, Frankfurt, Däitschland 1) fir 1 h, bei Raumtemperatur an der Opnam d'Äntwerte, goufen macrophages déi kruzial incubation vun der Otemschwieregkeeten mat allophycocyanin (APC) -labelled Grenzwäerter anti-Maus anti-F4 /80 antibody visualized déi däischter a mat carbogen gassed. D'Otemschwieregkeeten war fir 15 Minutten zou. D'microscope Etapp war repositioned d'Regiounen ze fannen, wou mir aus opgeholl. ET 620/60, dichroic:: Biller vun der Bezeechnung macrophages sech mat rout Z-LED P4 (3,5 W) excitation Quell (625 nm dominant Wellelängt, Seoul Semiconductor) an filter Potenz F46-006 ET filter setzen (excitation Qualifikatiounen 660, Emissioun: ET700 /75, AHF Analysentechnik, Tübingen, Däitschland). D'Wiedere fir Fligeren vun Fluo-4 Signaler a Biller vun F4 /80 positive macrophage Nodeems eis d'Äntwerte vun eenzelne macrophages ze analyséieren. VerfÜgung

Immunohistochemistry VerfÜgung

Fir Label macrophages Otemschwieregkeeten résident, mir benotzt éischt d'Haaptthema Etikette Protokoll beschriwwen uewen. D'Otemschwieregkeeten war dann Nuecht op Raumtemperatur zu enger Léisung mat 4% formaldehyde an 0,2% picric Seier an 0,1 M phosphate gefiermt fix, gewäsch 3 X 10 Minutten zu phosphate gefiermt an endlech fir 1 h zu enger Léisung mat 0,5% Triton X incubated 100, 0,1% Nan _{3, 4% Päerd serum vun PBS opgeléist (all aus Fläch-Aldrich). Fir cholinergic varicosities Label, war d'Otemschwieregkeeten Iwwernuechtung am erauszesichen Léisung mat Geess anti-vesicular acetylcholine Fernsehn incubated (VAChT; 1: 1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Däitschland). Stoffer waren 3 X 10 min an PBS gewäsch a fir 1,5 incubated - 2 h am erauszesichen Léisung mat Cy3-Label anti-Geess antibody (1: 500; Dianova, Hamburg, Däitschland). Stoffer waren 3 X 10 Minutten zu PBS gewäsch a schéi zu Anti-Fade Substanz (20% PBS /Nan 3, 80% glycerol) op puer dovun-L-lysine-Beschichtete drënner an coverslipped fir z'iwwerfalen. VerfÜgung}

fir gastric β2 nAChR an Otemschwieregkeeten résident macrophages, mucosa-gratis ganze Bierg Preparatiounen vum Wëld-Typ an β2 nAChR hummeren-out [14] Mais sech fix fir 10 min an Äis-kal PBS Léisung mat 4% paraformaldehyde (PFA) Label . Stoffer sech gewäsch dann 2 X 10 min an PBS a fir 2 h an PBS mat 1% protease-gratis Albumin Bovine Ëmwandlung V albumin incubated (BSA; Serva, Heidelberg, Däitschland) an 10% normal Esel serum (NDS; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Stoffer sech fir 36 h incubated mat PBS mat 1% BSA, 5% NDS, Grenzwäerter anti-Maus F4 /80 (1: 500; Klon BM8, BioLegend, San Diego, USA) an Kanéngchen anti-Maus β2 nAChR (1: 200; Santa Cruz Déi, Heidelberg, Däitschland). Stoffer waren 3 X 10 min an PBS gewäsch a fir 1 h an PBS mat 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor® 647-Label Geess anti-Grenzwäerter antibody incubated (1: 1.000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA) an Cy3-Label Esel anti-Kanéngchen antibody (1: 1.000; Chemicon, Millipore, Billerica, USA). Stoffer waren 3 X 10 Minutten zu PBS gewäsch a schéi zu luesen-Fade reagent (Invitrogen, Life Technologies, Gent, Belsch) op puer dovun-L-lysine-Beschichtete drënner a fir viewing.To Label α7nAChR an Otemschwieregkeeten résident macrophages coverslipped, engem Stéck vun Maus Mo an ileum sech fir 15 min bei 0,1 μg /ml zu RPMI 1640 mëttelfristeg (Lonza, Basel, Schwäiz) bei 4 ° C ze kruzial Etikette benotzt Cy5-Bezeechnung α-bungarotoxin (Invitrogen) ënnerworf [4]. Stoffer goufen fix dann zu PBS 4% PFA mat. D'mucosa an submucosa goufen ofgegruewen an Stoffer sech an erauszesichen Léisung mat 1% BSA fir 2 h incubated. Stoffer sech dann fir 60 h incubated zu erauszesichen Léisung mat Grenzwäerter anti-Maus F4 /80 (Copie BM8, BioLegend), gefollegt vun 3 X 10 min Mëtten an PBS an incubated fir 1 h an PBS mat 1% BSA an Cy3-Label Anti-Grenzwäerter antibody (1: 1.000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, USA). Endlech, goufen Stoffer zou 3 X 10 Minutten zu PBS an Descher zu Substanz luesen-Fade op puer dovun-L-lysine-Beschichtete drënner an coverslipped fir z'iwwerfalen. VerfÜgung

Confocal microscopy an Bild Analyse VerfÜgung

Biller waren mat enger LSM 510 (Carl König) confocal microscope mat Plan-Neofluar x40 /1,3 Oil DCR a Plan Apochromat x63 /1,4 Oil DCR Ziler chrétienne. Laser Wellelängten vun 543 nm a 633 nm huet fir de excitation vun der fluorophores Cy3 an APC oder Cy5 benotzt, bzw.. Cy3 an APC oder Cy5 Signaler fonnt huet den filter benotzt baut BP 565-615 asetzen an BP 650-710 asetzen, respektiv. VerfÜgung

Image stacks fir déi grouss Analyse der x63 Objektiv benotzt goufen mat enger XY Opléisung vun 1024 × 1024 gescannt, dass en Deel vun 95,5 × 95,5 μm Daach 2. Déi éischt an déi lescht opteschen serwéiert sech uewen an ënne vun de bausseschte Uewerfläch vun engem macrophage geholl. D'optesch Déift vun all Taarten war 900 nm. Zwou Nuechten serwéiert overlapped fir 500 nm. Normalerweis, tëscht 9 an 16 serwéiert sech doraus entsteet an engem Scanner Déift vun 3.2-6.0 μm wouvun tëschent 1-3 macrophages an VAChT positive Faseren Kräizung macrophages. Bild stacks benotzt Bild J Pro analyséiert. VerfÜgung

Biller vun β2 an α7 nAChR-Label macrophages sech d'x63 Zil geholl benotzt an gescannt mat engem XY Opléisung vun 1024 × 1024, datt en Deel vun 95,5 × 95,5 μm Daach 2. D'optesch Déift vun de Biller huet 900 nm. VerfÜgung

Pharmacology VerfÜgung

Aktioun Potential Ausbreedung vun Zelle ze blockéieren, tetrodotoxin (Biotrend, Köln, Däitschland) war um 1 μM dem perfusing Krebs Léisung notéiert. Fir pharmacological characterization, huet de folgenden nicotinic blockers fir de Krebs Léisung notéiert perfusing der Otemschwieregkeeten: 200 μM hexamethonium (Fläch-Aldrich), 100 μM mecamylamine (Fläch-Aldrich), 10 μM dihydro-β-erythroidine (DHBE; Fläch-Aldrich) , 100 nm, 3 μM an 10 μM α-bungarotoxin (ABGT; Tocris) an 10 nm a 100 nm methyllycaconitine (MLA, Tocris). Hexamethonium, mecamylamine an DHBE waren an der Konzentratioun getest, datt gebass goufen zu nicotinic schnell excitatory postsynaptic Potenzialer vun guinea Fierkel myenteric Zelle ofschafen [15] Éislek Benotzung vun 10 nm a 100 nm MLA op Konzentratioun baséiert bzw. benotzt α7 subunit ze blockéieren nAChR wouvun [16] a benotzt IL-6 secretion aus isoléiert peritoneal macrophages zu inhibit [3]. VerfÜgung

Data Analyse a war domatter VerfÜgung

D'Bäschten relativ Ännerungen am fluorescence (Δ F /F) an Äntwert ze ATP Administratioun war wéi% Erhéijung virun basal fluorescence virun ATP Administratioun ausgedréckt. Statistesch Analyse huet mat Fläch Plot 9.0 (Systat Software INC, Erkrath, Däitschland) gesuergt. Date sinn als whisker Diagramm mat de Steiren virgestallt an der 25. and 75 September percentiles souwéi der 10 and 90 September percentiles. Normalerweis net verdeelt vläit Donnéeën analyséiert goufen vun der Wilcoxon Geleeënheet Test ënnerschriwwen. Differenzen sech statistesch relevant Betruecht P VerfÜgung &Si besteet; 0,05. N VerfÜgung zu parentheses entscheet Zuelen Zuelen vun macrophages /Stoffer studéiert, dh e Resultat baséiert op Opzeechnunge vun 20 macrophages zu 5 Stoffer (t'selwecht 5 Déieren) ass den (20/5) virgestallt. VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Aménagement Relatioun tëscht Otemschwieregkeeten résident macrophages an cholinergic varicosities zu Maus Mo. VerfÜgung

Mir benotzt confocal microscopy der Géigend tëscht F4 /80-positiv macrophages an VAChT-positiv Varicen cholinergic Nerve Faseren ze bewäerten an der Maus Mo. (Dorënner 1A). Detailléiert Analyse verroden, datt 83% vun de 41 studéiert macrophages sinn innerhalb vu 900 nm bis op d'mannst een Varicen cholinergic Nerve Glasfaserkabelen (Dorënner 1B-C). VerfÜgung

Reproducibility vum ATP dësen [Ca 2 +] _{i Signaler an Otemschwieregkeeten résident macrophages VerfÜgung}

Microejection vum ATP entschlof e staarken, schnell agesat [Ca 2 +] _{i flüchteg zu macrophages datt sengem Héichpunkt 8-10 sec no der Demande erreecht duerno vun engem luesen Retour baseline [Ca 2 +] i Niveauen (Dorënner 2A an Movie S1). Well et net ëmmer all geheelt ze baseline Niveau während den Opnahmen Period war, den Bäschten [Ca 2 +] ech war Signal fir d'Analyse vun all Experimenter benotzt. Nee tachyphylaxis war zanter der Bäschten Amplituden vun observéiert [Ca 2 +] i Signal an Äntwert zu enger zweeter ATP Administratioun, 10 Minutten no der éischter een, net aus der initialen Bäschten Äntwert ënnerscheeden (Dorënner 2B). VerfÜgung}

Effekt vun Nikotin op [Ca 2 +] _{i Signaler an Otemschwieregkeeten résident macrophages VerfÜgung}

fir d'Wierkung vun Nikotin op ATP Etude dësen [Ca 2+] _{i Signaler mir microejected Nikotin fir 10 sec an direkt ATP op der selwechter Regioun-du applizéiert. Eng konsequent Nikotin esou kriddeleg, Net-deforméiert nAChR agonist ze benotzen war vun release vun acetylcholine aus cholinergic Zelle nicotinic receptor Aktivéierung rescht. Analyséiert d 'Ännerungen am [Ca 2 +] ech zu all macrophages Teamchef Nikotin reduzéiert bedeitend der ATP dësen [Ca 2 +] i Signaler (Dorënner 2D an F). Eng méi detailléiert Analyse vun de Folge vun der Sucht op ATP-entschlof [Ca 2 +] i transients réischt dräi Populatiounen vun macrophages (Dorënner 2D-G). Nikotin op 10 an 100 μM attenuated der ATP-Album [Ca 2 +] i Signaler zu 55% an 65% vun macrophages, bzw.. D'[Ca 2 +] i Signal zu 36% an 28% vun macrophages der Applikatioun vun 10 μM an 100 μM Nikotin, bzw. onverännert blouf. An engem klenge Ziel, 10 μM an 100 μM Nikotin potentiated der ATP-Album [Ca 2 +] i Äntwert (9% a 7% vun macrophages, bzw.). VerfÜgung}

all ze vermeiden Westen weider Analyse op Nikotin Auswierkungen op all macrophages onofhängeg vun baséiert ob der ATP entschlof [Ca 2 +] _{i Signal ofgeholl huet, fräi oder dropp. VerfÜgung}

Roll vum Zelle vun der nicotinic dësen attenuation vun Aktivéierung VerfÜgung macrophage

Nikotin activéiert direkt enteric Zelle a mir sot d'Méiglechkeet, datt Aktivatioun vun enker-duerch myenteric Zelle fir d'attenuated [Ca 2 +] derzou _{i Äntwerte vun macrophages. Mir fannen awer keng Beweiser fir esou eng indirekt inhibitory Passerelle well d'attenuation vum ATP-Album [Ca 2 +] i Signal vun Nikotin Leitnant an der Präsenz vun tetrodotoxin (Dorënner 2C). Et ass wichteg, obwuel datt den Undeel vun deene macrophages wou Nikotin net ATP hutt ofzeänneren dësen [Ca 2 +] i Signaler sech dramatesch reduzéiert (28% versus 6%). Gläichzäiteg, macrophages zu deem Album Nikotin inhibited oder potentiated ATP [Ca 2 +] i Signaler vun 65% op 71% geklommen a vu 7% op 23%, respektiv. VerfÜgung}

Pharmacological characterization vun der inhibitory Effet vun Nikotin op Otemschwieregkeeten résident macrophages VerfÜgung

d'Aktivéierung vun macrophages vum ATP an d'inhibition vun der ATP Äntwert vun 100 μM Nikotin zouverlässeg zu jidderengen vun den 21 Preparatiounen opgeholl gouf an Dorënner 2F illustréiert. Dat erlaabt eis antagonists Studien ouni déi néideg Leeschtung der inhibitory Äntwert op déi macrophages mat der antagonists behandelt ze restudy. Desweideren, reduzéiert mer doduerch d'Zuel vun Opnahmen Perioden engem Niveau dat net gemaach Signal Stäerkt a garantéiert reproducible ATP Äntwerte Kompromëss. Fir d'nAChR-subunits am inhibitory Effet vun Nikotin Équipe ze studéieren, getest mir fënnef verschiddene blockers mat bekannt subunit Preferenzen [17] (Dorënner 3). D'inhibitory Effet vun Nikotin op ATP-Album [Ca 2 +] _{i Äntwerte war dropp an der Präsenz vun der Net-selektiv ganglionic nAChR neien hexamethonium, déi α3β4 nAChR-wéilt neien mecamylamine oder α7 nAChR-wéilt antagonists α-bungarotoxin an methyllycaconitine (Dorënner 3A). Allerdéngs, réckgängeg der β2 nAChR-wéilt neien di-firwat-β-eryhtroidine der inhibitory Effet vun Nikotin op ATP-Album [Ca 2 +] i Äntwerte vun macrophages (Dorënner 3B). VerfÜgung}

Obwuel benotzt mir ABGT um Konzentratioune déi Débatte bis zouverlässeg α7 nAChR an dierft an isoléiert alveolar macrophages Spär [18], mir waren ubelaangt, datt et knapp kann de inhibitory Effet vun Nikotin ze antagonize wéinst encadréiere Concours op der bindend Site. Mä, dat schéngt onwahrscheinlech, well och bei Konzentratioune vun 3 μM an 10 μM ABGT net fäerdeg war d'inhibitory Effet vun Nikotin op ATP zu ëmgedréint dësen [Ca 2 +] _{i Äntwerte (Dorënner 3A). ABGT hutt ëmgedréint och net de attenuation vun 10 μM Nikotin Album (Dorënner 3C). VerfÜgung}

Etikette vun β2 awer net nAChR α7 an Otemschwieregkeeten résident macrophages VerfÜgung

zousätzlech Beweiser fir d'Bedeelegung vun β2 nAChR Fir déi awer net nAChR vun α7 an der inhibitory Effet vun Nikotin op ATP-Album [Ca 2 +] _{i Äntwerte, immunohistochemical Etikette vun β2 nAChR an kruzial Etikette vun α7 nAChR vun ABGT zu résident macrophages vun Mo. muscularis sech standing (Dorënner 4). D'Majoritéit vun résident macrophages vun Mo. muscularis sech β2 nAChR-immunoreactive (Dorënner 4A) den observéierten verschiddene Effet vun DHBE op nicotinic inhibition vun ATP Äntwerte ënnerstëtzen. D'benotzt antibody fir nAChR β2 ass spezifesch wéinst dem Fehlen vun β2 nAChR immunoreactivity zu engem β2 nAChR Knockout Maus (Dorënner 4B). VerfÜgung}

Vital Etikette vun α7 nAChR vun ABGT réischt Feele vun α7 nAChR an Otemschwieregkeeten résident macrophages zu der Maus Mo. (Dorënner 4C), am Géigesaz, huet intestinal macrophages vun ABGT (Dorënner 4D) gekennzeechent. D'Feele vun α7 nAChR am Mo. muscularis résident macrophages bestätegt d'Feele vun antagonism vun α7 nAChR-wéilt blockers ABGT an MLA op der inhibitory Effet vun Nikotin op ATP dësen [Ca 2 +] _{i Äntwerte vun dësen Zellen. VerfÜgung}

Diskussioun VerfÜgung

fir Datum, den Effet vun Nikotin ass nëmmen an isoléiert macrophages oder macrophage Zell Zeilen ze propagéieren. Hei hu mer en kënschtlech VerfÜgung Modell vun Maus Mo. Muskel-myenteric plexus Virbereedung entwéckelt den Effet vun Nikotin op Otemschwieregkeeten résident macrophages bannent hirer natierlecher Ëmwelt ze studéieren. Dëst presentéieren Etude ass also d'éischt, datt Nikotin direkt Aktivéierung nAChR bremst ze weisen vun Otemschwieregkeeten résident macrophages duerch β2 subunit wouvun a gëtt domat d'Basis fir funktionell sécher tëscht cholinergic Zelle an macrophages an der GUT. Eis Konklusioun ass haut duerch verschidden Zuchslinne vun dofir ënnerstëtzt. Eischtens, ATP dësen [Ca 2 +] _{i transients zu macrophages vill vun Nikotin souguer an der Präsenz vun der Nerve blocker tetrodotoxin reduzéiert gëtt. Zweetens, huet den Nikotin-entschlof attenuation vum ATP Äntwerte vun macrophages vun DHBE réckgängeg gemaach, mä net vun hexamethonium, mecamylamine, ABGT oder MLA. D'pharmacological Conclusiounen sech vun der Manifestatioun vun β2-positiv mee ABGT-negativ nAChR subunits op gastric macrophages ënnerstëtzt. Drëttens, waren d'Majoritéit vun macrophages an direkter Ëmgéigend vun Varicen cholinergic Nerve Faseren. Ähnlech direkter Noperschaft vun macrophages zu Nerve Faseren war an der Grenzwäerter intestinal muscularis observéiert [3]. VerfÜgung}

benotzt Eis Critère Noperschaft tëscht macrophages an cholinergic Nerve Faseren (900 nm Distanz) averstanen mat de Konzept vun extrasynaptic Kommunikatioun ze definéieren . Laut dësem Konzept eng Diffusion baséiert Volumen Transmissioun op 100 nm bis μm Distanzen tëscht der Quell an der Zil- [19] geschéie kann. Mir huelen un dat déi meescht, wann net all, cholinergic Partyen an enker Ëmgéigend zu macrophages aus myenteric neuronal Zell Kierper entstanen baséiert op eiser leschter observation datt vagal Faseren Kontakt nët intestinal résident macrophages [3], dëst och duerch d'Conclusiounen datt gastric vagal ënnerstëtzt gëtt efferent Faseren auszeschléissen bal ausschliesslech an enteric ganglia [20], wou se d'Majoritéit vun myenteric Zelle duerch nicotinic kenne [15] aktivéieren. VerfÜgung

D'CAIP stellt eng Fro gestallt System macrophage Aktivéierung während demagogesch Konditiounen ze kontrolléieren. D'Anti-demagogesch Effet vun CAIP Aktivéierung gouf zu isoléiert dës zu VIVO VerfÜgung vun vagal Nerve Stimulatioun an Maus Modeller vun sepsis an Thes ileus [2,3] an kënschtlech VerfÜgung vun Nikotin Administratioun , lipopolysaccharide -stimulated macrophages [1-4,21]. Am Moment studéieren, hunn mir dass Nikotin der ATP-entschlof Erhéijung vun intracellular Ca 2+ zu résident macrophages am Mo. reduzéiert. Spannen, war dëst Effet vun der β2 nAChR subunit wéilt neien DHBE proposéiert d'Abannung vun dësem subunit an de Nikotin-mediated modulation vun der résident macrophages réckgängeg. Dës Blumm ass konsequent mat eis virdrun fannen dass DHBE Nikotin-entschlof inhibition vun entholl necrosis Faktor-α (TNF-α) Fräiloossung a fräi phagocytosis an isoléiert peritoneal macrophages réckgängeg [6]. An Linn, Linn cytokine Produktioun vu mënschlechen neuroblastoma Zell stably mat α4β2 nAChR transfected ass wiesentlech duerch Nikotin pretreatment reduzéiert [22]. Obwuel dës Donnéeën hindeit, datt α4β2 nAChRs kann den Effet vun Nikotin op der ATP-entschlof Erhéijung vun intracellular Ca Mediate 2+, beweist rezent Bewäiser datt β2 subunits och mat anere α subunits, dorënner α7 subunits Board kann. Eng rezent Publikatioun ausgedréckt an mënschlechen epithelial Zell Linnen, huet de electrophysiological Eegeschafte vun α7β2 nAChR Diskussioun déi héich Konzentratioune vun DHBE α7β2 nAChR antagonized awer net nAChR α7 [16]. Dës an aner Donnéeën op der pharmacological Profil vun DHBE géif virschloen, datt DHBE eng besonnesch neien vun β2 nAChR ass awer diskriminéieren net zouverlässeg tëschent verschidde Versammlungen vun α3, α4 oder α7 mat β2. Mä eis immunohistochemical an kruzial Etikette vun gastric résident macrophages géif net Abannung vun α7 nAChR dofir well gastric macrophages net vun ABGT gekennzeechent waren awer der β2 nAChR subunit ausgedréckt. VerfÜgung

Trotzdem, Opt mir fir eng éischter konservativ Interpretatioun vun eisen Daten a schléissen dass nAChR β2 sinn an Nikotin inhibition vun macrophage Aktivitéit kritesch Équipe obwuel et wahrscheinlech ass, dass an der Konzentratioun vun eiser Etude DHBE benotzt Ze- Bleck α4β2 nAChR. Eis Virbereedung ass Idealfall an Zukunft Studien déi méiglech Bäitrag vun α7β2 nAChR zu Adress geegent duerch den Effet vun Nikotin an Otemschwieregkeeten résident macrophages aus α7 nAChR enquêtéiert, β2 nAChR an α7β2 nAChR duebel hummeren-out Mais. Ähnlech Strategien soll d'Bedeitung vun enger α4β2 nAChR ze studéieren benotzt ginn. VerfÜgung

Et ass wichteg, datt de verschiddene Aktioun vun DHBE notéieren fir macrophages als DHBE net selektiv ass, wéi hexamethonium an mecamylamine, och spären nicotinic synapses zu gastric myenteric Zelle [15]. Trotzdem muss déi nicotinic kenne op macrophages besëtzen verschidden Eegeschaften, wéi déi zu enteric Zelle well weder hexamethonium nach mecamylamine den Nikotin entschlof attenuation vun réckgängeg ATP-Album Äntwerte vun macrophages. Hexamethonium an mecamylamine hir Aktiounen vollt vun der pore vun der nicotinic Kanal ären [23-25]. Hir Daf de Nikotin inhibition vun macrophages zu ëmgedréint kann d'Existenz vun enger atypical nAChR zu macrophages schloen. Tatsächlech Opnahmen vun Ca 2+ transients an Äntwert zu Nikotin Verwaltung fräi réischt [Ca 2 +] _{an ech nëmmen 13% vun macrophages (6 vun 45 macrophages; Donnéeën net gewisen). Dës Populatioun ass méi kleng, datt den Undeel vun macrophages zu deem Nikotin der ATP modulated dësen [Ca 2 +] i. VerfÜgung}

räich Beweiser hindeit datt α7 nAChR spillt eng wichteg Roll an der Nikotin-entschlof Reduktioun vun macrophage cytokine Produktioun [2,3,6,26]. Virdrun, mir jo bewisen, dass Nikotin gescheitert TNF-α Produktioun vun peritoneal macrophages vun α7 nAChR Knockout Mais [6] hierkommen, déi anti-demagogesch Effet vun der klenger Daarm vun vagus Nerve Stimulatioun vun eise Modell vun Thes ileus ze reduzéieren ass an dëse verluer KO Mais [4]. Am Moment studéieren, Ee, d'Wierkung vun Nikotin op ATP-entschlof macrophage Aktivéierung war vun der α7 nAChR wéilt blockers ABGT an MLA net blockéiert, Dogéint géint d'Bedeelegung vun α7 nAChRs. Dëst ass weider duerch d'Feele vun Etikette vun Mo. muscularis macrophages vun α7 nAChR-wéilt α-bungarotoxin ënnerstëtzt. An der Daarm, hutt awer, mir α-bungarotoxin positive Fortgeschratten muscularis macrophages [4 an dëser Etude] fest, Regioun-spezifesch Differenzen an der phenotype vun dësen immun Zellen besot. VerfÜgung

Obwuel d'visuell opgepasst ABGT-senisitive α7 nAChR vun eiser Etude schéngt widderspréchlech zu eiser leschter Conclusiounen, mir ganz zouversiichtlech sinn, dass dës Daten sinn net wéinst der Daf vun ABGT fir déi décisiv Site wéi d'selwecht Konzentratioun vun eiser Etude Bleck neuronal α7 nAChR am Gehir benotzt konkurréiere zu

• PLOS NËMMEN: Electroacupuncture um ST36 Ameliorates Gastric Emptying a Marine Netzwierker vun Interstitial Zellen Cajal am Mo vun Diabetiker Rats
• PLOS NËMMEN: Noutebild an Phasic lafe Muskel Kontraktioun Ass nët reglementéiert vun der PKCα - CPI-17 Passerelle an dontknow Mo. Antrum an Fundus