PLoS ONE: Nikotinas slopina aktyvinimas audinio Resident makrofagų Mouse skrandžio per b2 nikotino acetilcholino receptorių

Anotacija

Fonas

cholinerginį priešuždegiminių būdas yra endogeninė mechanizmas, pagal kurį autonominė nervų sistema sumažina makrofagų aktyvinimas per nikotino acetilcholino receptorių (nAChR). Ši koncepcija, tačiau nebuvo įrodyta ne ląstelių lygiu sveikoms audinio. Siekiant šio tikslo, mes ištyrėme nikotino poveikį makrofagų gyvenantiems aktyvacijos pelės skrandžio paruošimo būdu kalcio vaizdų.

metodų

Kalcio perėjos ([Ca ^{2 +] _{i) makrofagų rezidentai buvo užfiksuotas pelės skrandžio preparato, kurio sudėtyje myenteric rezginys ir raumenų sluoksnius FLUO 4 d. Aktyvinimas makrofagų buvo pasiekta židinio sluoksniuotos administravimo ATP. Nikotino aktyvacijos makrofagų poveikis buvo įvertintas ir nAChR dalyvauja buvo farmakologiškai būdinga. Iš Cholinerginį nervus makrofagų artumo buvo įvertintas confocal mikroskopu. Išraiška b2 ir α7 nAChR buvo įvertintas b2 imunohistocheminiu ir Fluoroforas-tagged alfa-bungarotoxin}}

Rezultatai

83% makrofagų cholinerginį venų nervinių skaidulų aptikta atstumais. ≪ 900nm. ATP sukeltas [Ca ^{2 +] _{Aš padidinti reikšmingai slopino 65% arba 55% makrofagų pagal 100μM ar 10μM nikotino, atitinkamai. Tai slopinantis poveikis buvo panaikintas pagal b2 nAChR pirmenybę antagonistais dihidro-ß-eryhtroidine bet ne hexamethonium (neselektyvus nAChR-antagonistas), mecamylamine (α3β4 nAChR-pirmenybę antagonistas), α-bungarotoxin arba methyllycaconitine (tiek α7 nAChR-pirmenybę antagonistas ). Makrofagų skrandžio išreikšti β2 bet ne α7 nAChR ne baltymų lygio, o tie, žarnyne išreikšti tiek receptoriaus subvienetų.}}

Išvada

Šis tyrimas yra pirmasis
situ
demonstravimas kurio makrofagų aktyvacija slopinimo nikotino rodo funkcinį signalizavimas cholinerginį neuronų ir makrofagų skrandį. Gauti duomenys rodo, kad β2 subvieneto iš nAChR yra kritiškai įtraukti į nikotino sukeltas slopinimo šių makrofagų gyvenantiems

nurodomoji dalis:. Nemethova A Michelis K Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens "GE, Schemann M" (2013 ) Nikotinas slopina aktyvinimas audinio Resident makrofagų Mouse skrandžio per β2 nikotino acetilcholino receptorių. PLoS ONE 8 (11): e79264. Doi: 10,1371 /journal.pone.0079264

redaktorius: Yvette Tache, Kalifornijos universitetas, Los Andželas, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: birželio 10, 2013; Priimta rugsėjo 26, 2013 m Paskelbta: Lapkričio 1, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Nemethova et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijos iš Europos Sąjungos 7-osios bendrosios programos (ipodd), Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 VN; pagal mokslinių tyrimų fondo Flandrija (FWO Odisėjas ir Hercules "programa) GEB, dotacijos ir pagal FWO podoktorantūros tyrimų stipendijos PJG. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

2000 Tracey ir bendradarbiais įrodė, kad elektros stimuliacija nervą klajoklį suteikia galingą priešuždegiminį indėlį į blužnis. Be pelės modelio sepsis, nervo klajoklio nervo stimuliacija (VNS) lėmė sumažėjęs PRO-uždegiminių citokinų gamybą, ir efektas priklauso nuo α7 nikotino acetilcholino receptorių (nAChRs) [1,2]. Tai vadinamasis "cholinerginį priešuždegiminių kelias" (CAIP) veikia per adrenerginių blužnies nervų priėmimo Synaptic-kaip ryšius su b2 adrenerginių receptorių ekspresija blužnies T-ląstelių. Po išleidimo acetilcholino (ACH) iš šių T-ląstelių yra atsakinga už priešuždegiminis poveikis matyt, sąveikaudamas su α7nAChR ekspresija makrofagų [1,2].

2005 metais pateikė įrodymų, kad taip pat CAIP moduliuoja žarnyno imuninę sistemą. Be pelės modelio pooperacinio žarnų nepraeinamumo, mes parodė, kad VNS sumažinti žarnyno manipuliavimo sukeltas uždegimas plonojoje žarnoje, teigiamą poveikį priklausoma nuo α7 nAChR bet nepriklausomai nuo blužnies [3,4]. Šie duomenys rodo, kad žarnyno imuninė sistema yra gana tiesiogiai moduliuojama pasireikšti klajoklio nervo dirginimo nervų galūnės ir /arba žarnyno neuronų. Kaip žarnyno makrofagai rezidentės yra pagrindiniai žaidėjai paleidimo šį uždegiminį atsaką [5], šios ląstelės yra labiausiai tikėtinas taikinys CAIP. In vitro tyrimų metu naudojant izoliuotas peritoninės makrofagus, periferinio kraujo vieno branduolio ląstelių pagamintų makrofagai ar makrofagų ląstelių linijų iš tiesų gausiai parodė, kad acetilcholinas ir nikotinas sumažina citokinų gamybą [1-3,6,7] ir padidinti fagocitozę [6]. Nepaisant to, ji išlieka abejotina, kiek jų fenotipas tikrai primena, kad iš makrofagų gyvenantiems paveikė žarnyno neuronų, ypač receptorių ekspresija makrofagų gali būti aukštyn arba žemyn reguliuojama, nes jie buvo izoliuoti nuo jų natūralioje aplinkoje. Todėl mes nusprendėme sukurti techniką, kuri leistų mums mokytis nikotino poveikį makrofagų gyvenantiems aktyvavimo jų natūralioje aplinkoje. Kaip makrofagai aktyvuota ATP, gerai žinomas pavojaus signalas imuninių ląstelių [8,9], atskleisti in ląstelėje Ca padidėjimą ^{2 +, gyventi Ca 2 + vaizdo pasirinko studijuoti makrofagus gyvenantis nepažeistas butas lapas pelės skrandžio preparatai. Tai leido palyginti ATF sukėlė Ca 2+ perėjos ([Ca 2 +] _{i) makrofagų esančių lygiųjų raumenų sluoksnių prieš ir po taikymo nikotino. Mes taip pat naudoti kelis antagonistai su žinomais lengvatų konkrečių nAChR padaliniuose, siekiant užtikrinti tolesnių mechaninius įžvalgų apie nikotino receptorių vaidmenų išreiškė makrofagus dėl CAIP žarnyne. Šie farmakologiniai išvados buvo patvirtintos imunohistocheminiu. Galiausiai, mes išanalizavo makrofagų gyvenantiems dalį, kurios yra arti Cholinerginį nervinių skaidulų.}}

metodų

Etika pareiškimas

Visos pelė darbas buvo atliktas pagal Vokietijos gaires gyvūnų globos ir rūpybos (Deutsches Tierschutzgesetz) ir Bavarijos etikos komisijos (Regierung Oberbayern, kuri tarnauja kaip institucinė globa ir naudojimo komiteto Technische Universität München,) patvirtintas pagal §4 ir §11 Deutsches Tierschutzgesetz pagal numeriu 32 -568-2.

Audinių mėginiai

Vyras 12-16 savaičių amžiaus C57BL /6 pelių (Charles River Sulzfeld, Vokietija) žuvo slankstelių dislokaciją. Skrandis buvo nukirsta ledinio Krebso buferio, kuriame (mm) 117 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 O 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 25 NaHCO 3, 2,5 CaCl 2 2H 2O ir 11 gliukozės ir pH 7,4. Skrandžio buvo atidarytas išilgai didesnio kreivumo ir plaunamas ledinio Krebs. Pagal mikroskopinių patikrinimo, skrandis buvo prikabintos žemyn ant sylgard indą ir gleivinė ir submucosa buvo kruopščiai pašalinti. Per išpjaustymą, audinių buvo nuolat nušvies ledinio Krebso tirpalo, siekiant užtikrinti gyvybingumą audinio. Tik priekinė arba užpakalinės pusė skrandžio buvo prikabintos ant mažos sylgard žiedas su centriniu atidarant 100 x 200 mm ^2.}

Kalcio vaizdo

plokšti lakštai pelės skrandžio preparatai buvo inkubuojami modifikuoto Krebso tirpalu (117 NaCl 4,7 KCl, 1,2 MgCl _{2 6 O 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2 2 H 2O ir 11 gliukozės), kurių sudėtyje yra 30 mikronų, fluorescencinio kalcio indikatoriaus Fluo 4-acetoksimetilo (AM) (Invitrogen) ir 1,25 mM probenecido (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Vokietija) 2 h kambario temperatūroje tamsoje ir girtas su carbogen (95% O 2 - 5% CO 2). Sylgard žiedas buvo sumontuotas įrašymo kamera su serosal pusės į skrandžio nukreipta į degimo kameros dugne. Kamera buvo prijungtas prie perfuzijos sistemos, kad būtų galima nuolat perfuzijos su carbogen-girtas Krebso tirpalą kambario temperatūroje. Atlikti šalinimo laikotarpis 1,5 h buvo leista iki eksperimento pradžios. Audinių kamera buvo sumontuota ant apversto epifluorescenciniu mikroskopu (Zeiss® AXIO Stebėtojas A1, Carl Zeiss, Jena, Vokietija) įrengtas su didelės spartos nespalvoto kameros (Zeiss® AxioCam HSM) ir programinės įrangos (Zeiss AXIO Vision 4.8) įgijimą ir analizę. Fluo-4 buvo malonu naudojant mėlyną šviesos diodų (LED) Luxeon III (3W, 470nm bangos ilgis dominuojančią Philips LUMILED, PHILLIPS, Hambur, Vokietija) ir Fluo-4 signalai buvo aptikti su filtro kubo F26-514 Šviesus linija FITC BP (sužadinimo: HC475 /35, dichroinis: 499, emisija: HC530 /43, BAF ANALYSENTECHNIK, Tübingen, Vokietija), naudojant X20 tikslą (A-planą, NA = 0,25 Zeiss). Sistemos matuojamas santykinis pokytis fluorescencijos (Δ F /F) Fluo-4 stebėjimo pokyčius ląstelėje kalcio ([Ca ^{2 +] i). Ca 2 + perėjos buvo įrašyti pradedant 3 s prieš vietos administracijos ATP už 14,5 Bendras S su frame rate 2 Hz ir ekspozicijos laikas 200 ms.}}

Mes naudojamas ATP kaip makrofagų aktyvacijos priemonė, nes ji yra pavojus signalas išleistas vietiškai uždegimo [8,9] vietoje ir nuo ATP yra žinoma, kad sukelti citokinų sekreciją iš makrofagų per padidėjo vidutiniškai [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATF (Sigma-Aldrich) ir nikotino (Sigma-Aldrich) slėginė metimu buvo lokaliai taikoma nuo dviejų mikropipetės su trukmės 200 ms ir 10 sek, atitinkamai. užtikrintas mikropipetės pozicija, kad išmestas apimtys apima identiškų audinių regionus. Į mikropipetės buvo pripildyti 1 mM ATP ir 100 mkm arba 10 mkm nikotino ištirpinto Krebso tirpalu, turinčiu 1,25 mM probenecidą. Pagal anksčiau išleistų kalibravimo kreivių, mes prognozuojame, kad bet kokia medžiaga, kurią slėgis iškeldinimas impulsų taikomas bus atskiesti maždaug 1:10, kai jis pasiekia audinius [13].

Vietos administracija ATP ir nikotino leidžiama matuoti atsakymų ne keliuose regionuose (paprastai 4-5) toje pačioje audinio. Iš audinyje regionuose padėtis buvo įforminamos naudojant koordinačių sistema rodomas mobiliojo mikroskopo etape. Nikotino apie ATP sukeltas kalcio pereinamųjų efektas vėl buvo tiriami tose pačiose regionuose po to įvairių nAChR antagonistais. Po to, kai atsakymus įrašymo, makrofagų vizualizuojami gyvybiškai inkubacijos audinio su allophycocyanin (APC) žymėtus žiurkė anti-pelės anti-F4 /80 antikūnų (1: 250, eBioscience, Frankfurt, Vokietija) 1 val, kambario temperatūroje tamsoje ir girtas su carbogen. Audinių buvo plaunamas 15 minučių. Mikroskopas etapas buvo perstatinėjami rasti regionuose, kur įrašėme iš. Vaizdai žymėtųjų makrofagų buvo įgytos naudojant raudonos Z-LED P4 (3.5 W) sužadinimo šaltinis (625 nm, dominuojanti bangos, Seulas Puslaidininkių) ir filtras kubas F46-006 ET filtrų rinkinys (sužadinimo: ET 620/60, dichroinis: 660, emisija: ET700 /75, BAF ANALYSENTECHNIK, Tübingen, Vokietija). Iš Fluo-4 signalų ir vaizdų F4 /80 teigiamu makrofagų perdangos leido analizuoti atsakymus atskirose makrofagus.

imunohistocheminis

Jei etiketė audinių makrofagai rezidentai, pirmiausia naudojama gyvybiškai ženklinimą aprašyta pirmiau protokolas. tada audinių buvo nustatyta per naktį kambario temperatūroje tirpalas, kuriame yra 4% formaldehido ir 0,2% pikro rūgšties 0,1 M fosfatinio buferio, plaunami 3 x 10-ąją minutę, fosfatinis buferis, ir pagaliau inkubuojami 1 h tirpalas, kuriame yra 0,5% Triton X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% arklių serumo ištirpinama PBS (visi iš Sigma-Aldrich). Ženklinti cholinerginis varicosities, audinys buvo inkubuojami per naktį blokavimo tirpalą, turintį ožkos anti-vezikulinės acetilcholino transporterį (VAChT; 1: 1000; "Merck-MILLIPORE, Darmštatas, Vokietija). Audiniai buvo plaunami 3 x 10 min PBS ir inkubuojami 1,5 - 2 val į blokavimo tirpalą, turintį Cy3 žymėto kovos su ožkos antikūnai (1: 500; Dianova, Hamburgas, Vokietija). Audiniai buvo plaunami 3 x 10 min PBS ir sumontuoti anti-išblukimo medžiagos (20% PBS /NaN 3, 80% glicerolis) apie poli-L-lizino dengtos skaidres ir coverslipped peržiūrėti.}

Jei ženklinti b2 nAChR makrofaguose audinių rezidentų gleivinėje be skrandžio visas kalnas preparatų iš laukinio tipo ir b2 nAChR trankyti Atsijungti [14] pelėms buvo nustatytas 10 min į ledinio PBS tirpalo, kuriame yra 4% paraformaldehidas (PFA) , Tuomet audiniai buvo plaunami 2 x 10 min PBS ir inkubuojama 2 h PBS su 1% proteazės be albumino galvijų frakcija V albumino (BSA; Serva, Heidelbergas, Vokietija) ir 10% normalus asilas serume (NDS; Jacksonas ImmunoResearch, Pensilvanija, JAV). Audiniai buvo inkubuojamos 36 h PBS, kurių sudėtyje yra 1% BSA, 5% NDS, žiurkės anti-pelės F4 /80 (1: 500; klonas BM8, BioLegend, San Diego, JAV) ir triušio prieš pelės β2 nAChR (1: 200; Santa Krusas biotechnologijos, Heidelbergas, Vokietija). Audiniai buvo plaunamos 3 x 10 min PBS ir inkubuojami 1 h PBS, kurių sudėtyje yra 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor® 647 žymėto ožkos anti-žiurkių antikūnas (1: 1000, Jackson ImmunoResearch, Pensilvanija, JAV) ir Cy3 žymėto asilas kovos su triušio antikūnai (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, JAV). Audiniai buvo plaunami 3 x 10 min PBS ir montuojamas lėtai išnyks reagento (Invitrogen, Life technologies ", Gentas, Belgija) poli-L-lizino dengtos skaidres ir coverslipped už viewing.To etiketės α7nAChR makrofaguose audinių gyvenantiems A gabalas pelių skrandžio ir klubinės žarnos buvo atliktas gyvybiškai ženklinimo naudojant Cy5 žymėto alfa-bungarotoxin (Invitrogen) 0,1 mikrogramų /ml RPMI 1640 terpė (Lonza, Bazelis, Šveicarija), esant 4 ° C temperatūroje 15 min [4]. Tuomet audiniai buvo nustatytos PBS su 4% PFA. Gleivinė ir submucosa buvo pašalinta ir audiniai buvo inkubuojami 2 h blokuojant tirpalą, kuriame yra 1% BSA. tada audiniai buvo inkubuojamos 60 h blokuojančiu tirpale, kuriame yra žiurkės anti-pelės F4 /80 (klonas BM8, BioLegend), o po to 3 kartus didesnis už 10 min plauna ir PBS ir inkubuojami 1 h PBS su 1% BSA ir Cy3 žymėto anti-žiurkė antikūnas (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pensilvanija, JAV). Galiausiai, audiniai buvo plaunami 3 x 10 min PBS ir montuojamas lėtai išnyks cheminės medžiagos poli-L-lizino dengtos skaidres ir coverslipped peržiūrėti.

Confocal mikroskopija ir vaizdų analizės

vaizdai buvo įsigytos naudojantis LSM 510 (Carl Zeiss) mikroskopas su planu Neofluar X40 /1.3 Alyvos DIC ir planuoja Apochromat x63 /1.4 Alyvos DIC tikslus. Lazeriniai bangų ilgio 543 nm ir 633 nm bangos ilgiui buvo naudojami iš fluoroforezės Cy3 ir APC arba Cy5, atitinkamai sužadinimo. Cy3 ir APC arba Cy5 signalai buvo aptikti naudojant filtrą nustato BP 565-615 IR ir BP 650-710 IR, atitinkamai.

Vaizdo kaminai kiekybinės analizės, naudojant x63 tikslas buvo nuskaitomi su XY rezoliucijos 1024 × 1024, kad apėmė 95,5 × 95,5 mkm plotas ^{2. Pirmasis ir paskutinysis optiniai griežinėliai buvo paimti viršuje ir apačioje išorinio paviršiaus makrofagų. Optinis gylis kiekvieną gabaliuką buvo 900 nm bangos ilgiui. Du griežinėliai iš eilės sutapo 500 nm. Paprastai tarp 9 ir 16 gabalėlių buvo sukurtas dėl kurio nuskaitymo gylis 3.2-6.0 mkm, kuriuose yra nuo 1-3 makrofagų ir VAChT teigiami pluoštų perėjimo makrofagus. Vaizdo kaminai buvo analizuojami naudojant Image J Pro ".}

vaizdai b2 ir α7 nAChR žymėto makrofagų buvo imtasi naudojant x63 tikslą ir nuskaityti su 1024 × 1024 XY rezoliuciją, kad apėmė 95,5 × 95,5 mikronų plotas ^{2. Optinis gylis vaizdų buvo 900 nm bangos ilgiui.}

Farmakologija

Jei norite blokuoti veikimo potencialo sklidimo neuronų, tetrodotoxin (Biotrend, Köln, Vokietija) buvo pridėta prie nutvieksianti Krebso tirpalu 1 mkm. Dėl farmakologinio apibūdinimo, šie nikotino blokatoriai buvo įtraukta į Krebso tirpalu nutvieksianti audinį: 200 mkm hexamethonium (Sigma-Aldrich), 100 mkm mecamylamine (Sigma-Aldrich), 10 mkm dihidro-β-erythroidine (DHBE; Sigma-Aldrich) 100 nM 3 m ir 10 mkm α-bungarotoxin (ABGT; Tocris) ir 10 nM ir 100 nm methyllycaconitine (MLA, Tocris). Hexamethonium, mecamylamine ir DHBE buvo išbandyta koncentracija, kurios galėjo panaikinti nikotino greitai žadinančių posinapsinius potencialą į jūrų kiaulytės myenteric neuronų [15] .Iš 10 nm ir 100 nm MLA naudojimas yra grindžiamas koncentracijos atitinkamai naudojamas blokuoti α7 subvieneto, kuriame nAChR [16] ir naudojamas slopinti IL-6 sekreciją iš izoliuotų pilvaplėvės makrofagų [3].

duomenų analizė ir statistika

maksimalus santykinis pokytis fluorescencijos (Δ F /F), reaguojant į ATP administracija buvo išreikštas% padidėjimas virš bazinio fluorescencijos prieš ATP administracija. Statistinės analizės buvo atliekamos su Sigma Plot 9.0 (SYSTAT Software Inc, Erkrath, Vokietija). Duomenys pateikiami kaip Ūsas sklypų su vidurine ir 25 ^{-osios ir 75 -osios procentilių, taip pat 10 -osios ir 90 -ojo procentilių. Paprastai nėra platinami suporuoti duomenys buvo analizuojami Vilkoksono pasirašė rank testas. Skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingi, P
< 0,05. N
numeriai skliausteliuose nurodyti numerius makrofagų /audinių mokėsi, ty rezultatas, remiantis įrašais 20 makrofagų 5 audiniuose (lygi 5 gyvūnų) yra pateikiami kaip (20/5).}

rezultatai

Teritorijų santykiai tarp makrofagų audinių rezidentų ir Cholinerginį varicosities pelių skrandžio

Mes naudojome confocal mikroskopu įvertinti tarp F4 /80-teigiamų makrofagų ir VAChT teigiamų išsiplėtusių Cholinerginį nervinių skaidulų apylinkės to, kad pelės skrandžiui (1A pav.) Detali analizė parodė, kad 83% iš 41 makrofagų studijuojamų yra per 900 nm bent vieną venų cholinerginį nervinių skaidulų (pav 1B-C).

atkuriamumas ATP sukėlė [Ca 2 +] i signalai audinių rezidentų makrofagų

Microejection ATP sukeltas stiprus, greitas pradžią [Ca ^{2 +] _{i laikina makrofaguose, kad pasiekė kulminaciją 8-10 sek po paraiškos po lėtai grįžta į pradinį [Ca 2 +] i lygiai (2A pav ir filmų S1). Kadangi ne visada buvo visiškai atsistatė į pradinį lygį per visą įrašymo trukmę maksimali [Ca 2 +] i signalo buvo naudojamas visų eksperimentų analizė. buvo nepastebėta tachyphylaxis nuo maksimalaus amplitudė [Ca 2 +] i signalo į atsaką į antrą ATP administravimo, 10 minučių po pirmosios, nesiskyrė nuo pradinio maksimalaus atsaką (2B pav).}}

poveikis nikotino ant [Ca ^{2 +] _{i signalus audinio gyvenantys makrofagai}}

Jei studijuoti nikotino poveikį ATP sužadintą [Ca ^{2 +] _{i signalus mes microejected nikotino 10 sek ir iš karto vėl taikoma ATP ant to paties regiono. Vienas racionalu naudoti nikotino kaip selektyvus, ne degraduoja nAChR agonistas buvo imituoti nikotino receptoriaus aktyvacija išleidimo acetilcholino nuo Cholinerginį neuronų. Analizuojant pokyčius [Ca 2 +] i visus makrofagų parodė, kad nikotinas žymiai sumažino ATP sukėlė [Ca 2 +] i signalus (2D ir F pav.) Išsamesnė analizė nikotino poveikį ATP sukeltas [Ca 2 +] i perėjos atskleidė tris populiacijas makrofagų (pav 2D-G). Nikotinas ne 10 ir 100 mikromolių ardo tą ATP sužadintą [Ca 2 +] i signalus 55% ir 65% makrofagų, atitinkamai. Mygtuką [Ca 2 +] i signalo nepakito 36% ir 28% makrofagų pritaikius 10 m ir 100 m nikotino, atitinkamai. Nedideliame pogrupyje, 10 m ir 100 mkm nikotino sustiprėti ATP-prisiminė [Ca 2 +] i atsakas (9% ir 7% makrofagų, atitinkamai).}}

Kad būtų išvengta bet šališkumas dar analizė grindžiama nikotino poveikį visų nepriklausomų nuo to, ar ATP sukeltas makrofagų [Ca ^{2 +] _{i signalo sumažėjo, padidėjo arba nepakito.}}

vaidmuo neuronų nikotino sukeltų slopinimas makrofagų aktyvacijos

Nikotinas tiesiogiai aktyvina žarnyno neuronų ir mes kreipėsi į galimybę, kad aktyvacija arti po myenteric neuronų prisidėjo prie susilpnintas [Ca ^{2 +] _{i atsakymų makrofagus. Neradome jokių įrodymų dėl tokio netiesioginio slopinančio keliu, nes ATP-prisiminė slopinimas [Ca 2 +] i signalo nikotino liko tetrodotoxin akivaizdoje (2C pav.) Pažymėtina, kad nors šių makrofagų kur nikotinas nedaro įtakos ATP dalis sukėlė [Ca 2 +] i signalai buvo žymiai sumažintas (28%, palyginti su 6%). Tuo pačiu metu, makrofagai, kurioje nikotinas slopinami arba potencijuotais ATP sukėlė [Ca 2 +] i signalai padidėjo nuo 65% iki 71% ir nuo 7% iki 23%, atitinkamai.}}

farmakologinis apibūdinimas slopinančio poveikio nikotino apie audinio gyvenantys makrofagai

makrofagų pagal ATP aktyvavimo ir ATP reaguojant 100 mkm nikotino slopinimas buvo patikimai užfiksuotas kiekvienoje iš 21 preparatų iliustruotus 2F pav. Tai leido atlikti antagonistus studijas be būtinybės restudy slopinantį atsakymą tose makrofagų gydytų su antagonistais. Be to, mes taip sumažino įrašymo laikotarpių skaičių iki tokio lygio, kad netrikdė signalo stiprumą ir garantuotas atkuriamus ATP atsakymus. Kad mokytis nAChR-subvienetų dalyvauja slopinančio poveikio nikotino, mes patikrinome penkis skirtingus blokatorius su žinomais subvieneto lengvatų sistemos taikymo [17] (3 pav.) Šis poveikis nikotino ant ATP sukeltų [Ca ^{2 +] _{i atsakymų buvo nepakitęs nuo neselektyvus gangliniuose nAChR antagonistas hexamethonium dalyvavimą, α3β4 nAChR-kurie pirmenybę teikia antagonistas mecamylamine arba α7 nAChR-pirmenybę antagonistais α-bungarotoxin ir methyllycaconitine (3A pav.) Tačiau β2 nAChR-pirmenybę antagonistas di-hidro-β-eryhtroidine atstatomi slopinantį poveikį nikotino apie ATP prisiminė [Ca 2 +] i atsakas makrofagų (3b pav.)}}

Nors mes naudojome ABGT koncentracija, kurie buvo aprašytas patikimai blokuoti α7 nAChR neuronuose ir izoliuotų alveolių makrofaguose [18], mes buvo susirūpinęs, kad ji gali būti neįmanoma nuslopinti slopinantį poveikį nikotino dėl nepalankaus konkurencijos tuo prisijungimo vietų. Tačiau tai mažai tikėtina, nes net esant koncentracijai, 3 m ir 10 mikromolių ABGT nesugebėjo pakeisti slopinančio poveikio nikotino apie ATP sukėlė [Ca ^{2 +] _{i atsakymus (3A pav.) ABGT taip pat neatsižvelgė pakeisti slopinimas sužadintą 10 mikromolių nikotino (3c pav.)}}

žymėjimas b2, bet ne α7 nAChR audinių rezidentų makrofagų

Norėdami pateikti papildomus įrodymus už b2 nAChR dalyvavimo bet ne α7 nAChR į slopinančio poveikio nikotino apie ATP prisiminė [Ca ^{2 +] buvo atlikti _{i atsakymus, imunohistocheminis ženklinimas b2 nAChR ir gyvybiškai ženklinimą α7 nAChR iki ABGT makrofaguose skrandžio muscularis rezidentai (4 paveikslas). Makrofagų skrandžio muscularis gyvenantiems dauguma buvo b2 nAChR-imunoreaktyviųjų (4a pav) remti pastebėtam antagonistinis poveikis DHBE nuo nikotino slopinimu ATP atsakymų. Naudojamas antikūnų už b2 nAChR yra specifinė, nes iš b2 nAChR reaktyvumas į b2 nAChR nokautas pele (4b paveikslas) nebuvimas.}}

Vital ženklinimas α7 nAChR pagal ABGT atskleidė nebuvimą α7 nAChR makrofagų audinių gyvenantiems pelė skrandis (4C paveikslas), priešingai, žarnyno makrofagai buvo paženklinti ABGT (4d pav.) Iš α7 nAChR trūksta skrandis muscularis makrofagų gyvenantiems patvirtino antagonizmo α7 nAChR-pirmenybę blokatoriai ABGT ir MLA nebuvimas slopinančio poveikio nikotino apie ATP sukėlė [Ca ^{2 +] _{i atsakymus į šiuos elementus.}}

Diskusijos

Iki šiol, nikotino poveikis buvo tiriamas tik pavieniais makrofagų ar makrofagų ląstelių linijų. Čia mes sukūrėme in vitro
modelį pelės skrandžio raumenų-myenteric rezginio rengimo studijuoti nikotino poveikį makrofagų audinių gyveno jų natūralioje aplinkoje. Todėl ši ši studija yra pirmasis parodyti, kad nikotinas tiesiogiai slopina aktyvavimo makrofagų audinių rezidentai per b2 subvieneto, kuriame nAChR ir taip suteikia pagrindą funkciniam signalizacijos tarp Cholinerginį neuronų ir makrofagų žarnyne. Mūsų išvada pagrįsta kelių linijų įrodymų. Pirma, ATF sukėlė [Ca ^{2 +] _{i perėjos makrofaguose ženkliai sumažėja nikotino net nervinių blokatorių tetrodotoxin buvimą. Antra, nikotino sukeltas slopinimo ATP atsakymų makrofagų buvo atstatomi DHBE, bet ne hexamethonium, mecamylamine, ABGT ar teisine pagalba. Farmakologinis išvados buvo palaikomas b2-positiv bet ABGT neigiami nAChR padalinių skrandžio makrofagų demonstravimo. Trečia, makrofagų dauguma buvo tiesiogiai apylinkės venų cholinerginių nervinių skaidulų. Panašus arti makrofagų į nervinių skaidulų buvo pastebėtas su žiurkėmis žarnyno muscularis [3].}}

Mūsų kriterijus naudojamas apibrėžti arti tarp makrofagų ir Cholinerginį nervinių skaidulų (900 jūrmylių atstumu) sutinka su extrasynaptic bendravimo samprata , Pagal šią koncepciją gali pasireikšti difuzijos remiantis tūris perdavimas per 100 nm iki mikrometrai atstumas tarp šaltinio ir taikinio [19]. Manome, kad dauguma, jei ne visi, anticholinerginis nervai arti į makrofagus kilęs iš myenteric neuronų ląstelių įstaigos, remiantis mūsų ankstesnį pastebėjimu, kad klaidžiojantys pluoštai neturi susisiekti žarnyno makrofagai gyvenantys [3], tai taip pat remia išvadas, kad skrandžio nervo klajoklio išcentriniai pluoštai beveik išimtinai baigiasi žarnų nervus [20], kur jie aktyvuoti myenteric neuronų dauguma per nikotino receptorių [15].

CAIP sudaro fiziologinį kontrolės sistemos makrofagų aktyvinimas per uždegiminių sąlygomis. Anti-uždegiminis poveikis CAIP aktyvavimo Įrodyta vivo
pagal nervo klajoklio nervo stimuliacija pelės modelių sepsį ir pooperacinio žarnų nepraeinamumo [2,3] ir in vitro
pagal nikotino administravimo izoliuotų , lipopolisacharidų -stimulated makrofagai [1-4,21]. Šioje studijoje, mes nustatėme, kad nikotinas sumažino ATP sukeltas padidėjimas ląstelėje Ca ^{2 + makrofagų gyvenantis skrandį. Įdomu tai, kad šis poveikis buvo panaikintas pagal b2 nAChR subvieneto pirmenybę antagonistas DHBE rodančių šio padalinio dalyvavimą nikotino tarpininkaujant moduliavimo makrofagų rezidentai. Šis pastebėjimas yra suderinamas su mūsų ankstesniu konstatavimu, kad DHBE atvirkštine nikotino sukeltas slopina naviko nekrozės faktoriaus alfa (TNF-alfa) išleidimo į aplinką ir didesnį fagocitozę pavieniais pilvaplėvės makrofagų [6]. Linija, citokinų gamybą žmogaus neuroblastoma ląstelių linijos stabiliai perkeltų su α4β2 nAChR yra gerokai sumažintas nikotino apdorojimo [22]. Nors šie duomenys rodo, kad α4β2 nAChRs gali tarpininkauti nikotino dėl ATP sukeltas padidėjimas ląstelėje Ca poveikį 2 + naujausi duomenys rodo, kad b2 subvienetų taip pat gali surinkti su kitais alfa padaliniuose, įskaitant α7 padaliniuose. Neseniai Leidinyje aptarti elektrofiziologinius savybes α7β2 nAChR išreikštas žmogaus epitelio ląstelių linijų, parodė, kad mažos koncentracijos DHBE slopinti α7β2 nAChR bet ne α7 nAChR [16]. Šie ir kiti duomenys apie farmakologines DHBE būtų teigti, kad DHBE yra labai selektyvus antagonistas b2 nAChR bet ne patikimai atskirti įvairių asamblėjose α3, α4 ar α7 su b2. Tačiau mūsų imunohistocheminis ir gyvybiškai ženklinimas skrandžio makrofagų gyvenantiems nebūtų palanki dalyvavimą α7 nAChR nes skrandžio makrofagai nebuvo paženklinti ABGT bet išreiškė b2 nAChR subvieneto.}

Tačiau, mes pasirinkti gana konservatyvios aiškinimo mūsų duomenis ir išvadą, kad b2 nAChR kritiškai dalyvauja nikotino slopinimu makrofagų veiklą, nors tikėtina, kad naudojamos koncentracijos mūsų studijų DHBE pageidautina blokai α4β2 nAChR. Mūsų preparatas idealiai tinka spręsti ateityje studijų galimą indėlį α7β2 nAChR tiriant nikotino poveikį makrofagų audinių gyvenantiems nuo α7 nAChR, b2 nAChR ir α7β2 nAChR dviviečiai grandininį iš pelėms. Panašūs strategijos turėtų būti naudojami tyrimo An α4β2 nAChR reikšmę.

Svarbu pažymėti, kad antagonistinis veikimas DHBE nėra selektyvus makrofagų kaip DHBE, kaip hexamethonium ir mecamylamine, taip pat blokuoja nikotino sinapsėse skrandžio myenteric neuronai [15]. Nepaisant to, nikotino receptorių, esančių ant makrofagų turi turėti skirtingas savybes, nei tie, žarnyno neuronų, nes nei hexamethonium nei mecamylamine atstatomi nikotino sukeltas slopinimo ATP-sukeltų atsakymų makrofagus. Hexamethonium ir mecamylamine daryti savo veiksmus užsikimšimo, kad nikotino kanalą [23-25] porų. Jų nesugebėjimas pakeisti nikotino slopina makrofagų gali pasiūlyti į netipiškas nAChR egzistavimą makrofagus. Iš tiesų, įrašymo Ca ^{2 + perėjos reaguojant į nikotino administravimo atskleidė padidėjo [Ca 2 +] _{i tik 13% makrofagų (6 iš 45 makrofagų; duomenys nebus rodomas). Ši populiacija yra daug mažesnis, kad makrofagų, kurie nikotino moduliuotus ATP dalis sukėlė [Ca 2 +] i.}}

Daug duomenys rodo, kad α7 nAChR vaidina lemiamą vaidmenį nikotino sukeltas sumažinimas makrofagų citokinų gamybą [2,3,6,26]. Anksčiau, mes iš tikrųjų parodė, kad nikotino nepavyko sumažinti TNF-alfa gamybą pilvaplėvės makrofagai α7 nAChR pelç [6], kadangi priešuždegiminio poveikio plonąsias žarnas Vagus nervų stimuliacija mūsų modelio pooperacinio žarnų nepraeinamumo prarandama jų KO pelių [4]. Šioje studijoje, tačiau nikotino poveikis ATP sukeltas makrofagų aktyvacija nebuvo užblokuotas α7 nAChR Pastarieji norėtų blokatoriai ABGT ir teisine pagalba, teigdamas, prieš α7 nAChRs dalyvavimą. Tai papildomai patvirtina ir skrandžio muscularis makrofagų pagal α7 nAChR-pirmenybę alfa-bungarotoxin ženklinimo trūkumo. Žarnyne, tačiau mes padarėme stebėti alfa-bungarotoxin teigiami paženklinti muscularis makrofagai [4 ir šį tyrimą], nurodant konkrečių regionų skirtumus šių imuninių ląstelių fenotipo.

Nors aišku trūksta ABGT jautrus α7 nAChR mūsų tyrime atrodo prieštaringi mūsų ankstesnių tyrimų išvadas, mes esame gana tikri, kad šie duomenys nėra dėl ABGT nesugebėjimas konkuruoti dėl jungimosi vietos, kaip su ta pačia koncentracija naudojami mūsų studijų blokų neuronų α7 nAChR smegenyse ir

• PLoS ONE: elektroakupunktury ne ST36 Pagerina skrandžio ištuštinimą ir gelbsti tinklai intersticinės ląstelės Cajal diabetinės Rats
• PLoS ONE: Tonikas ir fazinės lygiųjų raumenų susitraukimas nereglamentuoja PKCα - VKI-17 Kelias į Kiaulių skrandžio Ertmė ir Fundus