Plos ONE: Nikotin zaduši Aktivacija tkiva Resident makrofagov v želodec Mouse preko P2 nikotinski receptor

Povzetek

Ozadje

holinergični protivnetno pot je endogeni mehanizem, s katerim se je avtonomni živčni sistem oslabi aktivacijo makrofagov preko nikotinske holinergične receptorje (nAChR). Ta koncept je pa ni bilo dokazano na celični ravni v neokrnjeni tkivu. V ta namen smo preučevali vpliv nikotina na aktivacijo rezidenčnih makrofagov v pripravi miške želodcu s pomočjo kalcijevega slikanja.

Načini

Kalcij prehodni ([Ca ^{2 +] _{i) v rezidenčnih makrofagov so bili zabeleženi v pripravi na miško na želodcu, ki vsebuje myenteric plexus in mišične plasti s fluo-4. Aktivacija makrofagov smo dosegli z žariščno dajanjem listnatega ATP. Učinki nikotina na aktivacijo makrofagov so bile ocenjene in nAChR vključen je farmakološko značilna. Bližina holinergičnih živcev do makrofagov je količinsko s konfokalno mikroskopijo. Izražanje P2 in α7 nAChR je ocenil P2 imunohistokemijo in-fluorofor označil a-bungarotoksina}}

Rezultati

83% makrofagov holinergični krčne živčna vlakna so bile ugotovljene na razdaljah. ≪ 900nm. ATP povzroča [Ca ^{2 +] _{i povečali signifikantno zaviral 65% ali 55% makrofagov s 100 um in 10 um nikotina, oz. Ta zaviralni učinek se je obrnil, ki jih P2 nAChR raje antagonistično dihidro-beta-eryhtroidine ne pa heksametonija (neselektivni nAChR-antagonista), mekamilamina (α3β4 nAChR-raje antagonista), α-bungarotoksina ali methyllycaconitine (oba α7 antagonist-nAChR raje ). Makrofagov v želodcu izražajo β2 vendar ne α7 nAChR na ravni beljakovin, medtem ko so v črevesju izražajo tako podenote receptorjev.}}

Zaključek

Ta študija je prva v
situ
prikaz inhibicije aktivacije makrofagov nikotin, kar kaže na funkcionalno signalizacijo med holinergičnih nevronov in makrofagov v želodcu. Podatki kažejo, da je β2 podenote nAChR kritično vključeni v inhibicijo-nikotina povzroča teh rezidenčnih makrofagov

Navedba. Nemethova A, Michel K, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Schemann M (2013 ) Nikotin oslabi Aktivacija tkiva rezidenčnih makrofagov v želodec Mouse z β2 nikotinski receptor. PLoS ONE 8 (11): e79264. doi: 10,1371 /journal.pone.0079264

Urednik: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Združene države Amerike

Prejeto: 10. junij 2013; Sprejeto: 26. september 2013; Objavljeno: 1. november 2013

Copyright: © 2013 Nemethova et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprla z nepovratnimi sredstvi iz 7. okvirnega programa Evropske unije (beseda ipodd), ki ga Deutsche Forschungsgemeinschaft Sche267 /9-1 MS; z nepovratnimi sredstvi za raziskave Fundacije Flandriji (FWO, Odiseja in program Hercules) do GEB, in jih FWO podoktorski raziskovalni sodelavec na PJG. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Leta 2000, Tracey in sodelavci dokazali, da električna stimulacija vagusni živec zagotavlja močno protivnetno prispevek k vranico. V mišjem modelu sepse, vagalne stimulacija živcev (VNS) je povzročilo zmanjšano vnetno produkcijo citokinov, učinek odvisno od α7 nikotinske holinergične receptorje (nAChRs) [1,2]. Ta tako imenovani "holinske protivnetno pot« (CAIP) deluje preko adrenergičnih vraničnim živcev izdelavo sinaptične podobno stike z p2 adrenergičnih receptorjev izražanje vraničnim T-celic. Kasnejše sproščanje acetilholina (ACh) iz teh celic T je odgovoren za protivnetno učinek verjetno tako v stiku z α7nAChR-izražajo makrofagov [1,2].

V letu 2005 smo predložili dokaze, da je CAIP tudi modulira črevesne imunski sistem. V mišjem modelu pooperativnega ileusa, smo pokazali, da VNS zmanjšano črevesno-manipulacijski inducirano vnetje tankega črevesa, dobrodejen učinek odvisen od α7 nAChR vendar neodvisno vranice [3,4]. Ti podatki kažejo, da je črevo imunski sistem namesto neposredno prirediti pojavijo vagalni živčnih končičih in /ali enteričnih nevronov. Kot so rezidenčne črevesne makrofagov glavni akterji sprožilne to vnetni odziv [5], te celice predstavljajo najbolj verjeten cilj je CAIP. Študije in vitro s isolated peritonealno makrofage, perifernih krvnih enojedrnih makrofagov celic pridobljeni ali makrofagov celične linije so res obilno dokazali, da acetilholin in nikotina zmanjšanje proizvodnje citokinov [1-3,6,7] in povečajo fagocitozo [6]. Vendar pa ostaja vprašljivo, v kolikšni meri je njihova fenotip zelo podobna tisti rezidenčnih makrofagov z enteričnih nevronov, prizadetih, zlasti ker se izraz receptorja v makrofagih se navzgor ali navzdol reguliran kot so bili izolirani iz njihovega naravnega okolja. Zato smo se odločili razviti tehniko, ki bi nam naj preuči učinek nikotina na aktivacijo rezidenčnih makrofagov v njihovem naravnem okolju. Kot makrofagov aktivira ATP, znanem nevarnem signal za imunske celice [8,9], kažejo, povečanje znotrajcelične Ca ^{2+, živi Ca 2+ slikanje je bil izbran za študij makrofage prebivališčem v nedotaknjeno flat stanja priprave miške želodec. To nam je omogočilo, da primerjajo ATP izzvan Ca 2 + prehodni ([Ca 2 +] _{i) v makrofagih, ki se nahajajo v gladkih plasti mišic pred in po uporabi nikotina. Mi še naprej uporablja več antagoniste z znanimi preferenc za posebne nAChR podenot, da bi zagotovili nadaljnje mehanističnih vpogled v vlogo nikotina receptorja izražajo makrofagov za CAIP v črevesju. Te farmakološke ugotovitve so potrdili imunohistokemijo. Na koncu smo analizirali delež rezidenčnih makrofagov, ki so v neposredni bližini holinergičnih živčnih vlaken.}}

metod
Etika Statement

Vse mouse delo je potekalo po nemških smernicah za nego in dobro počutje (Deutsches Tierschutzgesetz) in ga Bavarski državni etični odbor (Regierung Oberbayern, ki služi kot oskrba in uporaba institucionalni odbor za Technische Universität München) odobrila živali po §4 in §11 Deutsches Tierschutzgesetz pod referenčno številko 32 -568-2.

vzorce tkiva

Moški stari 12-16 tednov C57BL /6 miši (Charles River, Sulzfeld, Nemčija), je bilo ubitih s cervikalno dislokacijo. Želodec je pridelano v ledeno mrzlo Krebsovega pufra, ki vsebuje (v mm) 117 NaCl, 4,7 KCI, 1.2 MgCl _{2 6 H 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 25 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2 2 H 2O in 11 glukozo in prilagodi pH 7,4. Želodec je bil odprt ob večji ukrivljenosti in sprali z ledeno mrzlo Krebs. Pod mikroskopskem pregledu je bil trebuh zabodena navzdol na sylgard posodo in sluznica in submucosa so previdno odstranimo. Med seciranje je tkivo kontinuirno perfundirali z ledeno mrzlo Krebsovo raztopino, da se zagotovi sposobnost preživetja tkiva. Le sprednjo ali posteriorni polovico želodca je bil pripet na majhnem sylgard obroča z osrednjo odprtino 100 x 200 mm ^2.}

Kalcij slikanje

so ploščati list miške pripravki želodec inkubirali v modificirano Krebsovo raztopino (117 NaCl, 4.7 KCI, 1.2 MgCl _{2 6 H 2O, 1.2 NaH 2PO 4, 20 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2 2 H 2O in 11 glukoze), ki vsebuje 30 mikrometrov za fluorescenčne kazalnika kalcija fluo 4-acetoksimetil (AM) (Invitrogen) in 1,25 mm probenecid (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Nemčija) za 2 uri pri sobni temperaturi v temi in gasom z karbogena (95% O 2 - 5%, CO 2). Sylgard prstan je montirana v snemalni komori s serozne strani želodca obrnjen spodnji del komore. Komora je bil povezan s sistemom perfuzijski omogoča neprekinjeno perfuzijo z-karbogena gasom Krebsovo raztopino pri sobni temperaturi. Izpiranje obdobju 1,5 ure smo pustili pred začetkom poskusa. Komora Tkivo je bil nameščen na obrnjen epifluorescenčnim mikroskopom (Zeiss Axio Observer A1, Carl Zeiss, Jena, Nemčija), opremljeno z visoko hitrostjo enobarvno kamero (Zeiss AxioCam HSM) in programske opreme (Zeiss Axio Vision 4.8) za pridobitev in analizo. Fluo-4 je bil navdušen z uporabo modre svetleče diode (LED) Luxeon III (3W, 470nm dominantno valovno dolžino, Philips Lumiled, Phillips Hambur, Nemčija) so bili in fluo-4 signale zazna s filtrirnim kocke F26-514 Bright Line FITC BP (vzbujanje: HC475 /35, dikroičnih: 499, emisija: HC530 /43, AHF ANALYSENTECHNIK, Tübingen, Nemčija) z X20 cilja (A-načrt, NA = 0,25, Zeiss). Sistem izmerjene relativne spremembe fluorescence (Δ F /F) Fluo-4 spremembe nadzornih znotrajcelične kalcija ([Ca ^{2 +] i). Ca 2+ so prehodni zabeležili začenši 3 s pred lokalno upravo ATP v skupnem znesku 14,5 ih s stopnjo okvirja 2 Hz in izpostavljenosti času 200 ms.}}

Uporabili smo ATP kot orodje za aktivacijo makrofagov, saj je nevarnost signala sprostijo lokalno na mestu vnetja [8,9] in ker ATP je znano, da inducira izločanje citokinov iz makrofagov prek povečanja [Ca ^{2 +] _{i [10-12].}}

ATP (Sigma-Aldrich) in nikotina (Sigma-Aldrich) smo s tlačnim izmet lokalno uporabljajo od dveh mikropipete s trajanjem 200 ms in 10 sek oz. Položaj mikropipete zagotovljeno, da se gotove obseg pokriva regije enake tkiva. V mikropipete so bile napolnjene z 1 mM ATP in 100 LM ali 10 LM nikotina, raztopljenega v Krebsovo raztopino, ki vsebuje 1,25 mm probenecid. Po doslej objavljenih kalibracijskih krivulj, ocenjujemo, da bo katera koli snov, ki jo pritisk izmet impulzi uporabljajo razredčimo s približno 1:10, ko doseže tkiva [13].

Lokalna uprava ATP in nikotina dovoljeno merjenje odzivov na več območjih (navadno 4-5) v istem tkivu. Položaj regije v tkivu bila dokumentirana z koordinatni sistem je prikazan na odru mobilni mikroskopa. Učinek nikotina na ATP inducirano kalcijevih prehodnimi smo spet proučevali v istih regijah po dodatku različnih nAChR antagonistov. Po snemanju odgovorov so makrofagi vizualizirali z življenjsko inkubacija tkiva s alofikocianin (APC), označenega podganji proti-miš anti-F4 /80 protiteles (1: 250, eBioscience, Frankfurt, Nemčija) za 1 h pri sobni temperaturi temno in gasom z karbogena. Tkiva speremo 15 minut. Oder Mikroskop je preimenoval, da bi našli regije, kjer smo jih posneli s. Slike z oznako makrofagov so bili pridobljeni s pomočjo rdeče Z-LED P4 (3,5 W) vir vzbujanja (625 nm prevladujoča valovna dolžina, Seoul Semiconductor) in filter kocke F46-006 ET filter set (vzbujanje: ET 620/60, dikroičnih: 660, emisije: ET700 /75, AHF ANALYSENTECHNIK, Tübingen, Nemčija). Prekrivanje fluo-4 signalov in slik F4 /80 pozitivnih makrofaga nam je omogočilo, da analizira odzive v posameznih makrofagov.

Imunohistokemija

Za rezidente makrofagov nalepka tkiva, smo najprej uporabili ključno označevanje protokol opisano zgoraj. Tkivo nato pritrdi preko noči pri sobni temperaturi v raztopino, ki vsebuje 4% formaldehid in 0,2% pikrinska kislina v 0,1 M fosfatnem pufru, izperemo 3 x 10 minut v fosfatnem pufru in končno inkubirali 1 uro v raztopini, ki vsebuje 0,5% Tritona X- 100, 0,1% NaN _{3, 4% konjskega seruma raztopili v PBS (vsi od Sigma-Aldrich). Za označevanje holinergični varicosities smo tkivo inkubirali preko noči v raztopini, ki vsebuje zaporni kozji anti-vezikularni acetilholina transporter (VAChT; 1: 1000; Merck-Millipore, Darmstadt, Nemčija). Tkiva speremo 3 x 10 minut v PBS in inkubiramo 1,5 - 2 uri v raztopini zapornega vsebuje Cy3-markiranega protitelesa anti-kozjega (1: 500; Dianova, Hamburg, Nemčija). Tkiva speremo 3 X 10 minut v PBS in montiran na anti-zbledi snovi (20% PBS /NaN 3, 80% glicerol) na poli-L--lizina obložene diapozitivov in coverslipped za ogled.}

za označevanje p2 nAChR v tkivo rezidenčnih makrofagov, sluznici brez želodčnih celih priprav mount iz divjega tipa in p2 nAChR knock-out [14] miši so bile za 10 min v ledeno hladne raztopine PBS, ki vsebuje 4% paraformaldehida (PFA) . Tkiva smo nato sprali 2 X 10 min v PBS in inkubirali 2 h pri PBS, ki vsebuje 1% proteaze brez albumin goveja Frakcija V albumin (BSA, Serva, Heidelberg, Nemčija) in 10% normalne osel seruma (NDS, Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, ZDA). Tkiva inkubiramo 36 ur pri PBS, ki vsebuje 1% BSA, 5% NDS, podgana anti-miš F4 /80 (1: 500; klon BM8, BioLegend, San Diego, ZDA) in kunčjega anti-miš β2 nAChR (1: 200, santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Nemčija). Tkiva speremo 3 X 10 min v PBS in inkubiramo 1 uro v PBS, ki vsebuje 1% BSA, 5% NDS, Alexa Fluor® 647 označenega kozji protitelesa anti-podgana (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, ZDA) in -Cy3 označene osel anti-zajec protiteles (1: 1000; Chemicon, Millipore, Billerica, ZDA). Tkiva speremo 3 X 10 minut v PBS in nameščena v počasi zbledi reagenta (Invitrogen, Life Technologies, Gentu, Belgija) na poli-L-lizina obložena diapozitivov in coverslipped za viewing.To etiket α7nAChR v tkivo rezidenčnih makrofagov, A kos želodca miške in ileumu izpostavimo vitalnega označevanja uporablja Cy5-oznako alfa-bungarotoksina (Invitrogen) pri 0,1 ug /ml v RPMI 1640 mediju (Lonza, Basel, Švica) pri 4 ° C za 15 minut [4]. Tkiva so nato določene v PBS, ki vsebuje 4% PFA. Sluznica in submucosa smo odstranili in tkiva inkubiramo 2 uri pri blokiranju raztopine, ki vsebuje 1% BSA. Tkiva smo nato inkubirali 60 ur pri blokiranju raztopine, ki vsebuje podgano anti-miš F4 /80 (klon BM8, BioLegend), čemur sledi 3 X 10 min izpiranjih v PBS in inkubiramo 1 uro v PBS, ki vsebuje 1% BSA in Cy3 označenega anti-rat protitelesa (1: 1000; Jackson ImmunoResearch, Pennsylvania, ZDA). Na koncu so se tkiva sprali 3 X 10 minut v PBS in nameščena v počasi zbledi snovi poli-L-lizina obložena diapozitivov in coverslipped za ogled.

Konfokalni mikroskopija in analiza slike

slike so bile pridobljene z uporabo LSM 510 (Carl Zeiss) konfokalnim mikroskopom z načrt Neofluar x 40 /1.3 Oil DIC in načrta Apochromat x63 /1,4 Oil DIC ciljev. Laserske valovne dolžine 543 nm in 633 nm bili uporabljeni za vzbujanje fluorofori Cy3 in APC ali Cy5 oz. Cy3 in APC ali Cy5 signali so odkrili s pomočjo filtra določa BP 565-615 IR in BP 650-710 IR, v tem zaporedju.

Slikovni nizov za kvantitativno analizo s ciljem x63 so skenirane z resolucijo XY 1024 × 1024, ki zajema površino 95,5 x 95,5 um ^{2. Prvi in ​​zadnji optični rezine so bili sprejeti na vrhu in na dnu zunanje površine makrofaga. Optična globina vsake rezine bila 900 nm. Dve zaporedni rezine prekrivali za 500 nm. Ponavadi je bilo med 9 in 16 rezine ustvarila posledica skeniranja globine 3.2-6.0 um, ki vsebujejo med 1-3 makrofagov in VAChT pozitivne vlaken makrofagov prehodih. Image nizov so bili analizirani s pomočjo Image J Pro.}

Slike p2 in α7-nAChR označene makrofagov so bile posnete s ciljem x63 in skenirane z resolucijo XY 1024 × 1024, ki zajema površino 95,5 x 95,5 um ^{2. Optična globina slike je 900 nm.}

Pharmacology

Če želite blokirati akcijskega potenciala širjenje v nevronov, tetrodotoxin (BIOTREND, Köln, Nemčija) je bil dodan k perfundirajo Krebsove raztopine na 1 um. Za farmakološko karakterizacijo, so bili naslednji nikotinske blokatorji dodamo k raztopini Krebsovi perfundirajo tkivo: 200 mikrometrov heksametonija (Sigma-Aldrich), 100 um mekamilamina (Sigma-Aldrich), 10 uM dihidro-β-erythroidine (DHBE, Sigma-Aldrich) , 100 nM, 3 LM in 10 iM α-bungarotoksina (ABGT, Tocris) in 10 nm in 100 nm methyllycaconitine (MLA, Tocris). Heksametonija so mekamilamina in DHBE testirali v koncentracijah, ki so bili sposobni odpraviti nikotinske hitro ekscitatorni postsinaptične potencialov v testnih myenteric nevronov [15] Odprta uporabo 10 nm in 100 nm MLA temelji na koncentraciji oziroma uporablja za blokiranje α7 podenoto, ki vsebuje nAChR [16] in se uporablja za zaviranje IL-6, izločanje iz izoliranih peritonealnih makrofagov [3].

analiza podatkov in statistike

Maksimalne relativne spremembe fluorescence (Δ F /F) v odgovor na ATP uprava je bila izražena kot pred dajanjem ATP% povečanje nad bazalno fluorescence. Statistične analize so bile opravljene z Sigma Plot 9,0 (Systat Software Inc, Erkrath, Nemčija). Podatki so predstavljeni kot Zalistak parcel z mediano in 25 ^{th in 75 th percentile, kot tudi 10 th in 90 th percentil. Ni normalno porazdeljene v parih, podatki so bili analizirani z Wilcoxonovim testom. Razlike so bile upoštevane statistično značilna na P
< 0,05. N
številke, navedene v oklepajih število makrofagov /tkiv študiral, to je rezultat, ki temelji na posnetkih 20 makrofagov v 5 tkiv (ki je enako 5 živali) je predstavljena kot (20/5).}

Rezultati

Prostorski odnos med tkivo rezidenčnimi makrofagov in holinergični varicosities v miške želodcu

Uporabili smo konfokalno mikroskopijo za oceno bližino med F4 /80-pozitivnih makrofagov in VAChT pozitivnih krčne holinergičnih živčnih vlaken v želodcu miške (slika 1A). Podrobna analiza je pokazala, da 83% od 41 makrofagov proučevanih se nahajajo v 900 nm do vsaj enega krčne holinergični živčni vlaken (slika 1B-C).

Obnovljivost ATP izzvan [Ca 2 +] i signali v tkivu rezidenčnih makrofagov

Microejection ATP inducirane močan, hiter začetek [Ca ^{2 +] _{i prehodne makrofagov, ki so dosegle vrhunec 8-10 sekund po uporabi sledila počasno vračanje v izhodiščno [Ca 2 +] i ravni (Slika 2A in Movie S1). Ker je v času snemanja ni bilo vedno popolno okrevanje na izhodiščne vrednosti, maksimalna [Ca 2 +] i signal je bil uporabljen za analizo vseh poskusih. No tahifilaksije opazili od maksimalne amplitude [Ca 2 +] i signala v odgovor na drugem dajanju ATP, 10 minut po prvi, ni razlikoval od prvotnega maksimalnega odziva (Slika 2B).}}

vpliv nikotina na [Ca ^{2 +] _{i signali v tkiva rezidenčni makrofagov}}

Da bi preučili vpliv nikotina na ATP izzvan [Ca ^{2+] _{i signali smo microejected nikotina za 10 sekund in takoj ponovno uporabiti ATP na istem območju. Ena racionalno uporabljati nikotin kot selektivno, je ni degradiran nAChR agonist za posnemanje aktivacijo nikotinsko receptorja z sproščanje acetilholina iz holinergičnih nevronov. Analizira spremembe v [Ca 2 +] i v vseh makrofagov so pokazale, da nikotin znatno zmanjša ATP izzvan [Ca 2 +] i signali (slika 2D in F). Podrobnejša analiza učinkov nikotina na ATP-inducirane [Ca 2 +] i prehodni pokazala tri populacije makrofagov (slika 2D-G). Nikotin pri 10 in 100 um oslabila ATP-izzvan [Ca 2 +] i signali v 55% in 65% makrofagov, oz. Funkcija [Ca 2 +] signal i ostal pri 36% nespremenjene in 28% makrofagov po uporabi 10 mikrometrov in 100 LM nikotina, v tem zaporedju. V majhni podskupini, 10 mikrometrov in 100 LM nikotina potencira ATP-izzvan [Ca 2 +] i odzivom (9% in 7% makrofagov, v tem zaporedju).}}

Da bi se izognili koli pristranskosti nadaljnja analiza temelji na nikotin učinkov na vseh makrofagov neodvisna od tega, ali ATP povzroča [Ca ^{2 +] _{i signal se je zmanjšala, povečala ali nespremenjene.}}

Vloga nevronov v nikotinske izzvan slabljenje aktivacije makrofagov

Nikotin neposredno aktivira gastrorezistentno nevronov in smo obravnavali možnost, da bližnjega aktivacija myenteric nevronov prispevala k oslabljenem [Ca ^{2 +] _{i odzivov v makrofagov. Nismo našli nobenega dokaza za tako posredno zaviralnega poti, ker je slabljenje na ATP-izzvan [Ca 2 +] i signala nikotin ostala v prisotnosti tetrodotoxin (slika 2C). Omeniti je treba, da čeprav se je delež tistih makrofagov kjer nikotina niso spremenili ATP izzvan [Ca 2 +] i signali so se drastično zmanjšala (28% v primerjavi s 6%). Istočasno, makrofagov v kateri inhibirana ali potencira ATP nikotin izzvan [Ca 2 +] i signali povečal od 65% do 71% in od 7% do 23% oz.}}

farmakološko karakterizacijo zaviralnega učinka nikotina na tkivne rezidenčni makrofagov

aktivacija makrofagov z ATP in inhibicije odziva ATP za 100 uM nikotina je zanesljivo zabeležena v vsaki od 21 priprav prikazanih na sliki 2F. To nam je omogočilo izvedbo antagonistov študij brez potrebe po restudy inhibitornega odziv pri teh makrofagov, zdravljenih z antagonisti. Poleg tega smo s tem zmanjšali število snemalnih obdobja, na raven, ki ne ogroža moč signala in zagotavlja ponovljive ATP odzive. Da bi preučili nAChR-podenote, ki sodelujejo pri zaviralnega učinka nikotina, smo testirali pet različnih blokatorji z znanimi preferenc podenote [17] (slika 3). Zaviralni učinek nikotina na ATP-izzvan [ ^{2 + Ca] _{odgovorov sem bil v prisotnosti neselektivno ganglionska nAChR antagonista heksametonija, da α3β4 nAChR-raje antagonist mekamilamina ali α7-nAChR raje antagonisti nespremenjena α-bungarotoksina in methyllycaconitine (slika 3A). Vendar pa β2-nAChR raje antagonist di-hidro-β-eryhtroidine obrnilo zaviralni učinek nikotina na ATP-izzvan [Ca 2 +] i odzivi na makrofagov (slika 3B).}}

Čeprav smo uporabili ABGT v koncentracijah, ki so bile opisane zanesljivo blokira α7 nAChR v nevronih in izoliranih alveolarnih makrofagov [18], so nas skrbi, da morda ne bo mogla zavrejo zaviralni učinek nikotina zaradi neugodne konkurence na vezavnega mesta. Vendar pa to ne zdi verjetno, ker tudi pri koncentracijah, 3 pm in 10 um ABGT ni mogel obrniti zaviralni učinek nikotina na ATP izzvan [Ca ^{2 +] _{odzivi i (slika 3A). ABGT se tudi ne spremenijo slabljenje 10 iM nikotina (slika 3C) izzvan.}}

Označevanje z p2 vendar ne α7 nAChR v tkivu rezidenčnih makrofagov

Da bi zagotovili dodatne dokaze za vključevanje P2 nAChR ne pa α7 nAChR v zaviralnega učinka nikotina na ATP-izzvan [Ca ^{2 +] so bile izvedene _{i odgovori, imunohistokemični označevanje p2 nAChR in pomembno označevanje α7 nAChR jih ABGT v rezidenčnih makrofagih želodčne muscularis (slika 4). Večina rezidenčnih makrofagov v želodcu muscularis so p2 nAChR-imunološko (slika 4A), ki podpira opaženo antagonistično učinek DHBE na nikotinske zaviranja odgovorov ATP. Uporabljena protitelesa za P2 nAChR je specifična zaradi odsotnosti P2 nAChR radioinkorporacijo v P2 nAChR Knockout miši (slika 4B).}}

Vital označevanje α7 nAChR ga ABGT pokazala odsotnost α7 nAChR v tkivo rezidenčnih makrofagov v miška želodec (slika 4C) V nasprotju s tem so bile črevesne makrofagov označeni s ABGT (slika 4D). Pomanjkanje α7 nAChR v rezidenčnih makrofagov želodcu muscularis potrdili odsotnost antagonizma α7 blokatorji-nAChR raje ABGT in medsebojni pravni pomoči na zaviralnega učinka nikotina na ATP izzvan [Ca ^{2 +] _{i odzive v teh celic.}}

Pogovor

Do sedaj je učinek nikotina je bila raziskana samo v posameznih makrofagov ali makrofagnih celičnih linij. Tukaj smo razvili in vitro
model miške želodcu pripravo mišično-myenteric pleksusa, naj preuči učinek nikotina na tkivo rezidenčnih makrofagov v njihovem naravnem okolju. Ta prisotna študija je torej najprej dokazati, da nikotin neposredno zavira aktivacijo tkiva rezidenčnih makrofagov preko P2 podenote vsebuje nAChR ter tako zagotavlja osnovo za funkcionalno signaliziranje med holinergičnih nevronov in makrofagov v črevesju. Naš sklep je podprt z več vrstic dokazov. Prvič, ATP izzvan [Ca ^{2 +] _{i prehodni v makrofagov se bistveno zmanjša nikotin, tudi v prisotnosti živca blokerjev tetrodotoxin je. Drugič, slabljenje, nikotin povzroča odgovorov ATP v makrofagov obrniti tako DHBE, ne pa heksametonija, mekamilamina, ABGT ali medsebojne pravne pomoči. Farmakološki izsledki so bili podprti s prikazom p2-positiv vendar ABGT negativnih nAChR podenot na želodcu makrofagov. Tretjič, večina makrofagov v neposredni bližini krčnih holinergičnih živčnih vlaken. Podobno bližina makrofagov v živčnih vlaken opazili pri podganjih črevesne muscularis [3].}}

Naša merilo za opredelitev v neposredni bližini med makrofagov in holinergični živčnih vlaken (900 nm razdalje) se strinja s konceptom izvensinapticnem komunikacije . Po tem konceptu lahko pride do difuzijsko prenosnega volumen temelji na 100 nm z mikrometrskimi razdalje med virom in ciljem [19]. Predvidevamo, da je večina, če ne vse, holinergične živci v neposredni bližini makrofagov izvira iz myenteric nevronskih organov celic, ki temeljijo na prejšnji ugotovitvi, da vagalnim vlakna ne obrnejo črevesne nerezidenti makrofagov [3], to je z ugotovitvami, da so želodčni vagalnim podpira tudi eferentnim vlakna skoraj prekine izključno v enteralne ganglijih [20], kjer se aktivira večino myenteric nevronov pomočjo nikotinskih receptorjev [15].

CAIP predstavlja fiziološki sistem za nadzor aktivacijo makrofagov pri vnetnih stanj. Protivnetno učinek aktivacije CAIP Dokazano je, in vivo
s vagalnim živca stimulacija pri modelih miško sepse in pooperativni ileus [2,3] in in vitro
ga nikotina dajanjem izolirani , lipopolisaharidne -stimulated makrofagov [1-4,21]. V tej študiji smo ugotovili, da nikotin zmanjšala ATP-inducirano povečanje intraceličnega Ca ^{2+ v rezidenčnih makrofagov v želodcu. Zanimivo je, da je ta učinek obrnil ga je P2 nAChR podenoto raje antagonista DHBE kažejo na vpletenost te podenote v-nikotina posredovana modulacijo makrofagov rezidenti. Ta ugotovitev je v skladu z našo prejšnjo ugotovitvijo, da DHBE obrnil zaviranje-nikotina inducirano faktorja tumorske nekroze-a (TNF-alfa) za javnost in večjo fagocitozo v izoliranih peritonealnih makrofagov [6]. V skladu, proizvodnja citokinov iz nevroblastoma celične linije človeške stabilno transfekciji s α4β2 nAChR se bistveno zmanjša s nikotina predhodno obdelavo [22]. Čeprav ti podatki kažejo, da lahko α4β2 nAChRs posredovanje učinek nikotina na ATP-inducirane povečanje znotrajcelične Ca 2+, nedavni dokazi kažejo, da lahko P2 podenote zbrati tudi z drugimi a podenote, vključno α7 podenot. Nedavna objava razpravljali elektrofiziološke lastnosti α7β2 nAChR izražene v človeških epitelijskih celičnih linijah, je pokazala, da nizke koncentracije DHBE antagonistično α7β2 nAChR vendar ne α7 nAChR [16]. Ti in drugi podatki o farmakološki profil DHBE bi lahko sklepali, da je DHBE zelo selektiven antagonist P2 nAChR, vendar ne zanesljivo razlikovati med različnimi sklopi α3, α4 ali α7 s p2. Vendar pa naš imunohistokemični in vitalen označevanje želodca rezidenčnih makrofagov ne bo podpiral sodelovanje α7 nAChR zaradi želodčnih makrofagi niso bile označene s ABGT vendar je izrazil P2 nAChR podenoto.}

Kljub temu smo se odločili za precej konzervativno razlagi naših podatkov in sklene, da je P2 nAChR so nujno vključeni v nikotina inhibicijo makrofagne dejavnosti, čeprav je verjetno, da pri koncentraciji, uporabljeni v naši raziskavi DHBE prednostno blokov α4β2 nAChR. Naša priprava je idealna za obravnavo v prihodnjih raziskavah možni prispevek α7β2 nAChR s preiskovanjem učinek nikotina v tkivo rezidenčnih makrofagov iz α7 nAChR, p2 nAChR in α7β2 nAChR dvojno knock-out miši. Podobne strategije je treba uporabiti za preučevanje pomena za α4β2 nAChR.

Pomembno je omeniti, da antagonistično delovanje DHBE ni selektiven za makrofagov kot DHBE, kot heksametonija in mekamilamina, tudi bloki nikotinske sinaps v želodcu myenteric nevroni [15]. Kljub temu je treba nikotinske receptorje na makrofagov imajo drugačne lastnosti kot tisti v enteričnih nevronov, saj niti heksametonija niti mekamilamina obrnil nikotina inducirano dušenje ATP-izzvan odzivov v makrofagov. Heksametonija in mekamilamina izvajajo svoje aktivnosti, ki jih zamašitev pore nikotinske kanala [23-25]. Njihove nezmožnosti, da se obrne nikotina inhibicijo makrofagov lahko kažejo na obstoj netipično nAChR v makrofagih. Dejansko snemanje Ca ^{2 + prehodni odziv na nikotin uprave pokazala povečano [Ca 2 +] _{i le 13% makrofagov (6 od 45 makrofagov, podatki niso prikazani). Ta populacija je veliko manjši, da je delež makrofagov v katerem nikotin modulirati ATP izzvan [Ca 2 +] i.}}

Obilno dokazi kažejo, da ima α7 nAChR ključno vlogo pri zmanjševanju-nikotina psihomotorične makrofagov produkcijo citokinov [2,3,6,26]. Prej smo dejansko pokazale, da nikotin ni zmanjšala produkcijo TNF-alfa v peritonealnih makrofagih α7 nAChR knockout miši [6], ker protivnetnim učinkom v tankem črevesju Vagus stimulacijo živca v našem modelu pooperativnega ileusa se izgubi v teh KO miši [4]. V tej raziskavi pa je učinek nikotina na ATP-inducirane aktivacijo makrofagov ni bila blokirana, ki jih α7 nAChR raje blokatorji ABGT in MLA, z utemeljitvijo, proti vpletenosti α7 nAChRs. To je še dodatno podprta s pomanjkanjem označevanje želodcu muscularis makrofagov z α7-nAChR raje alfa-bungarotoksina. V črevesju, pa smo spoštovati a-bungarotoksina pozitivne označeni muscularis makrofagov [4 in to študijo], kar kaže na določeno regijo razlike v fenotipu teh imunskih celic.

Čeprav je očitno pomanjkanje ABGT občutljivih α7 nAChR v naši raziskavi se zdi v nasprotju z našimi prejšnjimi ugotovitvami, smo precej prepričani, da ti podatki niso zaradi nezmožnosti ABGT, da tekmujejo za vezavno mesto kot enak koncentraciji, uporabljeni pri naših študijskih blokov nevronov α7 nAChR v možganih in

• Plos ONE: Electroacupuncture na ST36 ameliorates praznjenje želodca in reši omrežij intersticijske celice iz Cajal v želodcu diabetično Rats
• Plos ONE: Tonic in fazno krčenja gladkih mišic ne ureja na PKCα - CPI-17 Pathway v Prašičja trebuhu antruma in Fundus