PLOS ONE: villkorligt uttryck av Wnt9b i Six2-positiva celler stör mage och njure Function

Abstrakt

Under njure utveckling, aktiverar kanonisk Wnt signalering differentiering, medan transkriptionsfaktor Six2 bibehåller stamcellspoolen. Dessa motsatta signaler bidrar till att reglera nefronet bildning och säkerställa full uppsättning av nefroner bildas. Eftersom dessa två faktorer styr olika öden i njur mesenkym, hypotes vi att överuttryck av Wnt9b
i Six2
uttryckande celler skulle störa njurbildning och kan förändra celldifferentiering beslut i andra vävnader. Vi skapade en transgen mus som villkorligt uttryckte kanoniska Wnt ligand i att utveckla njur, Wnt9b
. Transgenen aktiveras av cre-rekombinas och uttrycker GFP. Vi testade först dess biologiska aktivitet med Hoxb7-cre Mössor och fann att transgena Wnt9b var förmåga att inducera differentiering gener och rädda njure utveckling i Wnt9b ^{- /-
homozygota saknande möss. Däremot uttryck av Wnt9b
i celler med Six2-cre
orsakade gastrointestinal distress och svår njursvikt hos vuxna möss. Transgena njurar hade många cystisk tubuli och förhöjda kreatininvärden (0,652 ± 0,044) jämfört med vildtyp möss (0,119 ± 0,002). Dessa djur uppvisade också en missbildad pyloric sfinkter, duodenogastric återflöde och en omvandling av den distala magen i proximal öde. De förändringar genuttryck som observerats för Wnt9b: EGFP
transgen jämfördes med en stabiliserad β-catenin allelen för att fastställa att Wnt9b aktiverar den kanoniska Wnt pathway i vävnaderna som analyserats. Dessa resultat visar att uttryck av Wnt9b
i Six2
-positiva celler stör cell öde beslut i njuren och mag-tarmkanalen}

Citation. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) villkorligt uttryck av Wnt9b i Six2
-positiva celler stör mage och njurfunktion. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10.1371 /journal.pone.0043098

Redaktör: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Mottagna: 29 februari 2012, Accepteras: 17 juli 2012, Publicerad: 17 augusti 2012

Detta är ett öppet tillträde artikeln fri från all upphovsrätt, och kan fritt reproduceras, distribueras, överföras, modifieras, byggd på, eller på annat sätt användas av någon för något lagligt syfte. Arbetet görs tillgänglig under Creative Commons CC0 public domain engagemang

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 DK067222 (http://nih.gov/) och American Heart Association Etablerade utredare 0840117N (http://www.heart.org) till MR. SK stöddes av Saint Louis University president Research Fund Award (www.slu.edu). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

kanoniska Wnt-signalväg är en viktig regulator av cell öde, celltillväxt och cellvidhäftning under utveckling och under hela vuxenlivet. Många positiva och negativa medlare har identifierats som arbetar tillsammans för att uppnå snäva reglering av β-catenin signalering. Den centrala paradigm är att cytoplasmiskt β-catenin är isolerat i en destruktionskomplexet, fosforyleras av GSK3P, och inriktas på att den ubiquitin förstörelse vägen i frånvaro av ett Wnt-signal. Wnt bindning inhiberar fosforylering och destruktion av β-catenin, gör det möjligt att translokera till kärnan för att påverka rikta genuttryck med TCF /LEF faktorer (översikt av MacDonald et al., [1]). Ett stort antal musmodeller har skapats för att studera denna väg, inklusive både vinst och förlust av funktions alleler av Wnts, Wnt-receptorer, β-catenin och TCF /LEF transkriptionsregulatorer. Dessa modeller har avslöjat viktiga roller för kanoniska Wnt signalering i ben, hår, tarmar, blod och cancer [2]. En framväxande tema från dessa studier är att många biologiska processer är mycket känsliga för styrkan i kanoniska Wnt signalering.

Denna snäva reglering av kanoniska Wnt-signalering är avgörande för njurutveckling. Under de inledande stadierna av njure bildning, är Wnt9b utsöndras från ureteric knopp och signaler för att progenitorceller i locket mesenkymet att inducera nefronet differentiering. Behandling med litiumklorid eller aktivering av β-catenin kan inducera nephron differentiering i frånvaro av den ureteric knopp och Wnt9b, vilket tyder på att en ökning av kanonisk Wnt-signalering är tillräckligt för detta induktiva event [3], [4]. Vissa lock mesenkymceller prolifererar för att bibehålla de prekursorceller som är nödvändiga för påföljande iterationer av denna process [5]. Denna balans mellan progenitorceller underhåll och induktion av differentiering är av största vikt att se till att njuren bildar full uppsättning av nefroner [5], [6], [7], [8], [9].

Flera faktorer uttryckta i locket mesenkym har visat sig motverka Wnt-stimulerade differentiering inklusive transkriptionsfaktor Six2
. Radering av Six2
resultat i ektopisk differentiering, utarmning av cap mesenkym stamceller, och njure agenesi [9]. Även om den exakta mekanismen ännu inte är känd, har en hypotes föreslagits innebär höga halter av kanoniska Wnt signalering driva engagemang för differentiering, medan hög Six2 aktivitet i samma celler upprätthåller stamfader öde [7]. Vi har skapat en ny musmodell för att villkorligt överuttrycker Wnt9b att aktivera den kanoniska Wnt-signalväg. Vi har använt denna modell för att testa om ökad Wnt9b aktivitet är tillräcklig för att störa balansen mellan stamceller och differentieringen i locket mesenkym.

En andra plats där både Six2 aktivitet och Wnt signalering spelar en viktig roll är pyloric sphincter . Pyloric sphincter bildas vid den bortre änden av magen och fungerar som en ventil för att möjliggöra korrekt matsmältningen före dess inträde i tolvfingertarmen. Dysfunktion i slutmuskel kan resultera i reflux av duodenal innehållet i magsäcken utgör en ökad risk för magsäcks metaplasi och cancer [10], [11]. Denna region är också platsen för missbildningar, inklusive den sällsynta sjukdomen primär duodenogastric reflux och de mer vanliga missbildning pylorusstenos [12]. Six2
brist leder till agenesis av pyloric sphincter och motverka Wnt aktivitet med Sfrp1 och Sfrp2 krävs mönster magen [13], [14]. Detta fick oss att anta att kanoniska Wnt aktivitet måste vara tätt regleras i pylorus liknar vad som föreslagits i njuren. För att testa detta har vi använt Six2
-cre att aktivera Wnt9b
transgen i Six2
uttrycka domänerna i njure och mage.

villkorlig Wnt9b
transgen allel redovisas här uttrycker Wnt9b Mössor och GFP vid aktivering av cre-rekombinas. Det är biologiskt aktiva och kan rädda njurbildning i Wnt9b ^{- /-
embryon. Överexpression av Wnt9b
i njuren ureteric knopp kan inducera gener associerade med differentiering av cap mesenkym, men genomgår inte mesenkymala-till-epitelial övergång (MET) för att producera morfologiskt distinkta vesikel strukturer. Wnt9b
transgen aktivering i Six2
-positiva celler orsakar cystor och en omvandling av de distala magen regioner i proximala magen öde. Jämförelse av Wnt9b
transgena till en allel som producerar stabiliserade β-catenin protein visar dos-responsiva genförändringar och föreslår att dessa stammar representerar en allel serie som ska vara värdefull för att modulera kanoniska Wnt signalering i andra vävnader.}

Resultat

Transgena möss uttrycker Wnt9b när den aktiveras av cre-rekombinas

Wnt9b transgen konstruerades med en flytande-STOPP kassett [15] för att skapa en villkorligt aktiv Wnt9b som beror på CRE rekombinas för uttryck (Fig. 1A). När den är aktiverad, transgenen uttryckt Wnt9b kan särskiljas från endogena Wnt9b eftersom den innehåller en C-terminal influensa hemagglutinin epitoptag och transgena celler kommer att uppvisa GFP fluorescens på grund av IRES-EGFP kassett. För att testa trohet av transgenen undersökte vi cre-beroende uttryck i odlade celler och in vivo i embryon (Fig. 1B). Epitopmärkt Wnt9b kunde detekteras i lysat av celler samtransfekterade med transgenen och en cre-plasmiden, och inte i transfektioner av transgenen ensamt. På samma sätt, lysat från embryon som var positiva för både Wnt9b och β-aktin-CRE transgener innehöll Wnt9b-FLU medan enstaka Wnt9b transgener inte. GFP-fluorescens observerades i Wnt9b /β-aktin-cre dubbelpositiva embryon och inte i Wnt9b kullsyskon (Fig. 1C-F). Uttrycket nivån av transgen Wnt9b korrelerade med intensiteten av GFP fluorescens för varje grundare linje. (Fig. 1D). Fyra oberoende grundare linjer kunde inte producera levande β-aktin-CRE ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dubbla heterozygota valpar, vilket visar att allestädes närvarande förhöjda Wnt9b uttryck är embryonala dödlig. Analys av embryonala stadier visade att β-aktin-CRE tg /+, Wnt9b tg /+ dubbel heterozygot embryon upptäcktes vid mindre än väntat Mendelian frekvenser på E11-E12. En enda dubbel heterozygot embryo observerades från en grundare med mycket högt uttryck (Fig. 1 A, n = 23, förväntad frekvens 25%) och 16% observerades från en annan grundare (n = 25). Wnt9b /ß-aktin-Cre dubbla transgena embryon hade mindre hjärtan med sammanslagning av blod, vilket tyder på hjärtsvikt som dödsorsak.}

Transgenic Wnt9b är biologiskt aktiv

För att avgöra om transgen Wnt9b är biologiskt aktiva, testade vi om det var i stånd att ersätta vildtyp Wnt9b
under njur utveckling. Wnt9b <sup>- /-
embryon uppvisar hög penetrans gomspalt och njur agenesi fenotyper (Fig. 2). Aktivering av transgen Wnt9b i ureteric knopp med Hoxb7
-cre räddade njure bildning, men inte gom stängning på E14.5 i alla Hoxb7
-cre tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b tg /+ embryon (n = 7). Denna njurspecifik räddning bekräftar att transgen Wnt9b uttryck är beroende av cre aktivering, eftersom gommen inte uttrycker Hoxb7
-cre. Kvantitativ PCR av vild-typ, Wnt9b - /- Mössor och Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ transgena njurar avslöjade att transgena Wnt9b
uttrycktes vid 2.3- faldigt högre nivåer än vildtypsgenen, medan uttryck av Ret
var oförändrad (fig. 2 G-i). Förmågan hos transgena Wnt9b att signalera till mesenkym att ersätta vildtyp Wnt9b
aktivitet bekräftar att det är biologiskt aktiv in vivo.</sup>

En mängd data har visat att Wnt9b och β-catenin signalering är kritiska induktiva signaler som initierar differentieringen av locket mesenkym i epiteliserade njur vesiklar [4], [8], [16]. Wnt9b produceras i ureteric knopp aktiverar den kanoniska Wnt-signalväg i den intilliggande mesenkym och resulterar i expressionen av gener som reglerar mesenkymala till epiteliala övergången (MET). Därför undersökte vi om överuttryck av Wnt9b
i ureteric knopp skulle signalera till mesenkym att aktivera MET genuttryck och att främja ökad induktion av nefroner. Wnt9b
överuttrycktes i ureteric knopp med Hoxb7
-cre: EGFP. E12.5 embryon genotypas genom kvantitativ PCR-analys för att avgöra om de var hemizygota eller homozygota för Wnt9b
transgen och njurarna samlades för genuttryck analys. Vi upptäckte en dosberoende ökning i Wnt9b
som åtföljdes av en proportionell aktivering av uttryck av Wnt9b målgener, Wnt4
, Pax8
och FGF8
i tre oberoende pooler av transgena njurar (Fig. 2j). Six2
uttrycks i odifferentierade (cap) mesenkym och nedregleras som vesikler differentiering följer [17]. Six2
mRNA-uttryck är opåverkad i Hoxb7
-cre, Wnt9b
dubbla transgena. På samma sätt ureteric knopp generna, Ret Köpa och Wnt11
är inte signifikant av överuttryck av Wnt9b
. Den specifika uppreglering av gener i mesenkym bekräftar att transgena Wnt9b är i stånd att signalera från ureteric knopp att förmå gener som är viktiga för MET, var dock ingen histologiska bevis för ektopisk epiteliserad njur vesiklar uppenbar (data visas ej). Detta tyder på att uppreglering av Wnt9b
i ureteric knopp är tillräckligt för genaktivering i mesenkym, men inte för morfologisk differentiering av njur vesiklar.

Misexpression av Wnt9b stör njurfunktion och pyloric sphincter bildning genom att aktivera canonical β-catenin signalering

paradigm fram i njuren är att det finns en känslig balans mellan förnyelse progenitorceller själv och aktivering av differentiering [6], [7], [9]. Den Wnt9b /β-catenin väg krävs för differentiering och Six2 trycker differentiering vid det första steget av engagemang. Därför hypotes vi att möjligheten för Six2 att främja öde beslut motsatt de aktiveras av hög β-catenin aktivitet kan vara ett vanligt tema i utvecklingen. Vi testade denna möjlighet genom aktivering av transgen Wnt9b hotell med Six2
-cre. De dubbla transgena uttrycka Wnt9b
i samma celler som uttrycker Six2 Mössor och kan störa processer som koordinerat regleras i njurarna och andra vävnader. Six2-CRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
möss uppvisade nöd på avvänjning och kroppsvikt mätningar minskades med 39% på fyra veckor (14,5 ± 3,4 gram, p < 0,001) jämfört med cre-negativa Wnt9b tg /+
kullsyskon (23,6 ± 0,7 gram). Fenotypisk analys visade att denna minskning av kroppsvikten berodde på missbildningar i mag-tarmsystemet och njurarna, två platser i Six2
-cre uttryck (Fig. 3).}

Många cystor av varierande storlekar var synliga i cortex och medulla av de dubbla heterozygota njurarna (fig. 4, n = 11/11). Cystor var övervägande belägna i hjärnbarken och yttre märgen och var av proximala tubuli ursprung, vilket framgår av LTL-färgning. Cystisk sjukdom var först uppenbara strax efter födseln (P7-10) i de proximala segmenten av nefronet (data ej visade). Dessa dubbla heterozygota djur uppvisade förhöjda serumkreatininnivåer i (0,652 ± 0,044, p < 0,005) jämfört med kontrollkull (0,119 ± 0,002) så tidigt som ~ 3 veckors ålder, indikerar svår njursvikt. Äldre djur med avancerad sjukdom innehöll också cystor härledda från mer distala segment inklusive Henles slynga (Tamm-Horsfall-positiv). I alla djur med avancerad njursvikt undersökta, observerade vi många samlingskanal som härrör cystor som uttryckte Aquaporin två eller bundna D. Biflorus
-lectin. Eftersom Six2
-cre inte uttrycks i uppsamlingskanalen, är sannolikt sekundärt till utvidgning i mer proximala segment denna utvidgning. Närvaron av cystor i Wnt9b
transgena djur stärker slutsatsen att störningar i systemet Wnt signalering orsakar cystisk sjukdom [7], [18], [19].

Även om cystor var inte närvarande förrän efter födseln, uppreglering av kanoniska Wnt signalering var uppenbart vid E12.5 när Six2
-cre initialt uttrycks. Lef1 proteinuttryck ökade i pre-rörformiga aggregat och njur vesikler strukturer i dubbeltransgena och ökades ytterligare i de många ektopisk blåsor bildas i stabiliserade p-catenin njurar (N = 3, Fig. 5). Dos-responsiv ökning Lef1 uttryck stödjer publicerade data som Wnt9b agerar även den kanoniska Wnt signaleringsvägen i att utveckla njur [7]. Bristen på ektopiska vesikler strukturer i Wnt9b
transgener tyder på att Wnt9b
allelen uppvisar en måttlig effekt på β-catenin signalering i jämförelse med den stabiliserade β-catenin allelen.

Den andra fenotyp som bidrar till minskad kroppsvikt i Six2-CRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
dubbla heterozygoter var magbesvär. Gul fostervatten iakttogs i magen hos dubbeltransgener och i form av enstaka transgena kullsyskon (n = 6, Fig. 6). Detta visade att duodenogastric återflöde förekommande och kan bero på onormal pyloric sphincter bildning. Sphincter mellan magsäcken och tolvfingertarmen var långsträckt och breddas i dubbla transgena (Fig. 6, infälld). Den TGF-antagonist, Nephrocan, som normalt uttrycks i en mycket begränsad mönster vid E16.5, utökades i dubbeltransgena, vilket tyder på att den ringmuskel regionen inte riktigt var begränsad. Denna långsträckt morfologi stöddes av immunhistokemisk färgning av den glatta muskelskiktet som bildar den täta muskelväggen omger pylorus (Fig. 6 E, F). I enstaka transgena kontroller, var den tjockaste muskulatur finns där vävnaden uppvisar mest hopdragning vid ringmuskel (linje). I dubbeltransgena, var tjock muskulatur observer, men denna region förskjuten från det område som var mest begränsade.}

Mis-mönstring defekter observerades också genom att analysera specifika markörer som skiljer mellan den proximala (H ^{^ /K + ATPas) och den distala (Alcian blue) region i magen. Den proximala magen (corpus) innehåller H + /K + -ATPas-uttryck parietalceller som är undantagna från antrum-pylorus region. Omvänt innehåller antrum-pylorus slemhinneceller som färgas med Alcian Blue som inte återfinns i det proximala området [20]. De dubbla transgena uppvisade ihållande H + /K + ATPas färgning och frånvaron av Alcian blue-positiv slemhinnan i antral magen pylorus indikerar att den distala regionen är mis-mönstrade till proximal öde genom Wnt9b
expression. Alcian blue-färgning av bägarceller i tarmen var intakt i både enkla och dubbla transgena eftersom Six2
-cre uttrycks inte i tolvfingertarmen. Denna mis-mönstring tyder på att, i likhet med paradigm i njuren, specificerar kanonisk β-catenin signalerings ett öde, förmagen regionen och Six2 aktivitetsmönster den distala identitet. Detta stöds av de expressions domänerna av dessa gener, eftersom en kanonisk Wnt-signalering reporter uppvisar hög aktivitet endast i förmagen, och Six2
är begränsad till den distala magen och pylorus [13], [14].}

Om kanoniska Wnt-signalering är ansvarig för den gastroduodenala återflöde i Six2-CRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
dubbla transgena, sedan missbildningar observeras bör rekapituleras i en musmodell som uttrycker en stabiliserad β-catenin i samma domän ( Ctnnb1 EX3 /+
, [21]). Efter cre aktivering, förhindrar denna allel den proteolytiska nedbrytningen av β-catenin och skulle förväntas höja kanoniska Wnt-signalering till en högre grad än Wnt9b ligand ensam. Hela montera in situ analys av E12.5 magar avslöjade tre gener, Grem1
, Nkx 2,5
och Gata3
, som normalt uttrycks i ett tunt band demarking den region som kommer att bli den sphincter (n = 8, Fig. 7). Ektopiskt uttryck av Wnt9b
tryckte BMP antagonist Grem1 Mössor och transkriptionsfaktor Gata3
i denna region, och dessa gener vidare nedregleras när β-catenin signalering ökades. En dosberoende expansionen observerades för transkriptionsfaktorn Nkx2.5
i båda mutanter. Gener som lokaliserade enbart till tarmen ( villin
) eller förmagen ( BMP4
) ändrades inte i antingen muterade (data visas ej). Ökad kanoniska Wnt signalering i antral magen och pylorus bekräftades genom att isolera denna region och utföra kvantitativ PCR. De kanoniska Wnt målgener som är uppreglerade i den stabiliserade β-catenin allelen, Lef1 Köpa och Axin2
, ökade också i pyloric regionen Six2
-cre tg /+, Wnt9b tg /+ dubbla transgena [ Lef1
, 2,0 ± 0,25 och Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Tillsammans doseringskänsliga genuttryck förändringar som observerats i pyloric regionen i Wnt9b
transgena och stabiliserade β-catenin embryon visar att ökad kanoniska Wnt signalering stör distala magen och pyloric sphincter utveckling.}

Diskussion

Dessa resultat beskriver skapandet av en ny musmodell som villkorligt aktiverar kanoniska Wnt-signalering. Wnt9b
transgen är inducerbar vid exponering för CRE rekombinas och uttrycker GFP som en markör för induktion. Den behåller också full biologisk aktivitet eftersom det kan rädda Wnt9b ^{- /-
fenotyper i njuren. Dessa möss har bibehållits i vår koloni i över ett år och inducera Wnt9b
uttryck vid avel till flera olika CRE stammar. Vi har utnyttjat denna nya stammen att aktivera Wnt signalering i Six2
-positiva celler och funnit skadliga effekter i njuren och mage.}

I njuren, Wnt9b utsöndras från ureteric knopp epitel för att inducera de intilliggande cap mesenkym progenitorceller att initiera differentiering. Till stöd för denna modell, vår in vivo vinst-of-funktion studier visar att Wnt9b
uppreglerar tidiga markörer av nedsatt vesikler differentiering såsom Wnt4
, FGF8 Mössor och Pax8
. Men även om njur vesikler gener induceras av Wnt9b
transgen vi inte observera morfologiska tecken på ökad eller ektopisk njur vesikelbildning, som rapporterats för Six2
mutanter [9]. Förutom en Wnt induktiv signal, faktorer som upprätthåller njurstamcellspoolen (t.ex. Six2
) måste också nedregleras till fullo framkalla njurblåsbildning. Six2
uttryck ändrades inte i vår Wnt9b
transgena och kan således förklara varför ökningen Wnt9b inte ledde till ektopiska njur vesiklar. Ektopisk induktion av renal vesikel markörer induceras genom aktivering av β-catenin i Six2
-positiva metanefrisk mesenkym använder den stabiliserade β-catenin allel [4], därför, skillnaden mellan dessa två förstärknings-of-funktion experiment kan avse i vilken utsträckning de aktiverar canonical Wnt aktivitet. Dessutom är det sannolikt att aktiveringen av kanoniska signalering genom Wnt9b i metanefrisk mesenkym inducerar feedback-inhibering, som noterats i andra Wnt responsiva vävnader och därigenom förhindra induktion av fullständig differentiering programmet [22]. De senaste uppgifterna stöder denna idé feedback inhibition, eftersom Wnt9b /β-catenin signalering krävs inte bara för differentieringen av metanefriskt mesenkym, men paradoxalt nog samma signal krävs också för underhåll eller expansion av njurstamcellspoolen [7]. Vi spekulerar att den stabiliserade β-catenin, agerar nedströms i vägen, kan kringgå dessa regleringsmekanismer. Dessa möjligheter kan testas i framtida studier att jämföra nedströms genaktivering i njur stamceller med hjälp av Wnt9b
transgen och stabiliserade β-catenin vinst-of-funktion möss.

störningar i den kanoniska Wnt-signalväg har visat sig vara viktiga i patogenesen av njur cystisk sjukdom (granskad av Patel et al. [23]). Transgen uttryck av en stabiliserad β-catenin eller brist på APC i renal tubulär epitel leder till njur cystisk sjukdom, stöder slutsatsen att ektopisk kanoniska Wnt-signalering är tillräcklig för cystogenesis [18], [19]. Njursvikt och cystisk dilatation i Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dubbla heterozygoter stödjer vidare hypotesen att uppregleras kanoniska Wnt signalering orsakar cystor. Störningar av icke-kanoniska Wnt-signalering (PCP) vägen är också viktig i njur cystbildning [24]. Således är det möjligt att cystbildning i vår modell är inte helt enkelt beror på aktivering av kanoniska signalering, men är ett resultat av störningar av den relativa balansen mellan kanoniska och icke-kanoniska signalering. Till stöd för denna idé, de gener som är muterade i ärftliga former av cystisk sjukdom ( PKD 1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) lokalisera till cilier och dessa organeller har nyligen visat sig kunna reglera balansen mellan kanoniska och icke-kanoniska Wnt signalering [25], [26].}

det fanns en allvarlig njur fenotyp även om Wnt9b
mRNA uttryck ökar ~ 2-faldigt i vår transgen, vilket tyder på att en relativt låg nivå, ihållande aktivering av denna väg leder till nedsatt njurfunktion. Denna nivå av uppreglering av Wnt9b i ureteric knopp med Hoxb7
-cre inte producera cystor, vilket tyder på att cystogenesis i uppsamlings kanaler i Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dubbla transgena sannolikt en sekundär effekt av vidgade rörformiga segment (data visas ej). Till stöd för detta, i postnatala dag 7-10 djur, är cystisk sjukdom tydligt i endast rörformiga segment proximala till uppsamlingskanalen. I likhet med polycystisk njursjukdom hos patienter, de transgena mössen utvecklade svår njursvikt, även om de flesta nefroner inte utvecklar cystor. Detta väcker frågan om huruvida njurtubuli utan uppenbara cystor är onormala och bidrar i hög grad till progressiv funktionsnedsättning i dessa sjukdomar. Nyligen genomförda studier visar att vuxna njur tubuli epitel uttrycka Wnt9b, krullade receptorer och LRP5 /6 co-receptorer som har förmåga att förmedla canonical Wnt signalering som svar på akut ischemisk skada [27]. I denna inställning främjar Wnt signalering tubuli reparation och förnyelse. Emellertid har Wnt signaleringsaktivitet även implicerats i främjandet av renal fibros efter skada, såsom i UUO-modellen [28]. Sammantaget dessa studier understryka vikten av att reglera Wnt signalering i den vuxna njuren för att balansera positiva reaktioner, såsom reparation /regenerering, och maladaptiva reaktioner som leder till fibros och kronisk organdysfunktion.}

pyloric regionen i magen representerar en kritisk gräns som separerar magsäcken från tarmen. Sphincter stängning när en livsmedels bolus in i magen gör matsmältningen före transitering till tunntarmen. Den molekylära grunden för bildandet av denna diskreta region är inte väl förstådd, även om vissa detaljer växer fram. Dessa resultat tyder på att strikt kontroll av Wnt-signalering är avgörande för utvecklingen av pylorus. Canonical Wnt aktivitet detekteras i fundus och kroppen (corpus) men undantas från den distala magen och pylorus [13]. I Barx1
- /- möss, är magen små, antral-corpus gränsen är suddig och det finns agenesis av pyloric sphincter. Eleganta vävnads rekombinations studier tyder på att dessa fenotyper resultera från förlust av expression av Wnt-antagonister Sfrp1 och Sfrp2. Eftersom Barx1
brist har globala effekter på foregut utveckling, var det inte klart om nedreglering av kanoniska Wnt aktivitet är nödvändig för bildning av pylorus. Våra studier mer direkt testat denna möjlighet genom att rikta ektopisk Wnt aktivitet till en begränsad region bara främre till pylorus med Six2
-cre.

Vi fann att ektopisk Wnt aktivitet stör särskilt bildandet av pyloric ringmuskel i avsaknad av globala defekter i magen utveckling. Således nedreglering av kanoniska Wnt aktivitet krävs för att mönstret pyloric regionen som skiljer magen från tarmen. Ektopisk uttryck för Wnt9b liganden och stabiliserade β-catenin i transgena möss kunde övervinna effekterna av utsöndrade endogena Wnt antagonister Sfrp1 /2, i enlighet med den modell som föreslås av Kim et al [13]. I likhet med våra resultat, i Six2
mutanter det minskar uttryck av Nkx2.5 Köpa och Gremlin
, gener som är viktiga för pyloric sphincter utveckling i chick [14] [29]. Detta tyder på att Six2 Mössor och Wnt
reglera en gemensam genetisk kaskad i presumtiva pyloric sphincter. Vi postulerar att en viktig funktion av Six2
kan vara att tolka kanoniska Wnt signaler i olika sammanhang utvecklings.

uppregleras kanoniska Wnt-signalering har också visats påverka mjälte och bukspottkörtel utveckling [30]. Till stöd för detta, var mjälte och bukspottkörtel hypoplasi också observerats i Six2
-cre, Wnt9b
bi-transgena möss (data visas ej). Eftersom Six2
-cre inte uttrycks i dessa vävnader, tyder detta på att signalerna från den bakre magen mesenkym kan påverka mjälte och pankreas under utvecklingen. Detta skulle stödja hypotesen att pyloric regionen kan fungera som en organisatör för bildandet av dessa tillbehör organ. Under utveckling, mjälte prekursorceller gående associerar med pyloric regionen, innan de migration till vänster i magen, där de kondenserar [31]. Även om vi inte upptäcker Six2
-cre uttryck i mjälten primordium eller mesothelium, vi kan inte utesluta att övergående uttryck av Six2
-cre i dessa regioner är ansvarig för defekter i mjälten och bukspottskörteln . Framtida studier behövs för att direkt testa dessa möjligheter.

Sammanfattningsvis har vi utvecklat en ny musmodell som möjliggör tids- och rums uttryck för Wnt9b. I utvecklings njuren, kan transgena Wnt9b
uppmuntra förtida MET genuttryck i Six2
-positiva njur progenitorceller, men det är inte tillräckligt för att aktivera hela differentieringsprogram. Ihållande uttryck av Wnt9b i Six2
-positiva celler leder till cystor och svår organsvikt. I magen, ektopisk Wnt β-catenin-aktivitet i pyloric regionen förändrar sphincter bildning och distala magen mönstring. Tillsammans utgör dessa iakttagelser markerar betydelsen av strikt kontroll av Wnt aktivitet och föreslår att Six2 och β-catenin är involverade i organ mönstring i olika sammanhang.

Material och metoder

Etik uttalande

de djurstudier godkändes av djurvård och användning kommitté av Saint Louis University (protokoll 1460) och St Louis VA (protokoll 0305). Alla som deltar i djurförsök var i överensstämmelse med institutionella djurskydds föreskrifter, normer och politik.

Möss

Wnt9b
transgena möss korsades till var och en av tre olika CRE linjer [32 ]. 1) β-actin- cre användes för att uttrycka Wnt9b ubiquitously (Fig 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre:. EGFP användes för att överuttrycka Wnt9b i dess endogena läge i njuren, ureteric knopp (fig 2, [34].), och 3) BAC Six2
-cre: EGFP transgenen användes för att uttrycka Wnt9b exogent i magen och njuren (fig 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• PLoS ONE: Insektsätande fladdermöss Digest Chitin i magen användning av sura Däggdjur Kitinas
• PLOS ONE: Integrering maginnehåll och stabil isotop Analyser för att kvantifiera dieterna av Pygoscelid Penguins