PLOS ONE: Expresión condicional de Wnt9b en células SIX2-positivos Interrumpe estómago y riñón función

Extracto

Durante el desarrollo del riñón, la señalización de Wnt canónica activa la diferenciación, mientras que el factor de transcripción SIX2 mantiene el reservorio progenitor. Estas señales opuestas ayudan a regular la formación de nefronas y asegurar que se formó la dotación completa de nefronas. Dado que estos dos factores controlan diferentes destinos en el mesénquima renal, la hipótesis de que la sobreexpresión de Wnt9b Hoteles en SIX2
expresando células interrumpirían la formación de riñón y pueden alterar las decisiones de diferenciación celular en otros tejidos. Hemos creado un ratón transgénico que expresa condicionalmente el ligando Wnt canónica en el riñón en desarrollo, Wnt9b
. El transgén se activa por la recombinasa cre y expresa GFP. Primero probamos su actividad biológica utilizando Hoxb7 cre-
y encontramos que transgénica Wnt9b era capaz de inducir los genes de diferenciación y de rescatar el desarrollo del riñón en Wnt9b ^{-
ratones homocigotos deficientes - /. Por el contrario, la expresión de Wnt9b
en las células utilizando SIX2 cre-
causó malestar gastrointestinal e insuficiencia renal grave en ratones adultos. riñones transgénicos tenían numerosos túbulos quísticas y valores elevados de creatinina (0,652 ± 0,044) en comparación con los ratones de tipo salvaje (0,119 ± 0,002). Estos animales también mostraron un esfínter pilórico formato incorrecto, reflujo duodenogástrico, y una transformación del estómago distal en destino proximal. Los cambios de expresión génica observados para la Wnt9b: EGFP
transgén se compararon con un alelo β-catenina estabilizada para determinar que Wnt9b está activando la vía Wnt canónica en los tejidos analizados. Estos resultados demuestran que la expresión de Wnt9b Hoteles en SIX2
células positivas interrumpe las decisiones del destino celular en el riñón y el tracto gastrointestinal}

Visto:. Kiefer SM, L Robbins, Rauchman M (2012) Expresión condicional de Wnt9b en SIX2
células positivas Interrumpe estómago y renal. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10.1371 /journal.pone.0043098

Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón

Recibido: 29 de febrero de 2012; Aceptado: 17 Julio 2012; Publicado: 17 Agosto, 2012

Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01 DK067222 (http://nih.gov/) y la Asociación Americana del Corazón de la empresa 0840117N investigador (http://www.heart.org) a MR. SK fue apoyado por un Premio de la Universidad Fondo de Investigación Presidencial Saint Louis (www.slu.edu). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

La vía canónica de señalización Wnt es un regulador clave del destino celular, la proliferación celular, y la adhesión celular durante el desarrollo y en la edad adulta. Numerosos mediadores positivos y negativos se han identificado que el trabajo en conjunto para lograr una regulación estricta de la señalización de β-catenina. El paradigma central es que citoplásmica β-catenina es secuestrada en un complejo de la destrucción, fosforilados por GSK3, y dirigido a la vía de destrucción de ubiquitina en ausencia de una señal de Wnt. inhibe Wnt unión fosforilación y la destrucción de β-catenina, permitiendo que se translocan al núcleo para afectan expresión del gen diana con los factores TCF /LEF (revisado por MacDonald et al. [1]). Numerosos modelos de ratón han sido creados para estudiar esta vía que incluye tanto la ganancia y la pérdida de alelos de función de Wnt, receptores de Wnt, β-catenina, y los reguladores TCF /LEF transcripcional. Estos modelos han descubierto papeles esenciales para la señalización canónica de Wnt en el hueso, cabello, intestino, sangre, y el cáncer [2]. Un tema que emerge de estos estudios es que muchos procesos biológicos son extremadamente sensibles a la fuerza de la señalización de Wnt canónica.

Esta estrecha regulación de la señalización de Wnt canónica es esencial para el desarrollo del riñón. Durante las etapas iniciales de la formación del riñón, Wnt9b se secreta de la yema ureteral y señales a las células progenitoras en el mesénquima tapa para inducir la diferenciación nefrona. El tratamiento con cloruro de litio o activación de β-catenina puede inducir la diferenciación de nefronas en ausencia de la yema ureteral y Wnt9b, lo que sugiere que un aumento en la señalización Wnt canónica es suficiente para este evento inductivo [3], [4]. Algunas células tapa mesénquima proliferan para mantener las células progenitoras que se requieren para las iteraciones subsiguientes del proceso [5]. Este equilibrio entre el mantenimiento de progenitores y la inducción de la diferenciación es de suma importancia para asegurar que el riñón constituye el complemento completo de nefronas [5], [6], [7], [8], [9].

Varios factores expresados ​​en el mesénquima tapa han demostrado antagonizar la diferenciación estimulada por Wnt, incluyendo el factor de transcripción SIX2
. Supresión de SIX2
resultados en la diferenciación ectópica, el agotamiento de los progenitores casquillo del mesénquima, y ​​agenesia renal [9]. Aunque el mecanismo exacto no se conoce todavía, una hipótesis se ha propuesto por lo altos niveles de señalización de Wnt canónica coche el compromiso de la diferenciación mientras que la actividad alta SIX2 en las mismas células mantiene el destino progenitor [7]. Hemos creado un nuevo modelo de ratón que sobreexpresan condicionalmente Wnt9b para activar la vía de señalización Wnt canónica. Hemos utilizado este modelo para probar si el aumento de la actividad Wnt9b es suficiente para perturbar el equilibrio entre los progenitores y la diferenciación en el mesénquima tapa.

Un segundo sitio en el que tanto la actividad SIX2 y la señalización Wnt juegan un papel importante es el esfínter pilórico . El esfínter pilórico se forma en el extremo distal del estómago y funciona como una válvula para permitir la digestión adecuada de los alimentos antes de su entrada en el duodeno. Disfunción del esfínter puede resultar en reflujo del contenido duodenal en el estómago que presenta un mayor riesgo de metaplasia gástrica y cáncer [10], [11]. Esta región es también el sitio de anomalías congénitas, incluyendo el trastorno de reflujo duodenogástrico primaria rara y el defecto congénito más común de estenosis pilórica [12]. SIX2
deficiencia conduce a la agenesia del esfínter pilórico y antagonizar la actividad de Wnt con Sfrp1 y SFRP2 se requiere al patrón del estómago [13], [14]. Esto nos llevó a la hipótesis de que la actividad de Wnt canónica debe ser estrechamente regulada en el píloro similares a lo que se ha propuesto en el riñón. Para probar esto, hemos usado SIX2
-cre para activar el Wnt9b
transgén en SIX2
que expresa dominios en los riñones y el estómago.

El condicional Wnt9b
alelo transgénico informó aquí expresa Wnt9b
y GFP cuando se activa mediante recombinasa CRE. Es biológicamente activo y capaz de rescatar la formación de riñón en Wnt9b ^{- /-
embriones. La sobreexpresión de Wnt9b
en la yema ureteral riñón es capaz de inducir los genes asociados con la diferenciación de mesénquima tapa, pero no se somete a mesenquimal a epitelial de transición (MET) para producir estructuras de vesículas morfológicamente distintos. Wnt9b
la activación del transgén en SIX2
células positivas provoca quistes renales y una transformación de las regiones distales del estómago hacia el destino estómago proximal. Comparación de los Wnt9b
transgénicos a un alelo que produce estabilizan la proteína β-catenina demuestra cambios en los genes dosis-respuesta y sugiere que estas cepas representan una serie alélica que debe ser valioso para la modulación de la señalización de Wnt canónica en otros tejidos.}

Resultados

Los ratones transgénicos que expresan Wnt9b cuando es activado por la recombinasa CRE

El transgén Wnt9b se construyó con un cassette lox-STOP [15] para crear un Wnt9b condicional activa que depende de cre recombinasa para la expresión (Fig. 1A). Una vez activado, el Wnt9b transgén expresado es distinguible de endógeno Wnt9b, ya que contiene una etiqueta de influenza hemaglutinina epítopo C-terminal y células transgénicas exhibirá fluorescencia GFP debido a la casete IRES-EGFP. Para probar la fidelidad del transgén, se analizó la expresión de cre-dependiente en células cultivadas e in vivo en embriones (Fig. 1B). Etiquetadas con epítopo Wnt9b era detectable en los lisados ​​de las células co-transfectadas con el transgen y un plásmido cre, y no en transfecciones del transgén solo. Del mismo modo, lisados ​​de embriones que fueron positivos para ambos Wnt9b y β-actina-cre transgenes contenían Wnt9b-FLU mientras que los transgénicos individuales Wnt9b no lo hicieron. la fluorescencia de GFP se observó en embriones positivos dobles /β-actina-cre Wnt9b y no en los compañeros de camada Wnt9b (Fig. 1C-F). El nivel de expresión transgénica Wnt9b correlacionada con la intensidad de la fluorescencia de GFP para cada línea fundadora. (Fig. 1D). Cuatro líneas fundadoras independientes fueron incapaces de producir en vivo β-actina-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ cachorros dobles heterocigotos, lo que demuestra que la expresión elevada Wnt9b ubicua es embriones letal. Análisis de las fases embrionarias reveló que β-actina-cre tg /+, se detectaron Wnt9b TG /+ embriones heterocigotos dobles en menos de lo esperado frecuencias mendeliana en E11-E12. Un solo embrión doble heterocigotos se observó a partir de un fundador con muy alta expresión (Fig. 1A, n = 23, la frecuencia esperada del 25%) y 16% se observó a partir de un fundador diferente (n = 25). Wnt9b /ß-actina-Cre embriones transgénicos dobles tenían corazones más pequeños con el estancamiento de la sangre, lo que sugiere insuficiencia cardíaca como la causa de la muerte.}

transgénico Wnt9b es biológicamente activa

Para determinar si es transgénico Wnt9b biológicamente activa, hemos probado si era capaz de sustituir de tipo salvaje Wnt9b
durante el desarrollo del riñón. Wnt9b <sup>- /-
embriones exhiben una alta penetrancia paladar hendido y fenotipos agenesia renal (Fig. 2). La activación de Wnt9b transgénico en la yema ureteral con Hoxb7
-cre rescatado formación de riñón, pero no paladar cierre en E14.5 en todos los Hoxb7
-cre tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b tg /+ embriones (n = 7). Este rescate-riñón específica confirma que la expresión transgénica Wnt9b depende de la activación cre, porque el paladar no expresa Hoxb7
-cre. PCR cuantitativa de tipo salvaje, Wnt9b - /- Opiniones y Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ riñones transgénicos revelaron que transgénica Wnt9b
se expresó en niveles 2.3- veces mayor que la del gen de tipo salvaje, mientras que la expresión de Ret
se mantuvo sin cambios (Fig. 2 G-I). La capacidad de Wnt9b transgénico para señalar al mesénquima para reemplazar de tipo salvaje Wnt9b
actividad confirma que es biológicamente activo in vivo.</sup>

Una gran cantidad de datos ha demostrado que Wnt9b y β-catenina de señalización son señales inductivas críticos que inician la diferenciación de mesénquima tapa en vesículas renales epitelializadas [4], [8], [16]. Wnt9b producido en la yema ureteral activa la vía canónica de señalización Wnt en el mesénquima adyacente y los resultados en la expresión de genes que regulan mesenquimal epitelial de transición (MET). Por lo tanto, hemos probado si la sobreexpresión de Wnt9b Hoteles en la yema ureteral sería una señal de que el mesénquima para activar la expresión de genes MET y para promover una mayor inducción de nefronas. Wnt9b
se sobreexpresa en la yema ureteral mediante Hoxb7
-cre: EGFP. embriones E12.5 fueron genotipo por análisis de PCR cuantitativa para determinar si eran hemizygous o homocigotos para el Wnt9b
transgén y se recogieron los riñones para el análisis de la expresión génica. Se detectó un aumento dependiente de la dosis en Wnt9b Windows que fue acompañado por una activación proporcional de expresión de los genes diana Wnt9b, Wnt4
, Pax8
, y Fgf8
en tres grupos independientes de los riñones transgénicos (Fig. 2J). SIX2
se expresa en el mesénquima indiferenciado (PAC) y es downregulated como la diferenciación de vesículas se produce [17]. SIX2
la expresión de ARNm no se ve afectada en Hoxb7
-cre, Wnt9b
transgénicos dobles. Del mismo modo, los genes yema ureteral, Ret
y Wnt11
, no se modifican significativamente por la sobreexpresión de Wnt9b
. La regulación positiva específica de genes en el mesénquima confirma que transgénica Wnt9b es capaz de la señalización de la yema ureteral para inducir genes importantes para MET, sin embargo, evidencia histológica de vesículas renales epitelializado ectópicos fue evidente (datos no mostrados). Esto sugiere que la regulación positiva de Wnt9b
en la yema ureteral es suficiente para la activación de genes en el mesénquima, pero no para la diferenciación morfológica de las vesículas renales.

misexpression de Wnt9b altera la función renal y la formación de esfínter pilórico mediante la activación de la señalización canónica
β-catenina

el paradigma emergente en el riñón es que hay un delicado equilibrio entre la renovación progenitora auto y la activación de la diferenciación [6], [7], [9]. Se requiere que la vía /β-catenina Wnt9b para la diferenciación y SIX2 suprime la diferenciación en el paso inicial de compromiso. Por lo tanto, la hipótesis de que la capacidad de SIX2 para promover las decisiones del destino opuesta a las activadas por alta actividad de β-catenina podría ser un tema común en el desarrollo. Hemos probado esta posibilidad mediante la activación de transgénicos Wnt9b
con SIX2
-cre. Los dobles transgénicos expresan Wnt9b
en las mismas células que expresan SIX2
y podría perturbar los procesos que son regulados de forma coordinada en el riñón y otros tejidos. SIX2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
ratones mostraron malestar al destete y mediciones de peso corporal se redujo en un 39% a las cuatro semanas (14.5 ± 3.4 gramos, p < 0,001) en comparación con cre-negativo Wnt9b tg /+
hermanos de camada (23,6 ± 0,7 gramos). El análisis fenotípico reveló que esta reducción en el peso corporal se debe a malformaciones en el sistema gastrointestinal y los riñones, dos sitios de SIX2
-cre expresión (Fig. 3).}

Numerosos quistes de diverso tamaños eran visibles en la corteza y la médula de los riñones heterocigotos dobles (Fig. 4, n = 11/11). Los quistes se localizan predominantemente en la corteza y médula externa y eran de origen túbulo proximal como se demuestra por LTL-tinción. La enfermedad quística fue primero evidente poco después del nacimiento (P7-10) en los segmentos proximales de la nefrona (datos no mostrados). Estos animales dobles heterocigotos mostraron niveles elevados de creatinina sérica en (0,652 ± 0,044, p < 0,005) en comparación con el control de camada (0,119 ± 0,002) tan pronto como a ~ 3 semanas de edad, lo que indica una insuficiencia renal grave. Los animales más viejos con enfermedad avanzada también contenían quistes derivados de los segmentos más distales, incluyendo el asa de Henle (Tamm-Horsfall-positivo). En todos los animales con insuficiencia renal avanzada examinados, se observó que recogen muchos quistes del conducto derivado que expresaban acuaporina 2 o unida D. Biflorus
-lectin. Desde SIX2
-cre no se expresa en el conducto colector, esta dilatación es probable secundario a la dilatación de los segmentos más proximales. La presencia de quistes renales en Wnt9b
animales transgénicos refuerza la conclusión de que la interrupción del sistema de señalización Wnt causa la enfermedad quística [7], [18], [19].

Aunque los quistes renales eran no está presente hasta después del nacimiento, la regulación positiva de la señalización de Wnt canónica fue evidente en E12.5 cuando SIX2
-cre se expresa inicialmente. expresión de la proteína Lef1 se incrementó en los agregados pre-tubulares y estructuras de vesículas renales en los dobles transgénicos y se incrementó aún más en las numerosas vesículas ectópicos formados en los riñones de ß-catenina estabilizadas (N = 3, Fig. 5). El aumento sensible a la dosis en la expresión Lef1 compatible con los datos que Wnt9b está actuando bien la vía de señalización Wnt canónica en el riñón en desarrollo [7] publicado. La falta de estructuras vesiculares ectópicos en el Wnt9b
transgénicos sugiere que el Wnt9b
alelo exhibe un efecto moderado sobre la señalización de β-catenina en comparación con el alelo β-catenina estabilizada.

El segundo fenotipo que contribuye a la reducción del peso corporal en SIX2-cre ^{tg /+
, Wnt9b molestias gástricas tg /+
dobles heterocigotos fue. se observó líquido amniótico amarillo en el estómago de los transgénicos dobles y no en los compañeros de camada transgénicos individuales (n = 6, Fig. 6). Esto indicó que el reflujo duodenogástrico estaba ocurriendo y podría ser debido a la formación esfínter pilórico anormal. El esfínter entre el estómago y el duodeno fue alargado y se amplió en el doble transgénicos (Fig. 6, recuadro). El antagonista de TGF, Nephrocan, que normalmente se expresa en un patrón muy restringido en E16.5, se amplió en los transgénicos dobles, lo que sugiere que la región del esfínter no estaba limitada correctamente. Esta morfología alargada fue apoyada por la tinción inmunohistoquímica de la capa de músculo liso que forma la pared muscular denso que rodea el píloro (Fig. 6 E, F). En los controles transgénicas individuales, se encontró que la musculatura más gruesa donde el tejido exhibe la más constricción en el esfínter (línea). En los dobles transgénicos, se observó la musculatura gruesa, pero esta región estaba desplazada de la zona que fue el más constreñido.}

Mis-defectos de modelado también se observaron mediante el análisis de marcadores específicos que distinguen entre los extremos proximal (H ^{+ /K + ATPasa) y la) región distal (azul Alcian del estómago. El estómago proximal (corpus) contiene H + /K + ATPasa que expresan las células parietales que se excluyen de la región antro-píloro. A la inversa, el antro-píloro contiene células de la mucosa que se tiñen con azul de Alcian que no se encuentran en la región proximal [20]. Los dobles transgénicos exhiben persistente H + /K + ATPasa las manchas y la ausencia de la mucosa azul-positivo Alcian en el antro del estómago-píloro lo que indica que la región distal está mal modelada a destino proximal por Wnt9b
expresión. Tinción con azul Alcian de las células caliciformes en el intestino estaba intacto en los transgénicos individuales y dobles, porque SIX2
-cre no se expresa en el duodeno. Este mal patrón sugiere que, al igual que el paradigma en el riñón, la señalización de β-catenina canónica especifica un destino, la región panza, y los patrones de actividad SIX2 la identidad distal. Esto es apoyado por los dominios de expresión de estos genes ya un reportero de señalización Wnt canónica exhibe alta actividad sólo en la panza, y SIX2
se limita a la porción distal del estómago y el píloro [13], [14].}

Si la señalización de Wnt canónica es responsable del reflujo gastroduodenal en SIX2-Cre ^{TG /+
, Wnt9b TG /+
transgénicos dobles, a continuación, las malformaciones observado debe ser recapitulado en un modelo de ratón que expresa una β-catenina estabilizada en el mismo dominio ( CTNNB1 eX3 /+
, [21]). Después de la activación cre, este alelo evita la degradación proteolítica de la β-catenina y sería de esperar para elevar canónica de señalización Wnt en un grado mayor que Wnt9b ligando solo. Todo el montaje en el análisis in situ de los estómagos E12.5 reveló tres genes, Grem1
, Nkx 2.5
, y Gata3
, que normalmente se expresa en una banda delgada demarcación de la región que se convertirá en el esfínter (n = 8, Fig. 7). La expresión ectópica de Wnt9b
suprimió el antagonista de BMP Grem1
y el factor de transcripción Gata3
en esta región, y estos genes se downregulated aún más cuando se aumentó la señalización de β-catenina. Se observó una expansión dependiente de la dosis para el factor de transcripción Nkx2.5
en ambos mutantes. Los genes que se localizan exclusivamente en el intestino ( vilina
) o a la panza ( Bmp4
) no fueron alterados en cualquiera de mutantes (datos no mostrados). Aumento de la canónica de señalización Wnt en el estómago antral y el píloro se confirmó mediante el aislamiento de esta región y la realización de PCR cuantitativa. Los genes diana canónica de Wnt que están regulados al alza en el alelo β-catenina estabilizada, Lef1
y AXIN2
, se produjo un incremento en la región pilórica del SIX2
-cre tg /+, Wnt9b TG /+ dobles transgénicos [ Lef1
, 2,0 ± 0,25 y AXIN2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. En conjunto, las dosis-respuesta de la expresión génica cambios observados en la región pilórica en el Wnt9b
transgénicos y los embriones β-catenina estabilizada demuestran que el aumento de la señalización de Wnt canónica interrumpe estómago distal y el desarrollo del esfínter pilórico.}

Discusión

Estos resultados describen la creación de un nuevo modelo de ratón que activa condicionalmente canónica de señalización Wnt. La Wnt9b
transgen es inducible tras la exposición a la recombinasa cre y expresa GFP como un marcador de la inducción. También conserva la actividad biológica completa, ya que puede rescatar Wnt9b ^{- /-
fenotipos en el riñón. Estos ratones se han mantenido en nuestra colonia de más de un año e inducir Wnt9b
expresión a la cría de varias cepas diferentes cre. Hemos utilizado esta nueva cepa de activar la señalización de Wnt en SIX2
células positivas y se encontró efectos deletéreos en el riñón y el estómago.}

En el riñón, Wnt9b es secretada por el epitelio yema ureteral para inducir a las células progenitoras casquillo mesénquima adyacente para iniciar la diferenciación. En apoyo de este modelo, nuestra in vivo ganancia de la función de los estudios muestran que Wnt9b
upregulates marcadores tempranos de diferenciación de vesículas renales tales como Wnt4
, Fgf8
y Pax8
. Sin embargo, a pesar de que los genes de vesículas renales son inducidas por el Wnt9b
transgén, no observamos evidencia morfológica de la formación de vesículas renal aumentado o ectópico, según lo informado por SIX2
mutantes [9]. Además de una señal inductiva Wnt, los factores que mantienen la piscina progenitor renal (por ejemplo, SIX2
) también deben ser regulados a la baja para provocar completamente la formación de vesículas renal. SIX2
expresión no se alteró en nuestro Wnt9b
transgénico y por lo tanto puede explicar por qué el aumento de Wnt9b no dio lugar a vesículas renales ectópicos. inducción ectópica de marcadores de vesículas renales es inducida por la activación de β-catenina en SIX2
mesénquima metanéfrico -positivo utilizando el alelo β-catenina estabilizada [4], por lo tanto, la diferencia entre estos dos experimentos con ganancia de función pueden relacionarse con el grado en que activan la actividad de Wnt canónica. Además, es probable que la activación de la señalización canónica por Wnt9b en mesénquima metanéfrico induce la inhibición de retroalimentación, como se señaló en otros tejidos que responden a Wnt, evitando de este modo la inducción de la diferenciación programa completo [22]. Los datos recientes apoyan esta idea de la inhibición por retroalimentación ya que se requiere la señalización /β-catenina Wnt9b no sólo para la diferenciación de mesénquima metanéfrico, pero, paradójicamente, también se requiere la misma señal para el mantenimiento o ampliación de la piscina progenitoras renal [7]. Los autores especulan que la β-catenina estabilizada, que actúa aguas abajo en la vía, puede pasar por alto estos mecanismos de regulación. Estas posibilidades se podrían probar en futuros estudios que comparan en la activación de genes aguas abajo en las células progenitoras renal mediante el Wnt9b
transgén y se estabilizan los ratones β-catenina ganancia de la función.

Las perturbaciones en el canónica vía de señalización Wnt han demostrado ser importantes en la patogénesis de la enfermedad quística renal (revisado por Patel et al. [23]). la expresión transgénica de una β-catenina estabilizada o deficiencia de APC en el epitelio tubular renal conduce a la enfermedad quística renal, apoyando la conclusión de que la señalización Wnt canónica ectópico es suficiente para quistogénesis [18], [19]. insuficiencia renal y dilatación quística en SIX2
-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ heterocigóticos dobles apoya la hipótesis de que regula positivamente la señalización de Wnt canónica causa quistes. La interrupción de la vía de señalización Wnt no canónica (PCP) es también importante en la formación de quistes renal [24]. Por lo tanto, es posible que la formación de quistes en nuestro modelo no es simplemente debido a la activación de la señalización canónica, pero es el resultado de la interrupción del equilibrio relativo entre la señalización canónica y no canónica. En apoyo de esta idea, los genes que están mutados en las formas hereditarias de la enfermedad quística ( PKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) localizar a cilios y estos orgánulos han sido recientemente demostrado ser capaz de regular el equilibrio entre canónica y no canónica de Wnt de señalización [25], [26].}

había una grave fenotipo renal aunque Wnt9b
expresión de ARNm se incrementa ~ 2 veces en nuestra transgén, lo que indica que el nivel relativamente bajo, la activación persistente de esta vía conduce a la disfunción renal. Este nivel de regulación al alza de Wnt9b en la yema ureteral mediante Hoxb7
-cre no produjo quistes, lo que sugiere que la quistogénesis en los túbulos colectores en SIX2
-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ dobles transgénicos es probablemente un efecto secundario de segmentos tubulares dilatadas (datos no mostrados). En apoyo de esto, en el post-natal día 7-10 animales, enfermedad quística es evidente en los segmentos única del túbulo proximal al conducto colector. Al igual que en la poliquistosis renal en los pacientes, los ratones transgénicos que desarrollaron insuficiencia renal grave, a pesar de que la mayoría de las nefronas no desarrollan quistes. Esto plantea la cuestión de si los túbulos renales sin quistes manifiestos son anormales y contribuyen de manera significativa al deterioro funcional progresivo de estos trastornos. Estudios recientes demuestran que adultos renales del túbulo epitelios expresan Wnt9b, los receptores Frizzled y /6 co-receptores LRP5 que son capaces de mediar la señalización de Wnt canónica en respuesta a la lesión isquémica aguda [27]. En esta configuración, la señalización de Wnt promueve la reparación y regeneración de túbulos. Sin embargo, la actividad de la señalización de Wnt también se ha implicado en la promoción de la fibrosis renal después de la lesión, como en el modelo de la OUU [28]. En general, estos estudios ponen de relieve la importancia de la regulación de la señalización de Wnt en el riñón adulto para equilibrar respuestas beneficiosas, como la reparación /regeneración, y las respuestas de mala adaptación que conducen a la fibrosis y disfunción orgánica crónica.}

La región pilórica del estómago representa un límite crítico que separa el estómago del intestino. el cierre del esfínter cuando un bolo de alimento entra en el estómago permite una digestión adecuada antes de tránsito en el intestino delgado. La base molecular para la formación de esta región discreta no se entiende bien, aunque están surgiendo algunos detalles. Estos resultados sugieren que el control estricto de la señalización de Wnt es vital para el desarrollo del píloro. se detecta actividad de Wnt Canonical en el fundus y el cuerpo (corpus) pero excluido del estómago distal y el píloro [13]. En Barx1
- /- ratones, el estómago es pequeño, el límite del antro-corpus es borrosa y hay agenesia del esfínter pilórico. estudios elegantes de recombinación de tejidos sugieren que estos fenotipos son el resultado de la pérdida de expresión de la Wnt antagonistas Sfrp1 y SFRP2. Sin embargo, dado Barx1
deficiencia tiene efectos globales sobre el desarrollo del intestino anterior, no estaba claro si la baja regulación de la actividad de Wnt canónica se requiere específicamente para la formación del píloro. Nuestros estudios más directamente a prueba esta posibilidad, al centrarse en la actividad ectópica Wnt a una región restringida justo anterior al píloro con SIX2
-cre.

Se encontró que la actividad de Wnt ectópico interrumpe específicamente la formación del píloro esfínter en ausencia de defectos mundiales en el desarrollo estómago. Por lo tanto, se requiere la regulación por disminución de la actividad de Wnt canónica al patrón de la región pilórica que separa el estómago del intestino. La expresión ectópica del ligando Wnt9b y estabilizado β-catenina en ratones transgénicos podrían superar los efectos de antagonistas de Wnt secretadas endógenos Sfrp1 /2, en consonancia con el modelo propuesto por Kim et al [13]. Similar a nuestros resultados, en SIX2
mutantes que se reduce la expresión de Nkx2.5
y Gremlin
, los genes que son importantes para el desarrollo del esfínter pilórico en el pollo [14] , [29]. Esto sugiere que SIX2
y Wnt regulan
una cascada genética común en el esfínter pilórico presuntiva. Postulamos que una función importante de SIX2
puede ser de interpretar las señales de Wnt canónica en diferentes contextos de desarrollo.

canónica de señalización Wnt Upregulated también se ha demostrado que afecta el bazo y el desarrollo del páncreas [30]. En apoyo de esto, el bazo y el páncreas hipoplasia también se observó en SIX2
-cre, Wnt9b
ratones bi-transgénico (datos no mostrados). Desde SIX2
-cre no se expresa en estos tejidos, esto sugiere que las señales de la mesénquima posterior estómago pueden afectar el bazo y el páncreas durante el desarrollo. Esto apoyaría la hipótesis de que la región pilórica puede actuar como un organizador para la formación de estos órganos accesorios. Durante el desarrollo, las células precursoras de bazo asocian transitoriamente con la región pilórica, antes de su migración a la izquierda del estómago, donde se condensan [31]. Aunque no detectamos SIX2
-cre expresión en el bazo o el primordio mesotelio, no podemos excluir que la expresión transitoria de SIX2
-cre en estas regiones es responsable de los defectos en el bazo y el páncreas . Se necesitan más estudios para probar directamente estas posibilidades.

En resumen, hemos desarrollado un nuevo modelo de ratón que permite la expresión temporal y espacial de Wnt9b. En el riñón en desarrollo, transgénico Wnt9b
puede inducir primitiva se reunía la expresión génica en SIX2
progenitores renales -positivos, pero no es suficiente para activar el programa de diferenciación completa. expresión persistente de Wnt9b en SIX2
células positivas conduce a quistes renales e insuficiencia orgánica grave. En el estómago, la actividad β-catenina Wnt ectópico en la región pilórica altera la formación de esfínter y el patrón estómago distal. En conjunto, estos resultados ponen de relieve la importancia de un estricto control de la actividad de Wnt y sugieren que SIX2 y β-catenina están implicados en la morfogénesis de órganos en diferentes contextos.

Materiales y Métodos

Ética declaración

los estudios con animales fueron aprobados por el comité de cuidado de los animales y el uso de la Saint Louis University (protocolo 1460) y el Louis St. VA (protocolo 0305). Todos los procedimientos con animales estaban en conformidad con las institucionales de bienestar animal reglamentos, normas y políticas.

Ratones

Wnt9b
ratones transgénicos fueron cruzadas a cada una de las tres líneas diferentes cre [32 ]. 1) cre β-actina se utilizó para expresar Wnt9b ubicua (Fig 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre:. EGFP se utilizó para sobreexpresar Wnt9b en su ubicación endógena en el riñón, el ureteral brote (Fig 2, [34].), y 3) el BAC SIX2
-cre: EGFP transgén se utiliza para expresar Wnt9b exógenamente en el estómago y el riñón (Figs 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

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