PLoS ONE: Voorwaardelijke Expressie van Wnt9b in Six2-positieve cellen verstoort de maag en Kidney Function

Abstract

Tijdens de ontwikkeling van de nieren, de Wnt-signalering activeert differentiatie, terwijl de transcriptiefactor Six2 handhaaft de voorlopercellen pool. Deze tegengestelde signalen helpen om nefronen vorming reguleren en zorgen voor de volledige aanvulling van nefronen gevormd. Aangezien deze twee factoren te controleren verschillende lot in de nieren mesenchym, we de hypothese dat overexpressie van Wnt9b
in Six2
tot expressie brengen cellen zou de vorming van de nieren te verstoren en kunnen celdifferentiatie beslissingen in andere weefsels te veranderen. We hebben een transgene muis die voorwaardelijk sprak de Wnt ligand in de ontwikkeling van de nieren, Wnt9b
. Het transgen wordt geactiveerd door cre-recombinase tot expressie en GFP. We hebben eerst de biologische activiteit getest met behulp van Hoxb7-cre Kopen en vond dat transgene Wnt9b was kan induceren differentiatie genen en het redden van de ontwikkeling van de nieren in Wnt9b ^{- /-
homozygote deficiënte muizen. In tegenstelling tot de expressie van Wnt9b
in cellen met Six2-cre
veroorzaakte gastro-intestinale klachten en ernstige nierinsufficiëntie bij volwassen muizen. Transgene nieren had talrijke cystic tubuli en verhoogde creatinine waarden (0,652 ± 0,044) in vergelijking met wildtype muizen (0,119 ± 0,002). Deze dieren vertoonden ook een misvormde pyloric sluitspier, duodenogastrische reflux, en een transformatie van de distale maag in proximale lot. Genexpressie veranderingen waargenomen voor de Wnt9b: EGFP
transgen werden vergeleken met een gestabiliseerde β-catenine allel ter bepaling Wnt9b activeert de Wnt route in de weefsels geanalyseerd. Deze resultaten tonen aan dat de expressie van Wnt9b
in Six2
-positieve cellen verstoort cel beslissingen over het lot in de nieren en het maag-darmkanaal}

Visum:. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) voorwaardelijke expressie van Wnt9b in Six2
-Positieve Cells verstoort de maag en nierfunctie. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10.1371 /journal.pone.0043098

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Ontvangen: 29 februari 2012; Aanvaard: 17 juli 2012; Gepubliceerd: 17 augustus 2012

Dit is een open-access artikel, vrij van auteursrechten, en mag vrij worden gereproduceerd, gedistribueerd, verzonden, gewijzigd, gebouwd op, of anderszins gebruikt door iedereen voor elk rechtmatig doel. Het werk wordt onder de Creative Commons CC0 publieke domein toewijding ter beschikking gesteld

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​R01 DK067222 (http://nih.gov/) en de American Heart Association Opgericht Investigator 0840117N (http://www.heart.org) MR. SK werd ondersteund door een Saint Louis University Presidential Research Fund Award (www.slu.edu). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

De Wnt signaleringsroute is een belangrijke regulator van het lot van de cel, celproliferatie en celadhesie tijdens de ontwikkeling en de rest van de volwassenheid. Tal van positieve en negatieve mediators zijn samen vastgesteld dat het werk aan strakke regulering van β-catenine signalering te bereiken. De centrale paradigma dat cytoplasmatisch β-catenine wordt afgezonderd in een vernietiging complex gefosforyleerd door GSK3ß en gericht op de vernietiging ubiquitine route in de afwezigheid van een Wnt signaal. Wnt binding remt fosforylatie en vernietiging van β-catenine, waardoor het naar de kern te beïnvloeden doelwitgenexpressie met TCF /LEF factoren (beoordeeld door MacDonald et al. [1]). Tal van muismodellen zijn gemaakt om deze route met inbegrip van zowel winst en verlies van functie allelen van Wnts, Wnt-receptoren, β-catenine te bestuderen, en de TCF /LEF transcriptie regulatoren. Deze modellen hebben een essentiële rol voor de Wnt-signalering in het bot, haren, darmen, bloed en kanker [2] blootgelegd. Een nieuwe thema van deze studies is dat vele biologische processen zijn acuut gevoelig voor de kracht van de Wnt-signalering.

Dit strakke regulering van de Wnt-signalering is van essentieel belang voor de ontwikkeling van de nieren. Tijdens de eerste stadia van de vorming nier wordt Wnt9b uitgescheiden door de ureterknop en signalen naar cellen voorlopercellen in de kap mesenchym om nefron differentiatie induceren. Behandeling met lithiumchloride of activering van β-catenine kan nefron differentiatie induceren bij afwezigheid van de ureterknop en Wnt9b, suggereert dat een toename van Wnt signalering volstaat dit inductieve gebeurtenis [3], [4]. Sommige cap mesenchym cellen prolifereren de progenitorcellen die nodig zijn voor latere iteraties van dit proces [5] handhaven. Dit evenwicht tussen progenitor onderhoud en de inductie van differentiatie van het grootste belang dat de nier vormt de volledige aanvulling van nefronen [5], [6], [7], [8], [9].

Verschillende factoren uitgedrukt in de kap mesenchym is aangetoond dat Wnt-gestimuleerde differentiatie zoals de transcriptiefactor Six2
antagoniseren. Schrapping van de Six2
resultaten in buitenbaarmoederlijke differentiatie, uitputting van de kap mesenchym voorouders, en nieren agenesis [9]. Hoewel het exacte mechanisme nog niet bekend is, is een hypothese voorgesteld, waarbij een hoog niveau van Wnt-signalering rijden de inzet voor differentiatie, terwijl hoge Six2 activiteit in dezelfde cellen handhaaft de voorlopercellen lot [7]. We hebben een nieuwe muis-model gemaakt om voorwaardelijk overexpressie Wnt9b de Wnt signaleringsroute te activeren. We hebben dit model gebruikt om te testen of verhoogde Wnt9b activiteit voldoende is om het evenwicht tussen progenitors en differentiatie in de kap mesenchym verstoren.

Een tweede site waar zowel Six2 activiteit Wnt signalering een belangrijke rol speelt is de pylorische sfincter . De pylorische sfincter is gevormd aan het distale uiteinde van de maag en functioneert als een klep om een ​​goede vertering van voedsel mogelijk vóór de binnenkomst in het duodenum. Disfunctie van de sluitspier kan leiden tot reflux van ulcus inhoud in de maag risicobedrijf van gastrische metaplasie en kanker [10], [11]. Deze regio is ook de site van aangeboren afwijkingen waaronder de zeldzame aandoening primaire duodenogastrische reflux en de meest voorkomende aangeboren afwijking pylorusstenose [12]. Six2
tekort leidt tot agenesis van de pyloric sluitspier en het tegenwerken van Wnt activiteit sFRP1 en sFRP2 nodig is om patroon van de maag [13], [14]. Dit leidde ons tot de hypothese dat Wnt activiteit sterk wordt afgesteld de pylorus vergelijkbaar met hetgeen in de nier voorgesteld. Om dit te testen hebben we gebruik Six2
-cre het activeren van de Wnt9b
transgen in Six2
uitdrukken domeinen in de nieren en maag.

De voorwaardelijke Wnt9b
transgene allel hier gerapporteerde uitdrukt Wnt9b Kopen en GFP wanneer geactiveerd door cre recombinase. Het is biologisch actief en in staat om het redden van de vorming van de nieren in Wnt9b ^{- /-
embryo's. Overexpressie van Wnt9b
in de nieren ureterknop in staat is tot het induceren van genen geassocieerd met de differentiatie van de kap mesenchym, maar heeft mesenchymale-to-epitheliale overgang (BMO) niet ondergaan om morfologisch verschillende blaasje structuren te produceren. Wnt9b
transgene activering in Six2
-positieve cellen veroorzaakt nier cysten en een transformatie van de distale maag regio's in de proximale maag lot. Vergelijking van de Wnt9b
transgenen naar een allel dat gestabiliseerde β-catenine eiwit toont dosis-responsief gen veranderingen en suggereert dat deze stammen vertegenwoordigen een allelische reeks die belangrijk is voor het moduleren van Wnt-signalering in andere weefsels moeten zijn.}

Resultaten

transgene muizen brengen Wnt9b wanneer geactiveerd door cre recombinase

De Wnt9b transgeen werd gebouwd met een lox-STOP-cassette [15] om een ​​voorwaardelijk actief Wnt9b die afhankelijk is van cre creëren recombinase tot expressie (Fig. 1A). Eenmaal geactiveerd, het transgen tot expressie Wnt9b kan worden onderscheiden van endogeen Wnt9b want deze bevat een C-terminale influenza hemagglutinine epitooplabel en transgene cellen GFP fluorescentie vertonen vanwege de IRES-EGFP cassette. Om de betrouwbaarheid van het transgen te testen, onderzochten wij cre-afhankelijke expressie in gekweekte cellen en in vivo in embryo's (Fig. 1B). Epitoop-gemerkte Wnt9b was detecteerbaar in lysaten van cellen gecotransfecteerd met het transgen en een cre plasmide, en niet in transfecties van het transgen alleen. Ook lysaten uit embryo's die positief voor zowel Wnt9b en waren β-actine-cre transgenen bevatten Wnt9b-FLU terwijl enkele Wnt9b transgenen dat niet deden. GFP fluorescentie werd waargenomen in Wnt9b /-β-actine cre dubbele positieve embryo's en niet in Wnt9b nestgenoten (Fig. 1C-F). De expressie niveau van transgene Wnt9b gecorreleerd met de intensiteit van GFP fluorescentie voor elke oprichter lijn. (Fig. 1D). Vier onafhankelijke oprichter lijnen waren niet in staat om de productie van live-β-actine-cre ^{TG /+, Wnt9b tg /+ dubbel heterozygoot pups, waaruit blijkt dat alomtegenwoordige verhoogde Wnt9b meningsuiting is embryonaal dodelijk. Analyse van de embryonale stadia bleek dat β-actine-cre TG /+, Wnt9b tg /+ dubbele heterozygote embryo's werden ontdekt op minder dan verwacht Mendeliaanse frequenties E11-E12. Een enkel dubbel heterozygote embryo werd waargenomen vanaf oprichtend met zeer hoge expressie (fig. 1A, n = 23, verwachte frequentie 25%) en 16% werd waargenomen vanuit een andere grondlegger (n = 25). Wnt9b /ß-actine-Cre dubbele transgene embryo's hadden kleinere harten met bundeling van bloed, wat suggereert hartinsufficiëntie als de oorzaak van de dood.}

Transgene Wnt9b biologisch actief

Om te bepalen of transgene Wnt9b is biologisch actieve, we getest of het in staat is het vervangen van wild-type Wnt9b
tijdens de ontwikkeling nier was. Wnt9b <sup>- /-
embryo's vertonen een hoge penetrantie gespleten verhemelte en renale agenesie fenotypes (afb. 2). Activering van transgene Wnt9b in de ureterknop met Hoxb7
-cre gered vorming van de nieren, maar niet gehemelte sluiting aan E14.5 in alle Hoxb7
-cre TG /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b tg /+ embryo's (n = 7). Dit nier-specifieke rescue bevestigt dat transgene Wnt9b expressie is afhankelijk van cre activering, omdat het gehemelte niet uitdrukken Hoxb7
-cre. Kwantitatieve PCR van wild-type, Wnt9b - /- Kopen en Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ transgene nieren bleek dat transgene Wnt9b
werd uitgedrukt in 2.3- voudig hoger niveau dan het wild-type gen, terwijl de expressie van Ret
onveranderd was (Fig. 2 G-I). Het vermogen van transgene Wnt9b te signaleren aan de mesenchym vervangen wildtype Wnt9b
activiteit bevestigt dat het biologisch actief is in vivo.</sup>

een schat aan gegevens hebben aangetoond dat Wnt9b en β-catenine signalering zijn kritisch inductieve signalen die de differentiatie van de kap mesenchym wijden in epitheliseerde renale blaasjes [4], [8], [16]. Wnt9b geproduceerd in de ureterknop activeert de Wnt signaling pathway in het aangrenzende mesenchym en resulteert in de expressie van genen die mesenchymale reguleren overgang epitheliale (MET). Daarom hebben we getest of overexpressie van Wnt9b
in de ureterknop zou signaal naar de mesenchym om BMO genexpressie te activeren en verhoogde inductie van nefronen te promoten. Wnt9b
werd overexpressie in de ureterknop met Hoxb7
-cre: EGFP. E12.5 embryo's werden gegenotypeerd door middel van kwantitatieve PCR-analyse om te bepalen of hemizygoot of homozygoot voor het Wnt9b
transgen en de nieren werden verzameld voor analyse van genexpressie. We hebben geconstateerd een dosis-afhankelijke stijging van de Wnt9b
dat ging gepaard met een evenredige activering van de expressie van de Wnt9b target genen, Wnt4
, PAX8 chromosomale
en FGF8
in drie onafhankelijke verzamelingen van transgene nieren (Fig. 2J). Six2
wordt uitgedrukt in ongedifferentieerde (cap) mesenchym en wordt neerwaarts gereguleerd als blaasje differentiatie volgt [17]. Six2
mRNA expressie wordt niet beïnvloed in Hoxb7
-cre, Wnt9b
dubbele transgenen. Ook de ureterknop genen, Ret Kopen en Wnt11
, zijn niet significant veranderd door overexpressie van Wnt9b
. De specifieke opwaartse regulatie van genen in het mesenchym bevestigt dat transgene Wnt9b is kan signaleren van de ureterknop om genen betrokken MET induceren echter geen histologisch bewijs van ectopische geëpithelialiseerd renale blaasjes bleek (gegevens niet getoond). Dit suggereert dat de opregulatie van Wnt9b
in de ureterknop volstaat genactivatie in het mesenchym, maar niet te morfologische differentiatie van renale vesicles.

misexpression van Wnt9b verstoort nierfunctie en vorming pylorische sfincter door het activeren canonieke β-catenine signalering

het paradigma ontstaan ​​in de nier is dat er een delicate balans tussen progenitor zelfvernieuwing en activering van differentiatie [6], [7], [9]. De Wnt9b /β-catenine route is nodig voor differentiatie en Six2 onderdrukt differentiatie bij de eerste stap van betrokkenheid. Daarom veronderstelden we dat het vermogen van Six2 om beslissingen over het lot tegenover deze geactiveerd door hoge β-catenine activiteit naar een gemeenschappelijke draad in ontwikkeling zijn. We testten deze mogelijkheid door activering van transgene Wnt9b hotels met Six2
-cre. De dubbele transgenen uit te drukken Wnt9b
in dezelfde cellen die uitdrukken Six2
en processen die gecoördineerd worden geregeld in de nieren en andere weefsels kunnen verstoren. Six2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
muizen vertoonden nood op het spenen en het lichaamsgewicht metingen werden verlaagd met 39% in vier weken (14,5 ± 3,4 gram, p < 0,001) in vergelijking met cre-negatieve Wnt9b tg /+
nestgenoten (23,6 ± 0,7 gram). Fenotypische analyse bleek dat deze vermindering in lichaamsgewicht was door afwijkingen in het maagdarmkanaal en de nieren, twee gebieden van Six2
-cre expressie (fig. 3).}

Talrijke cysten van verschillende maten waren zichtbaar in de cortex en medulla van dubbele heterozygote nieren (fig. 4, n = 11/11). De cysten werden hoofdzakelijk in cortex en buitenste medulla en waren proximale tubulus oorsprong zoals blijkt uit LTL-kleuring. De cystische ziekte was eerst zichtbaar kort na de geboorte (P7-10) in het proximale segment van de nefron (gegevens niet getoond). Deze dubbele heterozygote dieren vertoonden verhoogde serum creatinine niveaus (0,652 ± 0,044, p < 0,005) vergeleken met nestgenoten (0,119 ± 0,002) zo vroeg ~ 3 weken oud, wat aangeeft ernstige nierinsufficiëntie beheersen. Oudere dieren met gevorderde ziekte bevatte ook cysten afkomstig uit meer distale segmenten met inbegrip van de lus van Henle (Tamm-Horsfall-positief). In alle dieren met geavanceerde nierfalen onderzocht, zagen we veel verzamelen-duct afgeleide cysten die uitgedrukt Aquaporin 2 of gebonden D. Biflorus
-lectin. Aangezien Six2
-cre komt niet tot uitdrukking in het verzamelen van kabelgoten, dit dilatatie is waarschijnlijk secundair aan dilatatie in meer proximale segmenten. De aanwezigheid van de nieren cysten in Wnt9b
transgene dieren versterkt de conclusie dat verstoring van de Wnt-signalering systeem zorgt ervoor dat de ziekte cystic [7], [18], [19].

Hoewel de nieren cysten waren niet aanwezig is tot na de geboorte, opregulatie van Wnt-signalering bleek bij E12.5 wanneer Six2
-cre wordt in eerste instantie tot uitdrukking. Lef1 eiwitexpressie werd verhoogd pre-renale tubulaire aggregaten en vesicle structuren in een dubbele transgene en werd verder verhoogd in talrijke ectopische vesicles in gestabiliseerde β-catenine nieren (N = 3, fig. 5). De dosis-responsieve toename van Lef1 expressie ondersteunt gepubliceerde gegevens die Wnt9b handelt alsof de Wnt signaleringsroute in de ontwikkeling van de nieren [7]. Het gebrek aan ectopische vesicle structuren in de Wnt9b
transgene stelt de Wnt9b
allel een matig effect op β-catenine signalering vertoont in vergelijking met de gestabiliseerde β-catenine allel.

De tweede fenotype bijdragen tot een vermindering van het lichaamsgewicht in Six2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
dubbel heterozygoten was maagklachten. Gele vruchtwater werd waargenomen in de maag van dubbele transgenen en in losse transgene nestgenoten (n = 6, Fig. 6). Dit gaf aan dat duodenogastrische reflux voorkwam en mogelijk door abnormale vorming pylorus sfincter. De sluitspier tussen de maag en het duodenum werd verlengd en verbreed in de dubbele transgene (fig. 6, bijvoegsel). De TGFp antagonist Nephrocan dat gewoonlijk wordt uitgedrukt in een zeer beperkt patroon op E16.5, uitgebreid in dubbel transgene planten, wat suggereert dat de regio sluitspier niet juist is beperkt. Deze langwerpige morfologie werd ondersteund door immunohistochemische kleuring van de gladde spierlaag dat de dichte spierwand rond de pylorus (fig. 6 E, F) vormt. In single transgene controles, werd de dikste spieren gevonden, waar het weefsel vertoont de meest vernauwing bij de sluitspier (lijn). In de dubbele transgenen, werd dik gespierdheid waargenomen, maar dit gebied werd ten opzichte van het gebied dat het meest vernauwde.}

Mis-patroonvorming gebreken werden ook waargenomen door het analyseren van specifieke markers die onderscheid maken tussen de proximale (H ^{+ /K + ATPase) en distale (alcianblauw) gebied van de maag. Het proximale maag (corpus) bevat H + /K + ATPase expressie pariëtale cellen die zijn uitgesloten van de antrum-pylorus regio. Omgekeerd, het antrum-pylorus bevat mucosale cellen die kleuren met Alcian Blue die niet zijn gevonden in het proximale gebied [20]. De dubbele transgene vertoonden aanhoudende H + /K + ATPase vlekken en de afwezigheid van Alcian-blauw-positieve mucosa in het antrale maag-pylorus aangeeft dat het distale gebied is verkeerd gevormde proximale lot van Wnt9b
expressie. Alcianblauwkleuring van slijmbekercellen in de darm intact was in zowel enkele als dubbele transgenen omdat Six2
-cre komt niet tot uitdrukking in de twaalfvingerige darm. Deze verkeerde patroon suggereert dat, vergelijkbaar met het paradigma de nier canonieke β-catenine signalering geeft een lot, de voormaag regio en Six2 activiteitspatronen het distale identiteit. Dit wordt ondersteund door de expressie van deze genen domeinen aangezien een Wnt signaaltransductie reporter vertoont hoge activiteit uitsluitend in de voormaag en Six2
beperkt tot de distale maag en de pylorus [13], [14].}

Als Wnt-signalering is verantwoordelijk voor de gastroduodenale reflux in Six2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
dubbel transgene, dan is de misvormingen waargenomen moet worden herinnerd aan in een muismodel dat een gestabiliseerd β-catenine in hetzelfde domein uitdrukt ( Ctnnb1 ex3 /+
, [21]). Na cre activatie, dit allel voorkomt proteolytische afbraak van β-catenine en wordt verwacht dat Wnt signalering op een hoger niveau dan Wnt9b ligand alleen. Hele monteren in situ analyse van E12.5 magen onthulde drie genen, Grem1
, NKX 2.5
en GATA3
, die normaal worden uitgedrukt in een dunne band markeren van de regio die de sfincter zal worden (n = 8, fig. 7). Ectopische expressie van Wnt9b
onderdrukt het BMP antagonist Grem1
en de transcriptiefactor GATA3
in deze regio, en deze genen werden verder neerwaarts gereguleerd wanneer β-catenine signalering werd verhoogd. Een dosis-afhankelijke groei werd waargenomen voor de transcriptiefactor Nkx2.5
in beide mutanten. Genen die uitsluitend werden gelokaliseerd aan de darm ( villin
) of naar de voormaag ( Bmp4
) werden niet gewijzigd in beide mutant (gegevens niet getoond). Verhoogde Wnt-signalering in de antral maag en de pylorus werd bevestigd door het isoleren van deze regio en het uitvoeren van kwantitatieve PCR. De Wnt target genen die worden opgereguleerd in de gestabiliseerde β-catenine allel, Lef1 Kopen en Axin2
, werden ook toegenomen in de pyloric regio Six2
-cre TG /+, Wnt9b tg /+ dubbele transgenen [ Lef1
, 2,0 ± 0,25 en Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Samen, de dosis-responsieve genexpressie veranderingen waargenomen in de pylorus regio in de Wnt9b
transgene planten en de gestabiliseerde β-catenine embryo's laten zien dat de toename van Wnt-signalering verstoort distale maag en de pylorus sluitspier ontwikkeling.}

Discussie

Deze resultaten beschrijven de creatie van een nieuw muismodel dat voorwaardelijk Wnt-signalering activeert. De Wnt9b
transgeen geïnduceerd na blootstelling aan cre recombinase en spreekt GFP als een marker van inductie. Het behoudt ook een volledige biologische activiteit, omdat het kan redden Wnt9b ^{- /-
fenotypes in de nier. Deze muizen zijn gehandhaafd in onze kolonie meer dan een jaar en induceren Wnt9b
expressie na het fokken om meerdere verschillende cre stammen. We hebben deze nieuwe stam gebruikt om Wnt-signalering te activeren in Six2
-positieve cellen en vond schadelijke effecten op de nieren en de maag.}

In de nier, Wnt9b wordt uitgescheiden uit de ureterknop epitheel de aangrenzende kap mesenchym progenitorcellen induceren differentiatie initiëren. Ter ondersteuning van dit model, onze in vivo gain-of-functie studies tonen aan dat Wnt9b
upregulates vroege markers van renale blaasje differentiatie zoals Wnt4
, Fgf8 Kopen en PAX8 chromosomale
. Echter, hoewel de nieren blaasje genen worden geïnduceerd door de Wnt9b
transgene, we hebben geen morfologisch bewijs van de toegenomen of buitenbaarmoederlijke renale blaasjes vorming, zoals gerapporteerd voor acht Six2
mutanten [9]. Naast een Wnt inductieve signaal factoren houden de renale voorlopercellen pool (bijvoorbeeld Six2
) ook worden downgereguleerd volledig onthullen renale vesicles. Six2
expressie was niet veranderd bij onze Wnt9b
transgene en kunnen dus verklaren waarom de toename van Wnt9b resulteerde niet in een buitenbaarmoederlijke renale blaasjes. Ectopische inductie van nier- vesicle markers geïnduceerd door activatie van β-catenine in Six2
-positieve metanefrische mesenchym met de gestabiliseerde β-catenine allel [4] derhalve het verschil tussen deze twee gain-of-function experimenten kan betrekking hebben op de mate waarin zij activeren Wnt activiteit. Bovendien is het waarschijnlijk dat activatie van canonieke signalering door Wnt9b in metanefrische mesenchym remming induceert, zoals opgemerkt in andere Wnt reagerende weefsels, waardoor inductie van de differentiatie volledige programma [22] voorkomen. Recente gegevens ondersteunen het idee feedback inhibitie sinds Wnt9b /β-catenine signalering wordt niet alleen voor de differentiatie van metanefrische mesenchym, maar paradoxaal hetzelfde signaal is ook vereist voor onderhoud of uitbreiding van de renale voorlopercellen pool [7]. We speculeren dat de gestabiliseerde β-catenine, stroomafwaartse handelen in de weg, kunnen deze regulerende mechanismen te omzeilen. Deze mogelijkheden kunnen worden onderzocht in toekomstige studies dat vergelijken stroomafwaartse gen activatie in renale progenitorcellen met de Wnt9b
transgen en gestabiliseerd β-catenine gain-of-function muizen.

Storingen in de canonieke Wnt signaling pathway is aangetoond dat belangrijk is in de pathogenese van renale aandoening cystic worden (beoordeeld door Patel et al. [23]). Transgene expressie van een gestabiliseerde β-catenine of een tekort aan APC in renale tubulaire epitheel leidt tot renale cystische ziekte, de conclusie ondersteunt dat ectopische Wnt signalering volstaat cystogenesis [18], [19]. Nierfalen en cystic dilatatie in Six2
-cre ^{TG /+, Wnt9b tg /+ dubbel heterozygoten ondersteunt verder de hypothese dat opgereguleerd Wnt-signalering veroorzaakt cysten. Verstoring van Wnt-signalering (PCP) route is ook belangrijk renale cysten [24]. Aldus is het mogelijk dat cysten in ons model is niet alleen te wijten aan de activering van canonieke, maar is het gevolg van verstoring van de relatieve balans tussen canonieke en niet-canonieke. Ter ondersteuning van dit idee, de genen die gemuteerd in de erfelijke vormen van cystische ziekte ( PKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) te lokaliseren cilia en deze organellen zijn onlangs aangetoond in staat om het evenwicht tussen canonieke en Wnt signalering [25] reguleren [26].}

Er was een ernstige nier- fenotype hoewel Wnt9b
mRNA expressie wordt verhoogd ~ 2-voudig in onze transgene, wat aangeeft dat relatief laag niveau, aanhoudende activering van deze route leidt tot een verminderde nierfunctie. Dit niveau van opregulatie van Wnt9b in de ureterknop met Hoxb7
-cre niet cysten produceren, wat suggereert dat cystogenesis in het verzamelen van leidingen in de Six2
-cre ^{TG /+, Wnt9b tg /+ dubbele transgenen wordt waarschijnlijk een secundair effect van verwijde buisvormige segmenten (gegevens niet getoond). Ter ondersteuning van deze, in postnatale dag 7-10 dieren, cystic ziekte is duidelijk in slechts buisvormige segmenten proximale naar het verzamelen van kabelgoten. Net als bij polycysteuze nierziekte bij patiënten, de transgene muizen ontwikkelden ernstig nierfalen, hoewel de meeste nefronen niet cysten ontwikkelen. Dit roept de vraag op of niertubuli zonder duidelijke cysten zijn abnormaal en aanzienlijk bijdragen aan progressieve functiebeperking bij deze aandoeningen. Recente studies tonen aan dat volwassen niertubuli epitheel uiten Wnt9b, Frizzled receptoren en LRP5 /6 co-receptoren die in staat is te bemiddelen Wnt-signalering in respons op acute ischemische letsel [27] zijn. In deze instelling, Wnt-signalering bevordert buisje herstel en regeneratie. Echter Wnt signalerende activiteit ook betrokken bij het bevorderen nierfibrose na verwonding, zoals in de UUO model [28]. Over het algemeen zijn deze studies benadrukken het belang van het reguleren van Wnt-signalering in de volwassen nier gunstige reacties, zoals reparatie /regeneratie en onaangepaste reacties die leiden tot fibrose en chronisch orgaanfalen in evenwicht te brengen.}

De pyloric regio van de maag vertegenwoordigt een kritische grens die scheidt van maag darm. Sluitspier sluiting wanneer een voedsel bolus komt in de maag maakt een goede spijsvertering voor doorvoer naar de dunne darm. De moleculaire basis voor de vorming van deze discrete regio niet goed begrepen, maar enkele details ontstaan. Deze resultaten suggereren dat strakke controle van Wnt-signalering is essentieel voor de ontwikkeling van de pylorus. Wnt-activiteit wordt gedetecteerd in de fundus en het lichaam (corpus), maar niet in de distale maag en pylorus [13]. In Barx1
- /- muizen, de maag is klein, de antral-corpus grens is vaag en er is agenesie van de pyloric sluitspier. Elegant weefsel recombinatie studies suggereren dat deze fenotypes het gevolg zijn van het verlies van de expressie van de Wnt antagonisten sFRP1 en sFRP2. Aangezien Barx1
deficiëntie algemene effecten op voordarm ontwikkeling, was het niet duidelijk of neerwaartse regulatie van Wnt activiteit specifiek voor de vorming van de pylorus vereist. Onze studies directer deze mogelijkheid door zich te richten buitenbaarmoederlijke Wnt activiteit een beperkter gebied getest net anterieure de pylorus met Six2
-cre.

We hebben vastgesteld dat buitenbaarmoederlijke Wnt activiteit specifiek verstoort de vorming van de pyloric sphincter in afwezigheid van globale defecten in de maag ontwikkeling. Zo wordt down-regulatie van de Wnt activiteit die nodig is om het patroon pyloric regio die de maag scheidt van darm. Ectopische expressie van de Wnt9b ligand en gestabiliseerd β-catenine in transgene muizen de effecten van endogeen uitgescheiden Wnt antagonisten sFRP1 /2, passend binnen de door Kim et al [13] voorgesteld model kon overwinnen. Vergelijkbaar met onze resultaten, in de Six2
mutanten is er een gereduceerde expressie van Nkx2.5 Kopen en Gremlin
, genen die belangrijk zijn voor pyloric sluitspier ontwikkeling in kuiken [14] , [29]. Dit suggereert dat Six2 Kopen en Wnt
reguleren een gemeenschappelijke genetische cascade in de vermoedelijke pylorus sluitspier. Wij postuleren dat een belangrijke functie van Six2
kunnen Wnt signalen in verschillende ontwikkelingsstadia contexten interpreteren.

opgereguleerd Wnt signalering is ook aangetoond dat invloed milt en pancreas ontwikkeling [30]. Ter ondersteuning van deze, werd de milt en pancreas hypoplasie ook waargenomen in Six2
-cre, Wnt9b
bi-transgene muizen (gegevens niet getoond). Aangezien Six2
-cre niet die in deze weefsels, suggereert dit dat signalen van de maag achterste mesenchym de milt en pancreas tijdens de ontwikkeling kunnen beïnvloeden. Dit zou de hypothese dat de pylorus gebied kan fungeren als organisator voor vorming van deze accessoire organen ondersteunen. Tijdens de ontwikkeling milt precursor cellen transiënt associëren met de pyloric gebied vóór hun migratie naar links van de maag, waar ze condenseren [31]. Hoewel we niet op te sporen Six2
-cre expressie in de milt primordium of mesothelium, we kunnen niet uitsluiten dat tijdelijke expressie van de Six2
-cre in deze regio's is verantwoordelijk voor gebreken in de milt en pancreas . Toekomstige studies zijn nodig om deze mogelijkheden direct te testen.

Kortom, we hebben een nieuwe muis-model dat zorgt voor tijdelijke en ruimtelijke uitdrukking van Wnt9b ontwikkeld. In de ontwikkeling van de nieren, kunnen transgene Wnt9b
vroege induceren BMO genexpressie in Six2
-positieve nier voorouders, maar het is niet voldoende om de volledige differentiatie programma te activeren. Aanhoudende expressie van Wnt9b in Six2
-positieve cellen leidt tot nier cysten en ernstige orgaanfalen. In de maag, ectopische Wnt β-catenine-activiteit in de pylorus regio verandert vorming sluitspier en distale maag patroonvorming. Samen vormen deze bevindingen benadrukken het belang van een strikte controle van Wnt activiteit en suggereren dat Six2 en β-catenine zijn betrokken bij het orgel patronen in verschillende contexten.

Materialen en methoden

Ethics statement

de dierproeven werden goedgekeurd door de Animal care en gebruik commissie van Saint Louis University (protocol van 1460) en de St. Louis VA (protocol 0305). Alle procedures waarbij dieren in overeenstemming waren met de institutionele dierenwelzijn regelgeving, normen en het beleid.

Mice

Wnt9b
transgene muizen werden gekruist om elk van de drie verschillende cre lijnen [32 ]. 1) β-actin- cre werd gebruikt om uit te drukken Wnt9b alomtegenwoordig (figuur 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre:. EGFP werd gebruikt om Wnt9b overexpressie in zijn endogene locatie in de nier, de ureteric knop (figuur 2, [34].), en 3) de BAC Six2
-cre: EGFP transgen gebruikt om Wnt9b exogeen drukken in de maag en de nier (figuren 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• PLoS ONE: Insectenetende Bats Digest chitine in de maag met behulp van Zure Mammalian Chitinase
• PLoS ONE: Integratie maaginhoud en stabiele isotopen analyses om de Diëten van Pygoscelid Penguins kwantificeren