PLoS ONE: Uvjetno Izražavanje Wnt9b u Six2-pozitivnih stanica narušava želuca i bubrega Function

Sažetak pregled

Tijekom razvoja bubrega, kanonski Wnt signalni aktivira diferencijaciju, dok je transkripcijski faktor Six2 održava rodonačelnika bazen. Te suprotstavljene signale pomažu regulirati formiranje nefrona i osigurati se formiraju puni komplement nefrona. Od ta dva faktora kontrolirati različite sudbine u mezenhimu bubrega, pretpostavili smo da je izražajnost Wnt9b pregled u Six2
-eksprimirajući stanice će poremetiti formiranje bubrega i može mijenjati diferencijacije stanica odluke u drugim tkivima. Mi smo stvorili transgeničnog miša koji uvjetno izražava kanonski Wnt ligand u bubregu u razvoju, Wnt9b
. Transgena aktivira Cre rekombinaze i izražava GFP. Prvo smo testirali svoju biološku aktivnost pomoću Hoxb7-Cre
i utvrdili da transgena Wnt9b bio sposoban za izazivanje diferenciranja gene i spašavanja razvoj bubrega u Wnt9b ^{- /-
homozigota deficijentnih miševa. Nasuprot tome, izraz Wnt9b pregled u stanicama pomoću Six2-cre pregled uzrokovana gastrointestinalnim smetnjama i teškim zatajenjem bubrega u odraslih miševa. Genetski modifikovani bubrezi imao brojne cistične kanalića i povišene vrijednosti kreatinina (0,652 ± 0,044) u usporedbi s miševa divljeg tipa (0,119 ± 0,002). Ove životinje su također pokazale neispravno pilorusa sfinktera, duodenogastric refluks, i transformaciju distalnog želuca u proksimalnom sudbinu. Ekspresije gena promjene koje su uočene u Wnt9b: EGFP
transgena su u odnosu na ustaljenoj β-katenina alela kako bi se utvrdilo da Wnt9b aktivira kanonski Wnt put u analiziranim tkivima. Ovi rezultati pokazuju da je ekspresija Wnt9b pregled u Six2 pregled pozitivnih stanica narušava stanica sudbina odluke u bubrezima i probavnog trakta pregled}

Izvor:. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) Uvjetno Izražavanje Wnt9b u Six2 pregled pozitivnih stanica narušava želuca i bubrega funkciju. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10,1371 /journal.pone.0043098 pregled

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan pregled

Primljeno: 29. veljača 2012; Prihvaćeno: 17. srpnja 2012; Objavljeno: 17. kolovoz 2012 pregled

Ovo je otvorenog pristupa članak, slobodna od svih autorskih prava, a može slobodno reproducirati, distribuirati, prenositi, mijenjati, izgrađena na, ili na drugi način koristiti bilo tko za bilo koju zakonitu svrhu. Rad je dostupan pod licencijom Creative Commons CC0 javne domene predano pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane National Institutes of Health grant R01 DK067222 (http://nih.gov/) i American Heart Association Osnovan istražitelj 0840117N (http://www.heart.org) na MR. SK bio podržan od nagrada u Saint Louis University Predsjednički Research Fund (www.slu.edu). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

kanonski Wnt signalni put je ključni regulator staničnog sudbine, staničnom proliferacijom i prianjanje stanica tijekom razvoja i tijekom odrasle dobi. Brojni pozitivni i negativni posrednici su identificirani koje rade zajedno kako bi se postigla čvrstu regulaciju β-katenina signalizaciju. Središnji paradigma da citoplazmatski β-katenina je izdvojeno u uništenje kompleks, fosforiliran GSK3β i ciljaju ubikvitina uništavanja puta u odsustvu Wnt signala. Wnt obvezujuća inhibira fosforilaciju i uništavanje ß-katenina, omogućujući mu da pomjeriti za jezgre utjecati ciljati ekspresiju gena s TCF /LEF faktora (pregledao MacDonald et al. [1]). Brojni mišji modeli stvoreni su za proučavanje ovaj put uključujući oba dobitka i gubitka funkcije alela Wnts, Wnt receptora, beta-katenina, a TCF /LEF transkripcijski regulatori. Ovi modeli su otkrili bitne uloge za kanonske Wnt signaliziranja u kosti, kose, crijeva, krvi i raka [2]. U nastajanju teme iz ove studije je da su mnogi biološki procesi su izrazito osjetljivi na snazi ​​kanonskog Wnt signaliziranja. Pregled

Ova široka regulacija kanonske Wnt signaliziranja je bitno za razvoj bubrega. Tijekom početne faze formiranja bubrega, Wnt9b izlučuje iz ureteric pupoljka i signale nezrelih stanica u kapom mezenhimu da izazove nefrona diferencijaciju. Tretman s litij-kloridom ili aktivacijom P-katenina može inducirati nefrona diferencijacije u odsutnosti ureteric korijenu i Wnt9b, što ukazuje da je povećanje kanonske Wnt signaliziranja dovoljna za ovaj induktivni događaj [3], [4]. Neki kapa mezenhimu stanice rastu za održavanje ishodišne ​​stanice koje su potrebne za naknadne ponavljanja ovog procesa [5]. Ova ravnoteža između održavanja matične i indukciji diferencijacije je od najveće važnosti da se osigura da je bubreg formira puni komplement nefrona [5], [6], [7], [8], [9]. Pregled

Nekoliko faktora izraženi u kapica mezenhimu pokazalo se da antagoniziraju Wnt-stimulira diferencijaciju uključujući faktor transkripcije Six2
. Brisanje Six2 pregled rezultata u izvanmaternične diferencijacije, osiromašeni kapa mezenhimu predaka i bubrega agenezom [9]. Iako točan mehanizam još nije poznat, hipoteza je predloženo u kojem visoke razine kanonske Wnt signaliziranja voziti predanost diferencijacije, dok visoka Six2 aktivnost u istim stanicama održava rodonačelnika sudbinu [7]. Mi smo stvorili novi model miša za uvjetno ekspresiju Wnt9b aktivirati kanonski Wnt signalni put. Mi smo koristili ovaj model za testiranje da li povećana aktivnost Wnt9b je dovoljna da uznemiri ravnotežu između predaka i diferencijacije u kapu mezenhimu. Pregled

Drugo mjesto gdje oba Six2 aktivnost i Wnt signaliziranja igraju važnu ulogu je pilorisa sfinkter , Pilorisa sfinkter formira na distalnom kraju želuca i djeluje kao ventil za omogućavanje pravilnu probavu hrane prije ulaska u duodenum. Disfunkcije sfinktera može dovesti do refluksa dvanaesnika sadržaj u želucu koja predstavljaju povećani rizik od želučanog metaplazije i raka [10], [11]. Ovo područje je također i mjesto prirođenih anomalija, uključujući rijetkog poremećaja primarne duodenogastric refluks i češći rođenje defekt stenozu pilorusa [12]. Six2 pregled nedostatak dovodi do agenezom od pyloric sfinktera i antagonistički Wnt aktivnost s Sfrp1 i Sfrp2 potrebno je uzorak želuca [13], [14]. To nas je dovelo do pretpostavljaju da kanonski Wnt aktivnost mora biti čvrsto regulirana piloms slično onome što je predloženo u bubregu. Da biste to provjerili smo koristili Six2 pregled -cre za aktiviranje Wnt9b pregled transgena u Six2
izražavanja domene u bubrezima i želucu. Pregled

Uvjetni Wnt9b pregled transgena alel izvijestili ovdje izražava Wnt9b pregled i GFP kada se aktivira CRE rekombinaze. To je biološki aktivan i sposoban za spašavanje formiranje bubreg u Wnt9b ^{- /-
embrija. Prekomjerna ekspresija Wnt9b Netlogu u bubregu ureteric pupoljak može izazvati gene povezane s diferencijacijom cap mezenhimu, ali ne prolaze mczcnhimnog-to-epitelni tranzicije (MET), čime se morfološki različite kesice strukture. Wnt9b pregled aktivacija transgena u Six2 pregled pozitivnih stanica uzrokuje bubrežne ciste i transformacija distalnim dijelovima želuca u proksimalnim sudbine želuca. Usporedba Wnt9b pregled transgenics do alela koja proizvodi postojane β-katenina protein pokazuje dozi brza promjena gena te predlaže da se ovi sojevi predstavljaju alela serije koji bi trebao biti vrijedan za moduliranje kanonsku Wnt signalnog puta u drugim tkivima.}

Rezultati

Transgenični miševi izraziti Wnt9b kada se aktivira Cre rekombinaze pregled

Wnt9b transgena je nastao s dimljeni losos-STOP kazete [15] stvoriti uvjetno aktivan Wnt9b koja ovisi o kreiranju rekombinaze za izraz (Sl. 1). Jednom aktiviran, transgen ekspresiran Wnt9b se razlikuje od endogenog Wnt9b jer sadrži C-terminalni influence hemaglutinin epitopa i transgenične stanice će pokazivati ​​GFP fluorescencije zbog IRES-EGFP kasete. Testirati vjernost transgena ispitali smo cre-ovisne ekspresije u kulturi stanica i in vivo u embrija (Sl. 1B). Epitop označeni Wnt9b otkriven u lizata stanice ko-transfektirane s transgena i CRE plazmid, a ne u transfekcija samo transgena. Isto tako, lizat iz embrija koji su bili pozitivni na oba Wnt9b i ß-aktin-CRE transgena sadržane Wnt9b gripe, dok pojedinačni Wnt9b transgenics nije. GFP fluorescencija je zabilježena u Wnt9b /β-aktina-ostva dvostrukim pozitivnim zametaka, a ne u Wnt9b iz istog legla (sl. 1 C-F). Razina ekspresije transgenih Wnt9b korelaciji s intenzitetom GFP fluorescencije za svaki osnivač liniji. (Sl. 1D). Četiri nezavisni utemeljitelj linije bile su u stanju proizvesti uživo β-aktin-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ dvostruki heterozigotni štenci, pokazujući da sveprisutni povišena Wnt9b izraz embrionalna smrtonosan. Analiza embrionalne faze otkrila da β-aktin-cre tg /+, Wnt9b TG /+ dvostruki heterozigotni embriji koji su dokazani u manje od očekivanog mendelovski frekvencija na E11-E12. Jedan bračni heterozigotni embrij je promatrana od osnivača s vrlo visokim ekspresije (sl. 1, n = 23, očekuje se frekvencija 25%) i 16% zabilježene su iz drugog osnivača (n = 25). Wnt9b /ß-aktin-Cre dvostruko genetski promijenjene embriji imali manji srca udruživanja krvi, što ukazuje na srčane insuficijencije kao uzrok smrti. Pregled}

Transgenični Wnt9b je biološki aktivan pregled

Kako bi se utvrdilo da li transgena Wnt9b je biološki aktivni, testirali smo i ako je sposoban za zamjenu divlji tip Wnt9b pregled tijekom razvoja bubrega. Wnt9b ^{- /-
embriji pokazuju visoke pojavnosti rascjep nepca i renalnom agenezom fenotipova (Sl. 2). Aktivacija transgeničnog Wnt9b u ureteric korijenu s Hoxb7 pregled -cre spasio formiranje bubrega, ali ne priuštiti zatvaranje na E14.5 u svim Hoxb7 pregled -cre tg /+, Wnt9b pregled - /-, Wnt pregled 9b tg /+ zameci (n = 7). Ovaj bubrega specifične spašavanja potvrđuje da transgena Wnt9b izraz ovisi o aktivaciji CRE, jer nepce ne izražavaju Hoxb7 pregled -cre. Kvantitativna PCR divljeg tipa, Wnt9b - /- pregled i Wnt9b - /- pregled, Wnt9b tg /+ genetski promijenjene bubrega pokazala je da transgena Wnt9b pregled je izražena na 2,3 puta višim razinama nego gena divljeg tipa, dok se izraz ret Netlogu ostala je nepromijenjena (sl. 2 G-ja). Sposobnost transgenične Wnt9b signalizirajući mezenhimu zamijeniti divlji tip Wnt9b pregled aktivnosti potvrđuje da je on biološki aktivni in vivo. Pregled}

mnoštvo podataka pokazala je da Wnt9b i β-katenina signalizacija su kritične induktivni signale koji potiču diferencijaciju cap mezenhimu u epithelialized bubrežnih vezikule [4], [8], [16]. Wnt9b proizveden u ureteric korijenu aktivira kanonski Wnt signalni put u susjednoj mezenhimu i rezultate u ekspresiji gena koji reguliraju mczcnhimnog na epitelnim prijelaz (met). Dakle, mi smo testirali je li pretjerano izlučivanje Wnt9b Netlogu u ureteric pupoljka će signalizirati mezenhimu aktivirati ekspresiju MET gena i promicati veću indukciju nefrona. Wnt9b pregled je pojačana ekspresija u ureteric korijenu pomoću Hoxb7
-cre: EGFP. E12.5 embriji genotipizirane kvantitativnom PCR analize kako bi se utvrdilo jesu li hemizigotni ili homozigota za Wnt9b pregled transgena i bubrezi su prikupljeni za ekspresiju gena analizu. Otkrili smo povećanje ovisno o dozi Wnt9b pregled koji je bio u pratnji proporcionalnom aktivacije ekspresije ciljnih gena Wnt9b, Wnt4 pregled, Pax8 pregled i FGF8 pregled u tri nezavisna bazenima genetski promijenjenim bubrega (Sl. 2j). Six2 pregled je izražena u nediferencirane (CAP) mezenhimu i regulirani kao diferencijacija kesicu slijedi [17]. Six2 pregled mRNA je nepromijenjen u Hoxb7 pregled -cre, Wnt9b pregled dvostruko transgenics. Slično tome, ureteric bud geni, Ret pregled i Wnt11 pregled, nisu bitno promijenjeni prekomjernom ekspresijom Wnt9b pregled. Specifična regulaciju gena u mezenhimu potvrđuje da transgena Wnt9b je sposoban za signalizaciju iz ureteric pupoljka da izazove gene važne za MET, međutim, nema histološki dokaz ektopične epithelialized bubrežnih vezikula je očigledno (podaci nisu prikazani). To upućuje na zaključak da je uzlazni Wnt9b pregled u ureteric korijenu je dovoljan za aktivaciju gena u mezenhimu, ali ne i za morfološke diferencijacije bubrežnih mjehurići. Pregled

Misexpression od Wnt9b remeti funkciju bubrega i pilorusa formiranje sfinktera aktiviranjem kanonski p-katenina signaliziranja pregled

paradigma u nastajanju u bubregu je da postoji delikatna ravnoteža između praotac samo obnove i aktiviranja diferencijacije [6], [7], [9]. Wnt9b /β-katenina put je potreban za razlikovanje i Six2 potiskuje diferencijaciju u početnoj fazi predanosti. Stoga, pretpostavili smo da sposobnost Six2 promovirati sudbine odluka nasuprot onih aktivirana visokim β-katenina aktivnosti može biti uobičajena tema u razvoju. Testirali smo tu mogućnost aktivacijom transgenski Wnt9b pregled s Six2 pregled -cre. Dvostruke transgenics izraze Wnt9b pregled u istim stanicama koje izražavaju Six2 pregled i može poremetiti procese koji su koordinirano regulirani u bubrezima i drugim tkivima. Six2-cre ^{tg /+ pregled, Wnt9b tg /+ pregled, miševi izloženi nevolja na odvikavanje i mjerenje tjelesne težine smanjene su za 39% u četiri tjedna (14.5 ± 3.4 grama, p < 0,001) u usporedbi s Cre-negativne Wnt9b tg /+
okota (23,6 ± 0,7 grama). Fenotipske analize su pokazale da to smanjenje tjelesne težine je zbog malformacija u probavnom sustavu i bubrezima, dva nalazišta Six2 pregled -cre izraz (Sl. 3). Pregled}

Brojne ciste različitog veličine su bili vidljivi u korteksu i medulla dvostrukih heterozigotnih bubrega (sl. 4, n = 11/11). Ciste se pretežno nalazi u korteksu i vanjskog srži i bile proksimalnih tubula porijekla kao što je pokazano LTL-bojanja. Cistične bolesti bio je prvi očito ubrzo nakon rođenja (P7-10) u proksimalnim dijelovima nefrona (podaci nisu prikazani). Ove dvokrevetne heterozigotnih životinje imaju povišene razine kreatinina u serumu u (0,652 ± 0,044, p < 0,005) u odnosu na kontrolu mladunaca u jednom leglu (0,119 ± 0,002) već su ~3 tjedana starosti, što ukazuje na ozbiljne zatajenja bubrega. Starije životinje s uznapredovalom bolešću također sadrži ciste dobivene iz više distalnih segmenata, uključujući petlju Henle (Tamm-Horsfall-pozitivan). U svih životinja sa zatajenjem bubrega napredna ispitanih, gledali smo mnoge prikupljanje kanalnu izvedeni ciste koje bi izražavale Aquaporin 2 ili vezane D. Biflorus pregled -lectin. Budući da Six2 pregled -cre nije izražen u sabirne cijevi, to dilatacija je vjerojatno sekundarna dilatacije u više proksimalnim segmentima. Prisutnost bubrežnih cista Wnt9b pregled transgenih životinja jača zaključak da Poremećaj Wnt signalnom sustavu uzrokuje cističnu bolest [7], [18], [19]. Pregled

Iako bubrega ciste bile nije prisutan tek nakon rođenja, uzlazni kanonske Wnt signaliziranja je očito na E12.5 kada je Six2 pregled -cre se najprije izrazio. Lef1 ekspresija proteina je povećana u prethodno cjevaste agregata i bubrežne vezikula struktura dvostruke transgenics i dalje povećana u brojnim ektopičnih formiranih vezikula u stabiliziranim beta-katenina bubrega (N = 3, Sl. 5.). Povećanje doze koje reagiraju na Lef1 izražavanja podržava objavio podatke koji Wnt9b djeluje iako kanonski Wnt signalni put u bubregu u razvoju [7]. Nedostatak ektopičnih vezikula struktura u Wnt9b
transgenics sugerira da je Wnt9b pregled alel pokazuje umjereno djelovanje na β-katenina signalizaciju u odnosu na stabilizirane β-katenina alel. Pregled

Drugi fenotip doprinose smanjene tjelesne težine u Six2-Cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+ pregled dvostruko heterozigoti bio želučane nevolji. Žuta amnionska tekućina opažena u želucu dvostrukih transgenics a ne u jednoj transgene iz istog legla (n = 6, sl. 6). To pokazuje da duodenogastric refluks se događa i može biti zbog nenormalnog pyloric formiranja sfinktera. Sfinkter između želuca i duodenumu je izdužen i proširene u dvostruko transgeničnog (Sl. 6, umetak). TGF-beta antagonista, Nephrocan, koji obično se izražava u vrlo ograničenom uzorku kod E16.5, proširena je u dvokrevetnim transgenics, sugerirajući da je sfinkter regija nije ispravno ograničen. Izduljenom morfologija podržan imunohistokemijskom bojanju glatkog mišićnog sloja koji čini gustu mišićni zid koji okružuje pylorus (Sl. 6 E, F). U pojedinim genetski promijenjenim kontrole, najdeblji muskulatura je našao gdje je tkivo pokazuje najviše suženje na sfinktera (linija). U dvokrevetnim transgenics, debeli muskularnost uočeno je, ali ovo područje je odmaknut od područja koje je najviše tijesan. Pregled}

Netočno obrazaca defekti također su promatrane kroz analizu specifične markere koje razlikuju između proksimalnog (H ^{+ /K + ATPaze) i distalni (Alcian blue) područje trbuha. Bliži želuca (corpus) sadrži H + /K + ATPaze-izražavanje parijetalni stanice koje su isključene iz antralnom-pilorus regiji. S druge strane, antruma-pilorus sadrži stanica sluznice koja mrlja s Alcian blue koji se ne nalaze u proksimalnom području [20]. Dvostruke transgenics izlagao uporni H + /K + ATPaze bojenje i izostanak Alcian blue-pozitivne sluznice u antralnog želuca-piloms pokazuje da je distalni regija mis uzorkom na proksimalnom sudbinu u Wnt9b
izraz. Alcian blue bojenje vrčastih stanica u crijevu bio netaknut u jednokrevetnim i dvokrevetnim transgenics jer Six2 pregled -cre nije izražena u dvanaesniku. Ovo pogrešno strukturiranja sugerira da, slično paradigmi u bubregu, kanonski β-katenina signalizacija navodi jedan sudbine, forestomach regiju, a obrasci aktivnosti Six2 distalni identiteta. To je podržan od strane izraz domena tih gena jer kanonski Wnt signalni reporter pokazuje visoku aktivnost samo u forestomach i Six2 pregled ograničena na distalnom želuca i piloms [13], [14].}

Ako kanonski Wnt signalizacija je odgovoran za gastroduodenalnog refluks u Six2 CRE ^{TG /+
, Wnt9b TG /+
dvostruko transgenics, potom se malformacije primijetio bi trebao biti uglavljeno u mišjem modelu koji izražava stabiliziranog P-katenina u istoj domeni ( Ctnnb1 EX3 /+ pregled, [21]). Nakon aktivacije CRE, taj alel sprečava proteolitičke razgradnje beta-katenina a očekuje se da podignu kanonski Wnt signalnog puta u većoj mjeri nego samo Wnt9b liganda. Cijela montirati in situ analize E12.5 želucima otkrila tri gena, Grem1 pregled, Nkx 2,5
i Gata3 pregled, koji se obično izražava u tankom pojasu markiranja regija koja će postati sfinkter (n = 8, sl. 7). Ektopično izraz Wnt9b pregled potisnut BMP antagonist Grem1 pregled i transkripcijski faktor Gata3 pregled u ovoj regiji, a ti geni su dodatno regulirani kada je povećana β-katenina signalizacije. Ekspanzijom ovisi o dozi uočeno je za transkripcijski faktor Nkx2.5
u oba mutantima. Geni koji su lokalizirani isključivo crijeva ( villin pregled) ili na forestomach ( BMP4 pregled) nisu bili promijenjeni bilo mutanta (podaci nisu prikazani). Povećana kanonski Wnt signalizacija u antralnog želucu i piloms potvrđena izolacijom ovu regiju i provedbom kvantitativnog PCR. Kanonska Wnt ciljanih gena koji su reguliran u stabiliziranom β-katenina alela, Lef1 pregled i Axin2 pregled, također su povećani u pyloric regiji Six2 pregled -cre tg /+, Wnt9b TG /+ dvostruki transgenics [ Lef1 pregled, 2.0 ± 0,25 i Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Zajedno, doza reagiraju Gene Expression promjene koje su uočene u pyloric regiji u Wnt9b pregled transgenics i stabiliziranih β-katenina embrija pokazuju da povećana kanonski Wnt signalni narušava distalni želuca i pilorusa razvoj sfinktera. Pregled}

Rasprava pregled

Ovi rezultati opisuju stvaranje novog mišjem modelu koji uvjetno aktivira kanonski Wnt signalnog puta. Wnt9b pregled transgen se može inducirati nakon izlaganja Cre rekombinaze i izražava GFP kao pokazatelj indukcije. Ona također zadržava punu biološku aktivnost, jer ona može spasiti Wnt9b ^{- /-
fenotipova u bubregu. Ti miševi su održavani u našoj koloniji više od godinu dana i izazivaju Wnt9b pregled izraz na uzgoj na više različitih sojeva CRE. Koristili smo ovaj novi soj aktivirati Wnt signalnog puta u Six2 pregled pozitivnih stanica i pronašao štetne učinke u bubrezima i želucu. Pregled}

U bubregu, Wnt9b izlučuje iz ureteric pupova epitela da potiču susjedne kapa mezenhimu ishodišne ​​stanice za pokretanje diferencijaciju. U prilog ovom modelu, naša in vivo dobitak-of-funkcije studije pokazuju da je Wnt9b pregled regulira povišenje rane markere bubrežne diferencijacije mjehurića kao što su Wnt4 pregled, FGF8 pregled i Pax8 pregled. Međutim, iako su bubrežne kesice geni izazvana Wnt9b pregled transgena, nismo promatrati morfološki dokaz povećanog ili izvanmaternične formiranju bubrežnih vezikule, kako je izvijestio Six2 pregled mutanata [9]. Uz Wnt induktivno signala, čimbenici koji održavaju bubrežne progenitor bazen (npr Six2 pregled) mora biti regulirani u potpunosti se potakne stvaranje bubrežnog vezikula. Six2 pregled izraz nije promijenio u našem Wnt9b pregled transgenski, pa tako mogu objasniti zašto je povećanje Wnt9b nije rezultiralo ektopične bubrežnih mjehurići. Ektopično indukcija bubrežnih kesice markera je izazvana aktivacijom beta-katenina u Six2 pregled pozitivnih metanephric mezenhimu pomoću stabilizirane β-katenina alel [4], dakle, razlika između ova dva dobitak-of-funkcije pokusa može se odnositi na stupanj u kojem su aktivirali kanonski Wnt aktivnost. Osim toga, vrlo je vjerojatno da aktivacija kanonske signaliziranje Wnt9b u metanephric mezenhimu inducira inhibiciju povratne informacije, kao što je navedeno u drugim Wnt reaktivnih tkiva, čime se sprječava indukciju punog programa diferencijacije [22]. Nedavni podaci podržavaju ovu ideju inhibicije feedback jer je potrebno Wnt9b /β-katenina signalizaciju, ne samo za diferencijaciju metanephric mezenhimu, ali paradoksalno je također potreban isti signal za održavanje ili proširenje bubrežne matične bazen [7]. Mi nagađaju da stabilizira β-katenina, djelujući nizvodno na putu, može zaobići ove regulatorne mehanizme. Te mogućnosti mogu se ispitati u budućim studijama u kojima se uspoređuje nizvodno aktivaciju gena u bubrežnim nezrelih stanica pomoću Wnt9b pregled transgena i stabilizira β-katenina dobitak-of-funkcije miševa. Pregled

perturbacije u kanonski Wnt signalni put je dokazano da su važni u patogenezi bubrega cistične bolesti (komentiran Patel et al. [23]). Transgenični izraz ustaljenoj P-katenina ili nedostatka APC u bubrežnih tubula epitela dovodi do bubrežnih cističnom bolesti, podržava zaključak da izvanmaternične kanonski Wnt signalni dovoljna za cystogenesis [18], [19]. Zatajenja bubrega i cistične dilatacija u Six2 pregled -cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ dvostruki heterozigoti dodatno podupire hipotezu da regulira prema gore kanonski Wnt signalni uzrokuje ciste. Poremećaj nekanonskoj Wnt signaliziranja (PCP) put je također važna u formiranju bubrežnih cista [24]. Prema tome, moguće je da formacije cisti u našem modelu nije jednostavno zbog aktiviranja kanonskog signalizacije, ali je rezultat poremećaja relativne kanonskom ravnoteže i nekanonske signalizaciju. U prilog toj ideji, geni koji su mutirali u naslijeđenih oblika cistične bolesti ( PKD1 pregled, PKD2 pregled, PKHD1 pregled, Inversin pregled ) lokalizirati na cilija i ove organele su nedavno pokazala da se može regulirati ravnotežu između kanonskog i ne-kanonske Wnt signaliziranja [25], [26]. pregled}

bilo je žestoko bubrega fenotip, iako Wnt9b pregled mRNA je povećana ~2 puta u našoj transgena, što pokazuje da relativno niska razina, uporni aktivacija ove staze dovodi do disfunkcije bubrega. Ova razina ranijim koracima Wnt9b u ureteric korijenu pomoću Hoxb7 pregled -cre nije dala ciste, sugerirajući da cystogenesis u prikupljanje kanalizacije u Six2 pregled -cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dvostruki transgenics je vjerojatno sekundarni učinak proširene cijevnih segmenata (podaci nisu prikazani). U prilog tome, u post-natalne dan 7-10 životinja, cistična bolest se očituje u samo cijevnih segmenata proksimalnih sa sabirnom kanalu. Slično policistične bolesti bubrega u bolesnika s genetski promijenjenih miševa razvio ozbiljnu zatajenje bubrega, iako je većina nephrons ne razvijaju ciste. Postavlja se pitanje da li bubrežnih tubula bez vidljive ciste su abnormalne i značajno doprinijeti progresivnom funkcijski poremećaj u ovih poremećaja. Nedavna istraživanja pokazuju da su odrasli bubrežne tubule sluznica izraziti Wnt9b, frizzled receptore i LRP5 /6 ko-receptora koji mogu posredovati kanonski Wnt signaliziranja u odgovoru akutne ishemijske ozljede [27]. U tom okruženju, Wnt signalni promiče tubula popravak i obnavljanje. Međutim, Wnt signaliziranje aktivnosti također je uključen u promoviranje fibroze bubrega nakon ozljede, kao što su na modelu UUO [28]. Sve u svemu, ove studije naglašavaju važnost reguliranja Wnt signalnog puta u odrasloj bubrega uravnotežiti pozitivne reakcije, kao što je popravak /regeneraciju i neprikladna reakcija dovodi do fibroze i kronične organa disfunkcije. Pregled}

pilorisa područje trbuha predstavlja kritična granica koja razdvaja želudac od crijeva. Sfinkter zatvaranje kada je hrana bolus ulazi u želudac omogućuje pravilnu probavu prije prijenosa u tankom crijevu. Molekularna osnova za formiranje ove diskretne regiji nije dobro razumio, iako su neki detalji u nastajanju. Ovi rezultati ukazuju na to da čvrsto kontrola Wnt signaliziranja je bitno za razvoj piloms. Canonical Wnt aktivnost je otkrivena u fundus i tijela (corpus), ali isključuju iz vanjskog želuca i piloms [13]. U Barx1
- /- miševa, želudac je malen, sekundarnom-corpus granica je nejasna, a tu je agenezom od pyloric sfinktera. Elegantne rekombinacije tkiva studije ukazuju na to da su ti fenotipova proizlaze iz gubitka izraz Wnt antagonista Sfrp1 i Sfrp2. Međutim, budući da Barx1 pregled, nedostatak ima globalne posljedice na razvoj prednjem crijevu, nije bilo jasno da li down-regulacije kanonskog Wnt aktivnosti posebno je potrebno za formiranje piloms. Naša istraživanja više izravno testira tu mogućnost ciljanja izvanmaterničnu Wnt aktivnost u ograničenom području samo prednjom da piloms s Six2 pregled -cre. Pregled

Otkrili smo da izvanmaternične Wnt aktivnost posebno ometa formiranje pilorusa sfinkter u nedostatku globalnih nedostataka u razvoju želuca. Dakle, down-regulacije kanonske Wnt aktivnosti potrebno je uzorak na pilorusa regiju koja razdvaja želudac od crijeva. Ektopično izraz Wnt9b liganda i stabilizirati beta-katenina kod miševa transgenih mogao prevladati učinke izlučenih endogenih Wnt antagonista Sfrp1 /2, u skladu s modelom predložio Kim et al [13]. Slično rezultatima, u Six2 pregled mutanti je smanjena ekspresija Nkx2.5 Netlogu i Gremlin pregled, geni koji su važni za pyloric razvoj sfinktera u piletu [14] [29]. To upućuje na zaključak da je Six2 pregled i Wnt pregled uređuju zajedničku genetsku kaskadu u vjerojatnih pyloric sfinktera. Mi pretpostaviti da je važna funkcija Six2 pregled može protumačiti kanonske WNT signale u različitim razvojnim kontekstima. Pregled

regulira prema gore kanonski Wnt signalni također su pokazali da djeluju slezene i razvoj gušterače [30]. U prilog tome, slezena i gušterača hipoplazija je također zabilježen u Six2 pregled -cre, Wnt9b pregled, bi-transgenski miševi (podaci nisu prikazani). Budući da Six2 pregled -cre nije izražen u ovim tkivima, to sugerira da signali iz stražnji želuca mezenhimu može utjecati na slezenu i gušteraču tijekom razvoja. To bi podupiru hipotezu da pilorisa regija može djelovati kao organizator za formiranje tih pomoćnih organa. Tijekom razvoja, slezene prekursorske stanice prolazno povezati s piloričkog regije, prije njihova migracija na lijevo od želuca gdje kondenziraju [31]. Iako nismo otkrili Six2 pregled -cre izraz u slezeni pravijeku ili mesothelium, ne možemo isključiti da je prolazno izražavanje Six2 pregled -cre na ovim prostorima je odgovoran za nedostatke u slezeni i gušterače , Buduće studije su potrebne kako bi se izravno testirati ove mogućnosti. Pregled

Ukratko, razvili smo novi model miša koji omogućuje vremenskom i prostornom izrazu Wnt9b. U bubrega u razvoju, transgena Wnt9b pregled može izazvati rani MET ekspresije gena u Six2 pregled pozitivnih bubrežnih stanica, ali to nije dovoljno za aktiviranje punu diferencijacije programa. Uporna izraz Wnt9b u Six2 pregled pozitivnih stanica dovodi do bubrežnih cista i teškog zatajenja organa. U želucu, ektopična Wnt β-katenina aktivnost u piloričkog regiji mijenja formaciju sfinktera i udaljeni želuca patterning. Zajedno, ovi rezultati ukazuju na važnost čvrstu kontrolu Wnt djelovanja i sugeriraju da Six2 i β-katenina su uključeni u stvaranje uzoraka organa u različitim kontekstima. Pregled

materijali i postupci

Etika izjava pregled

studije na životinjama su odobreni od strane životinja njega i uporaba odbora Saint Louis University (protokol 1460) i St. Louis VA (protokol 0305). Svi postupci koji uključuju životinje su bile u skladu s institucionalnim dobrobiti životinja propisima, standardima i pravilima. Pregled

Miševi

Wnt9b pregled genetski promijenjene miševi su prešli na svaki od tri različita CRE linije [32 ]. 1) β-actin- cre se koristi za izražavanje Wnt9b prisutno (Slika 1, [33]) 2) Hoxb7 pregled -cre. EGFP je korištena u svrhu ekspresije Wnt9b u endogenim položaju u bubrezima je ureteric bud (Slika 2, [34].) i 3) BAC Six2 pregled -cre: EGFP transgen se koristi za izražavanje Wnt9b egzogeno u želucu i bubregu (slike 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).