Plos ONE: Pogojno Izražanje Wnt9b v Six2-pozitivnih celic moti Želodec in ledvic Funkcija

Povzetek

Med razvojem ledvic, kanonično NT signalizacijo aktivira diferenciacijo, medtem ko je transkripcijski faktor Six2 ohranja bazen matičnih celic. Ti nasprotujoči si signali pomagajo urediti nastanek nefron in zagotovijo, da se oblikujejo popolno dopolnilo nephrons. Ker ta dva dejavnika nadzorujejo različne usode v ledvicah mesenchyme, smo predpostavili, da je čezmerno Wnt9b
in Six2
-izražanje celice bi motili oblikovanje ledvic in se lahko spremeni odločitev diferenciacije celic v drugih tkivih. Ustvarili smo transgenske miši, ki pogojno izražena kanonično NT ligand v ledvicah v razvoju, Wnt9b
. Transgen se aktivira s CRE rekombinaze in izraža dobre kmetijske prakse. Najprej smo testirali njegovo biološko aktivnost z Hoxb7-Cre
in ugotovila, da je transgena Wnt9b sposoben indukcijo diferenciacije gene in reševanje razvoj ledvic v Wnt9b ^{- /-
miši homozigotno pomanjkljivo. V nasprotju s tem, izraz Wnt9b
v celicah z uporabo Six2-cre
povzroča gastrointestinalne stiske in hudo ledvično odpovedjo pri odraslih miših. Transgene ledvice imela številne cistično cevke in povišane vrednosti kreatinina (0,652 ± 0,044) v primerjavi z miših divjega tipa (0,119 ± 0,002). Te živali razstavljena tudi nepravilno pilorično mišice zapiralke, duodenogastric refluks in preoblikovanje distalnega želodca v proksimalnem usodo. opaženimi Wnt9b genski izraz spremeni: EGFP
transgenov so bile v primerjavi s stabilizirano alel β-catenin da ugotovi, da je Wnt9b aktiviranje kanonično NT pot v tkivih analiziranih. Ti rezultati kažejo, da je izraz Wnt9b
in Six2
-positive celic moti mobilni usodo odločitve v ledvicah in prebavnem traktu}

Navedba. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) Pogojno Izražanje Wnt9b v Six2
-Positive celice moti Želodec in ledvic funkcijo. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10,1371 /journal.pone.0043098

Urednik: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonska

Prejeto: 29. februar 2012; Sprejeto: 17. julij 2012; Objavljeno: 17. avgust 2012

To je odprtega dostopa člena se brez vseh avtorskih pravic, in se lahko prosto reproducirati, distribuirati, prenašati, spreminjati, nadgrajevati, ali kako drugače uporablja vsakdo za vse zakonite namene. Delo je na voljo pod Creative Commons CC0 javni domeni predanost

Financiranje:. To delo je podprl National Institutes of Health nepovratna R01 DK067222 (http://nih.gov/) in American Heart Association Ustanovljen preiskovalec 0840117N (http://www.heart.org) za MR. SK je bila podprta z nagrado Saint Louis University Predsedniški Raziskovalni sklad (www.slu.edu). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

cerkvenih NT signalizacijo pot je ključni regulator celic usode, celično proliferacijo in celično adhezijo med razvojem in v celotni odrasli dobi. Številne pozitivne in negativne mediatorji niso ugotovili, da dela skupaj, da bi dosegli tesno ureditev β-catenin signalizacijo. Osrednja paradigma je, da je citoplazme β-catenin vežejo na kompleks uničevanje, ki jo je GSK3P fosforilirata, in usmeriti v ubikvitina poti uničenje v odsotnosti NT signala. NT zavezujoča inhibira fosforilacijo in uničenje beta catenin, ki ji omogoča, da translocira v jedro vpliva na ciljno gensko ekspresijo TCF /LEF dejavnikih (ki jih MacDonald et al pregleda. [1]). Številni modeli miške so bile ustvarjene za študij te poti, vključno s tako dobiček in izgubo funkcionalnih alelov Wnts, NT receptorjev, beta-catenin, in TCF /LEF transkripcijske regulatorji. Ti modeli so odkrili bistvene vloge za kanonični NT signalizacijo v kosti, las, črevesja, krvi in ​​raka [2]. Nastajajoče tema iz teh študij je, da so številni biološki procesi akutno občutljivi na trdnost kanonične NT signalizacijo.

To tesen ureditev kanonične NT signalizacijo je bistvenega pomena za razvoj ledvic. V začetnih fazah nastajanja ledvic, je Wnt9b izloča iz ureteric kali in signalov matičnih celic v mesenchyme pokrovček za indukcijo diferenciacije nefron. Zdravljenje z litijev klorid ali aktivacije beta catenin lahko povzroči diferenciacijo nefron v odsotnosti ureteric kali in Wnt9b, kar kaže, da je povečanje kanonični NT signalizacijo zadostuje za to induktivno dogodka [3], [4]. Nekateri cap mesenchyme celice razmnožujejo za vzdrževanje matičnih celic, ki so potrebne za kasnejše ponovitve tega procesa [5]. To ravnotežje med vzdrževanjem matičnih in indukcijo diferenciacije je izrednega pomena, da se zagotovi, da se ledvice predstavlja popolnega dopolnila nephrons [5] [6] [7] [8] [9].

več dejavnikov, izražene v mesenchyme pokrovček se je izkazalo, da nevtralizira NT-stimuliran razlikovanja, vključno z transkripcijski faktor Six2
. Izbris Six2
Rezultati v zunajmaternične diferenciacija, izčrpavanje cap mesenchyme prednikov in ledvic agenesis [9]. Čeprav je natančen mehanizem še ni znan, je hipoteza predlagana katerim visoke vrednosti kanonične NT signalizacijo voziti zavezanost diferenciacije ker visoko aktivnost Six2 v istih celicah vzdržuje matičnih celic usodo [7]. Ustvarili smo nov model miške, da pogojno čezmerno Wnt9b aktivirati kanonično NT signalno pot. Uporabili smo ta model za preverjanje, ali je povečana aktivnost Wnt9b dovolj, da rušijo ravnotežje med prednikov in diferenciacije v mesenchyme cap.

Druga stran, kjer je tako Six2 dejavnost in NT signalizacija igrajo pomembno vlogo piloricne mišica zapiralka . Piloricne sfinkter tvorjen na distalnem koncu želodca in deluje kot ventil, da se omogoči pravilno prebavo hrane pred njenim vstopom v dvanajsternik. Motnje v mišice zapiralke lahko povzroči refluks dvanajstniku vsebine v želodcu predstavlja povečano tveganje za nastanek želodčnega metaplazijo in raka [10], [11]. Ta regija je tudi mesto prirojenih anomalij, vključno z redko motnjo primarne duodenogastric refluksom in bolj pogosta napaka pri rojstvu pilorično stenozo [12]. Six2
pomanjkanje vodi do agenesis od pilorusa mišice zapiralke in antagonizirajoči NT dejavnost z Sfrp1 in Sfrp2 mora vzorec želodec [13], [14]. To nas je pripeljalo do hipotezo, da je treba kanonično NT dejavnost dobro urejena v pilorus podobne, kar je bilo predlagano v ledvicah. Za ta preizkus smo uporabili Six2
-CRe aktivirati Wnt9b
transgenov v Six2
izražanje domene v ledvicah in želodcu.

Pogojno Wnt9b
transgene alel poročali tukaj izraža Wnt9b
in GFP ko aktivira cre rekombinaze. To je biološko aktiven in sposoben reševanje nastanek ledvic v Wnt9b ^{- /-
zarodkov. Čezmerno Wnt9b
v ledvicah ureteric kali je sposoben inducirati gene, povezane z diferenciacijo cap mesenchyme, vendar ne opravi mezenhimskih-to-epitela prehod (MET), da morfološko različne mehurček struktur. Wnt9b
transgenov aktivacija v Six2
-positive celice povzroči ledvične ciste in preoblikovanje distalnih želodčnih regijah v proksimalnem želodčne usodo. Primerjava Wnt9b
gensko spremenjene za alel, ki proizvaja stabilizirani β-catenin protein kaže odmerka odzivne genske spremembe in kaže, da so ti sevi predstavljajo alelov serijo, ki bi morala biti koristna za moduliranje kanonično NT signalizacijo v drugih tkivih.}

Rezultati

transgenih miših izraziti Wnt9b ko aktivira Cre rekombinaze

Wnt9b transgenov je bila zgrajena s kaseto lx-STOP [15] ustvariti pogojno aktivno Wnt9b ki je odvisen od CRE rekombinaza za ekspresijo (sl. 1A). Po aktivirana,-transgen izražen Wnt9b se razlikuje od endogenega Wnt9b ker vsebuje influence hemaglutinin epitop oznako C-terminalu in transgenske celice bodo predstavljeni GFP fluorescence zaradi kaseto IRES-EGFP. Za preizkus zvestobo transgena, smo pregledali cre-odvisno izraz v kultiviranih celicah in vivo z zarodki (sl. 1B). Epitop označena Wnt9b je bilo zaznati v lizatov celic sodeluje transfekciji z transgena in CRE plazmida, in ne v transfekcije od samega transgena. Podobno, lizati iz zarodkov, ki so bili pozitivni tako za Wnt9b in beta-aktin-CRE transgeni vsebuje Wnt9b gripe ker posamezni Wnt9b gensko spremenjene ni. GFP fluorescence opazili pri Wnt9b /β-aktinskih-Cre dvojnih pozitivnih zarodkov in ne Wnt9b littermates (sl. 1C-F). Stopnja izraz transgene Wnt9b povezana z intenzivnostjo GFP fluorescence za vsako ustanovitelja linijo. (Sl. 1D). Štirje neodvisni ustanovni linije niso mogli proizvajati v živo β-aktin-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dvojne heterozigotnih mladiči, ki dokazuje, da je vseprisoten povišana Wnt9b izraz zarodka smrtna. Analiza fazi zarodka, je pokazala, da β-aktina-cre tg /+, Wnt9b tg /+ dvojne heterozigotnih zarodki so odkrili v manj kot je bilo pričakovano Mendlove frekvenc na E11-E12. Posamezen dvojna heterozigotna zarodkov opazili od ustanovitelja z zelo visoko izražanja (sl. 1A, n = 23, pričakovano pogostost 25%) in 16% pa iz različnih ustanovitelja (n = 25) opazili. Wnt9b /ß-aktin-Cre dvojno transgenih zarodki imeli manjše srca z zbiranjem krvi, kar kaže na srčno insuficienco kot vzrok smrti.}

Transgena Wnt9b je biološko aktivna

Če želite ugotoviti, transgene Wnt9b je biološko aktivni, smo testirali, če je sposobna nadomestiti divjim tipom Wnt9b
med razvojem ledvic. Wnt9b <sup>- /-
zarodki kažejo visok penetrantnih volčje žrelo in ledvice fenotipi agenesis (slika 2).. Aktivacija transgene Wnt9b v ureteric kali s Hoxb7
-CRe rešili nastanek ledvic, vendar ni ustih zaprtje na E14.5 v vseh Hoxb7
-CRe tg /+, Wnt9b
- /-, NT
9b tg /+ zarodki (n = 7). Ta ledvice specifične reševanje potrjuje, da je transgena Wnt9b izraz odvisna od aktiviranja CRE, ker nebo ne izrazi Hoxb7
-CRe. Kvantitativni PCR divjega tipa, Wnt9b - /-
in Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ transgene ledvice je pokazala, da transgena Wnt9b
je bila izražena na 2.3- krat višje od ravni gena divjega tipa, medtem ko je izraz Ret
nespremenjena (sl. 2 G-I). Sposobnost transgene Wnt9b signalizirati na mesenchyme zamenjati divjim tipom Wnt9b
dejavnost potrjuje, da je biološko aktiven in vivo.</sup>

Bogastvo podatkov je pokazala, da Wnt9b in β-catenin signalizacija so kritični induktivni signale, ki sprožijo diferenciacijo cap mesenchyme v epithelialized ledvičnih mehurčkov [4], [8], [16]. Wnt9b proizvedeno v ureteric kali aktivira kanonično NT signalno pot v sosednji mesenchyme in rezultatov v izražanju genov, ki uravnavajo mezenhimskih za epitelijskih prehod (MET). Zato smo preizkusili, ali bi čezmernim Wnt9b
v ureteric kali signala na mesenchyme aktivirati MET genske ekspresije in spodbujati večjo indukcijo nephrons. Wnt9b
je prekomerno v ureteric kali uporabo Hoxb7
-CRe: EGFP. E12.5 zarodki so genotipizacijo s kvantitativno analizo PCR za ugotavljanje, ali so bili hemizigotnih ali homozigotna za Wnt9b
transgena in ledvice so bili zbrani za analizo genske ekspresije. Smo zaznali povečanje odmerka odvisno Wnt9b
, ki je bil skupaj s proporcionalno aktivacijo izražanju Wnt9b ciljnih genov, Wnt4
, Pax8
in Fgf8
v treh neodvisnih bazenih transgenih ledvic (sl. 2J). Six2
je izražena v nediferencirani (SKP) mesenchyme in navzdol reguliranih kot mehurček diferenciacija poznamo [17]. Six2
mRNA izraz ne vpliva na Hoxb7
-CRe, Wnt9b
dvojno gensko spremenjene. Podobno ureteric bud geni, Ret
in Wnt11
, niso bistveno spremenjeni s prekomerno Wnt9b
. Specifična Povecanje genov v mesenchyme potrjuje, da je transgenska Wnt9b sposoben signaliziranja od ureteric kali za sprožanje gene pomembne za MET pa ni histološki dokaz zunajmaternične epithelialized ledvičnih mehurčke očitno (podatki niso prikazani). To kaže, da je Povecanje za Wnt9b
v ureteric kali zadostuje za gensko aktivacijo v mesenchyme, ne pa tudi za morfološko diferenciacijo ledvičnih mehurčkov.

Misexpression od Wnt9b moti delovanje ledvic in pilorično nastanek zapiralke z aktiviranjem kanonično beta-catenin signalizacija

paradigma pojavljajo v ledvicah je, da gre za občutljivo ravnotežje med predhodnikom samo obnovo in aktiviranje diferenciacije [6] [7] [9]. Wnt9b /β-catenin pot je potrebna za razlikovanje in Six2 zavira diferenciacijo na začetni stopnji zavezanosti. Zato smo predpostavili, da bi bila sposobnost Six2 spodbujanje odločitev usode nasprotno od tistih, ki aktivira z visoko β-catenin aktivnosti pogosta tema v razvoju. Testirali smo to možnost z aktivacijo gensko Wnt9b
s Six2
-CRe. Dvojni gensko spremenjene izražajo Wnt9b
v istih celicah, ki izražajo Six2
in lahko motijo ​​procese, ki so coordinately urejena v ledvicah in drugih tkivih. Six2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
miši razstavljena stiske ob odstavitvi in ​​meritve telesne teže so v štirih tednih (14,5 ± 3,4 zmanjša za 39% g, p < 0,001) v primerjavi z ust-negativne Wnt9b tg /+
gnezda (23,6 ± 0,7 gramov). Fenotipske analiza je pokazala, da je bilo to zmanjšanje telesne teže zaradi nepravilnosti v prebavnem sistemu in ledvice, dveh mest v Six2
-CRe izraz (sl. 3).}

Številne cist različno velikosti so bili vidni v korteksu in možgansko deblo dvojnih heterozigotnih ledvic (sl. 4, n = 11/11). Ciste so pretežno nahaja v skorji in zunanji sredice in so proksimalne tubulov izvora, kot je razvidno iz LTL-barvanjem. Cistične bolezen je bila prva očitna takoj po rojstvu (P7-10) v proksimalnih segmentih nefron (podatki niso prikazani). Te dvojne heterozigotnih živali razstavljene povišane koncentracije kreatinina v serumu (0,652 ± 0,044, p < 0.005) v primerjavi s kontrolnimi gnezda (0,119 ± 0,002), kot je že v ~3 tednov starosti, ki kažejo hudo odpoved ledvic. Starejše živali z napredovalo boleznijo vsebuje tudi ciste, ki izhajajo iz več distalnih segmentov, vključno z zanko HENLE (Tamm-Horsfall pozitivni). Pri vseh živalih z odpovedjo napredno ledvic preučiti, smo opazili veliko zbiranje ciste-kanalskih izhaja, da je izrazila Aquaporin 2 ali vezane D. Biflorus
-lectin. Ker Six2
-CRe ni izražena v zbirni kanal, je to dilatacija verjetno drugotnega pomena dilatacije v bolj proksimalnih segmentih. Prisotnost ledvičnih cist v Wnt9b
transgenih živali krepi ugotovitev, da motnje v sistemu NT signalizacije povzroča cistično bolezen [7], [18] [19].

Čeprav so ledvične ciste ni prisotna šele po rojstvu, je bila Povecanje od kanonične NT signalizacijo vidni E12.5 ko Six2
-CRe je najprej izrazil. Lef1 protein izraz je bil v pre-cevnih agregatov in ledvičnih struktur veziklov povečala v dvojnih gensko spremenjene in v številnih zunajmaternične mehurčkov, ki nastanejo pri stabilizirani beta-catenin ledvic (n = 3, sl. 5), je še toliko večji. Povečanje odmerka, ki se odzivajo na Lef1 izražanja podpira objavil podatke, da Wnt9b deluje, čeprav kanonično NT signalne poti v ledvicah v razvoju [7]. Pomanjkanje zunajmaternične veziklov struktur v Wnt9b
gensko spremenjene organizme, kaže, da je Wnt9b
alel kaže zmeren učinek na β-catenin signalizacijo v primerjavi z stabilizirane alel β-catenin.

drugi fenotip prispeva k zmanjšanju telesne teže v Six2-CRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
dvojne heterozigoti bil želodčne stiski. Rumena plodovnica opazili v želodcu dvojnih gensko spremenjene in ne v enojnih transgenih littermates (n = 6, sl. 6). To kaže, da duodenogastric refluksom, ki se pojavljajo in so lahko posledica nenormalnega pilorično nastanek sfinktra. Sfinkter med želodca in dvanajstnika je podolgovate razširjene v dvojnem transgenih (sl. 6, vstavljenim). TGFβ antagonist, Nephrocan, ki je običajno izražena v vzorcu zelo omejenem na E16.5 je bil razširjen v dvojnih gensko spremenjene, kar kaže, da je mišica zapiralka regija ni bil ustrezno omejeno. Ta podaljšani morfologija je podprta z imunohistokemijskim barvanjem gladko mišično plast, ki tvori gosto mišično steno, ki obkroža pilorus (sl. 6 E, F). V posameznih transgenih kontrol, je bila najdebelejša mišičje najdemo tam, kjer tkivo kaže največ zožitev na mišice zapiralke (črta). V dvojno gensko spremenjene, so opazili debela mišičavost, vendar je ta regija je odmik od območja, ki je bilo najbolj zožen.}

Mis-vzorčenje napake so opazili tudi z analizo posebne oznake, ki razlikujejo med proksimalno (H ^{+ /K + -ATPaze) in distalnim (Alcian modra) regijo želodcu. Proksimalnega želodec (corpus) vsebuje H + /K + -ATPaze-izražanje parietalnih celicah, ki so izključeni iz antruma-pilorus regiji. Nasprotno pa antruma-pilorus vsebuje sluznice celice, ki madež z Alcian Blue, ki jih ne najdemo v proksimalnem regiji [20]. Dvojni gensko spremenjene razstavljena vztrajno H + /K + ATPase obarvanje in odsotnost Alcian modro-pozitivna sluznice v antralnih želodcu-pilorus kaže, da je distalni regija mis-potiskane s proksimalno usodo z Wnt9b
izraz. Alcian modro obarvanje čašo celic v črevesju je bila nedotaknjena v obeh enojnih in dvojnih gensko spremenjene zaradi Six2
-CRe ni izražena v dvanajsternik. To napačno vzorčenje kažejo, da, podobno kot na paradigmo v ledvicah, kanonično β-catenin signalizacija določa eno usodo, predželodcih regijo, in vzorci Six2 aktivnosti distalni identitete. To je podprto z izrazom področjih teh genov, saj kanonični NT signalizacija reporter kaže visoko aktivnost le v predželodcih in Six2
je omejena na distalnem želodca in pilorus [13], [14].}

Če je kanonično NT signalizacija odgovoren za želodca refluks v Six2-CRE ^{TG /+
, Wnt9b TG /+
dvojno gensko spremenjene, potem malformacije upoštevati je treba ponavljati v modelu miši, ki izraža stabiliziranega beta-catenin v isti domeni ( Ctnnb1 EX3 /+
, [21]). Po aktivaciji CRE, ta alel preprečuje proteolitično degradacijo beta-catenin in pričakovati je mogoče dvigniti kanonično NT signalizacijo v večji meri kot sama Wnt9b ligand. Cela gori v analizi situ E12.5 želodcev je razkril tri gene, Grem1
, NKX 2,5
in Gata3
, ki so običajno izražene v tankem pasu demarking regija, ki bodo postali sfinkter (n = 8, sl. 7). Zunajmaternična izraz Wnt9b
zatrl antagonist BMP Grem1
in transkripcijski faktor Gata3
v tej regiji, in ti geni so še dodatno navzdol reguliranih ko β-catenin signalizacija se je povečala. širitev odvisnosti od odmerka so opazili za transkripcijski faktor Nkx2.5
v obeh mutantov. Geni, ki so lokalizirane samo na črevesju ( villin
) ali predželodcih ( Bmp4
) ni bila spremenjena v obeh mutiranih (podatki niso prikazani). Povečana kanonično NT signalizacijo v antralnih želodcu in pilorus je bila potrjena z izolacijo v tej regiji in izvajanju kvantitativno PCR. Kanonično NT ciljni geni, ki so povečana pri stabilizirane alel β-catenin, Lef1
in Axin2
, so se povečale tudi v pilorusa regiji Six2
-CRe tg /+, Wnt9b tg /+ dvojne gensko spremenjene [ Lef1
, 2,0 ± 0,25 in Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Skupaj doze odzivajo na izražanje genov opazili v pilorično regiji Wnt9b
gensko spremenjene in stabilizirane β-catenin zarodkov spremembe kažejo, da povečana kanonično NT signalizacija moti distalni želodec in pilorično razvoj zapiralke.}

Pogovor

Ti rezultati opisujejo oblikovanje novega modela miške, da pogojno aktivira kanonično NT signalizacijo. Wnt9b
transgenov je inducibilni po izpostavitvi CRE rekombinaze in izraža GFP kot označevalec indukcije. Prav tako ohranja popolno biološko aktivnost, saj lahko reši Wnt9b ^{- /-
fenotipov v ledvicah. Te miši so se ohranila v našem naselju za več kot eno leto in povzroči Wnt9b
izraz na vzreje do več različnih sevov ust. Smo uporabili to novo sev aktivirati NT signalizacije v Six2
-positive celic in ugotovila škodljive učinke na ledvice in želodec.}

V ledvicah, Wnt9b se izloča iz ureteric bud epitelija inducira sosednjih kapica mesenchyme predniških celic sprožiti diferenciacijo. V podporo tega modela, naše in vivo dobiček-of-funkcijo študije kažejo, da je Wnt9b
upregulates zgodnje označevalce ledvične diferenciacije mehurčkov kot Wnt4
, Fgf8
in Pax8
. Kljub temu, da so ledvični mehurčka geni povzročene z Wnt9b
transgenov, nismo upoštevali morfološko dokazov povečane ali ektopično nastajanje ledvic mehurčkov, kot poroča za Six2
mutanti [9]. Poleg tega, da NT induktivnega signala, dejavniki, ki ohranjajo bazen ledvic matičnih celic (npr Six2
) morajo biti navzdol reguliranih tudi v celoti izzove ledvično nastajanje mehurčkov. Six2
izraz ni spremenil v našem Wnt9b
transgenih in tako lahko pojasni, zakaj povečanje Wnt9b ni povzročil zunajmaternične ledvičnih mehurčkov. Zunajmaternična indukcija ledvičnih markerjev veziklov je povzročena z aktivacijo beta catenin v Six2
-positive metanephric mesenchyme pomočjo stabiliziranega alel β-catenin [4], zato je razlika med tema dvema gain-of-funkcijo eksperimentov se lahko nanaša na stopnjo, do katere se aktivira kanonično NT dejavnost. Poleg tega je verjetno, da aktivacija kanonične signalizacijo, ki ga Wnt9b v metanephric mesenchyme povzroči inhibicijo povratne informacije, kot je navedeno v drugih NT odzivnih tkivih, s čimer se prepreči indukcijo celoten program diferenciacije [22]. Zadnji podatki podpirajo to zamisel inhibicije povratne informacije, saj je potrebno Wnt9b /β-catenin signalizacija ne le za diferenciacijo metanephric mesenchyme, toda paradoksalno je potrebno tudi isti signal za ohranjanje in razširitev bazena ledvic matičnih [7]. Predvidevamo, da je stabiliziran β-catenin, ki deluje navzdol na poti, lahko bypass teh regulatornih mehanizmov. Te možnosti se lahko preskusijo v prihodnjih študijah, ki jih primerjati pomena za aktivacijo genov pri ledvičnih matičnih celic z Wnt9b
transgena in stabilizira β-catenin gain-of-funkcijo miši.

motnje v kanonično NT signalizacijo pot so pokazale, da je pomembno v patogenezo ledvične cistične bolezni (ogledal Patel et al., [23]). Transgeni izraz stabiliziranega beta catenin ali pomanjkljivosti APC v tubularno epitela privede do ledvične cistične bolezni, ki podpirajo sklep, da je zunajmaternična kanonično NT signalizacija zadostuje za cystogenesis [18], [19]. Odpoved ledvic in cistična dilatacija v Six2
-CRe ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dvojne heterozigoti dodatno podpira hipotezo, da molekul kanonično NT signalizacija povzroča ciste. Prekinitev ne kanonično NT signalizacije (PCP) poti, je pomemben nastanek ledvične ciste [24] V prav. Tako je možno, da tvorba ciste v našem modelu ne zgolj zaradi aktiviranja kanonični signalizacijo, ampak je posledica motenj relativnega ravnotežja med kanonični in nekanonične signalizacijo. V podporo tej ideji, so geni, ki so mutirani v podedovanih oblikah cistične bolezni ( PKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) lokalizirati na migetalk in te organele so nedavno pokazale, da se lahko regulira ravnotežje med kanonični in nekanonične NT signalizacijo [25], [26].}

prišlo je do hude ledvične fenotip, čeprav Wnt9b
mRNA izraz se poveča ~2-krat v našem transgena, kar kaže, da je relativno nizka stopnja, vztrajen aktivacija tej poti vodi do ledvic. Ta raven uravnavanjem Wnt9b v ureteric kali uporabo Hoxb7
-CRe ni proizvodnjo ciste, kar kaže, da cystogenesis v zbiralne vodov v Six2
-CRe ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dvojne gensko spremenjene je verjetno sekundarna učinek razširjene cevastih odsekov (podatki niso prikazani). V podporo temu, pri poporodnih dnevne 7-10 živali, cistične bolezni je razvidno iz le cevastih odsekov bližnjih z zbiralno vodu. Podobno policistične bolezni ledvic pri bolnikih, ki so transgene miši razvila huda ledvična odpoved, čeprav je večina nephrons ne razvijejo ciste. S tem se zastavlja vprašanje, ali so ledvičnih tubulov brez vidnih cist nenormalno in pomembno prispevajo k postopnemu delovanja ledvic pri teh motnjah. Nedavne študije kažejo, da odrasli ledvičnih epitelij tubulih izraziti Wnt9b, Frizzled receptorje in LRP5 /6 co-receptorje, ki so sposobni posredovanje kanonično NT signalizacije v odgovor na akutne ishemične poškodbe [27]. Pri tej nastavitvi NT signalizacijo spodbuja Cjevčica popravilo in regeneracijo. Vendar pa je bila NT signalizacija dejavnost vpleten tudi pri spodbujanju ledvic fibrozo po poškodbi, tako kot v modelu UUO [28]. Na splošno te študije poudarjajo pomen urejanja NT signalizacije v ledvicah odraslih uravnotežiti pozitivne odzive, kot je popravilo /obnovo in neprilagojeno odzive, ki vodijo k fibrozi in kronične motnje delovanja organov.}

piloricne regija želodca predstavlja kritična meja, ki ločuje želodec iz črevesa. Zaprtje sfinkter ko bolus hrana vstopi v želodec omogoča pravilno prebavo pred tranzit v tankem črevesu. Molekularni podlaga za nastanek tega diskretnega regiji dobro ne razume, čeprav se pojavljajo nekatere podrobnosti. Ti rezultati kažejo, da je strog nadzor NT signalizacijo ključnega pomena za razvoj pilorus. Canonical NT dejavnost našli v Fundus in telesa (corpus), vendar izključeni iz oddaljenega želodca in pilorus [13]. V Barx1
- /- miši, želodec je majhen, antralnih-korpus meja je zamegljen in je agenesis v pilorično mišice zapiralke. Eleganten študije tkivo rekombinacije kažejo, da so ti fenotipov posledica izgube izražanja NT antagonistov Sfrp1 in Sfrp2. Ker pa Barx1
pomanjkljivost ima globalne učinke na razvoj foregut, ni bilo jasno, ali navzdol ureditev kanonični NT dejavnosti je posebej potrebno za formiranje pilorus. Naše raziskave bolj neposredno testiran to možnost z usmerjanjem zunajmaternično NT dejavnost na omejenem območju le prednjim delom pilorus s Six2
-CRe.

Ugotovili smo, da zunajmaternične NT dejavnost posebej moti nastanek pilorusa sfinkter v odsotnosti svetovnih napak v razvoju želodcu. Zato je potrebna navzdol ureditev kanonične NT dejavnost tipom pilorično regijo, ki loči želodec od črevesju. Zunajmaternična izraz Wnt9b liganda in stabilizira beta-catenin pri transgenih miših lahko premaga utrujenost izloča endogenih NT antagonisti Sfrp1 /2, v skladu z vzorcem, ki ga Kim et al [13] predlagala. Podobno kot pri naših rezultatov v Six2
mutanti pa se zmanjša izražanje Nkx2.5
in Gremlin
, geni, ki so pomembni za pilorično razvoj zapiralke v chick [14] [29]. To pomeni, da Six2
in NT
urediti skupni genetski kaskado v domnevnih pilorično mišice zapiralke. Domnevamo, da je pomembna funkcija Six2
lahko razlaga kanonično signale NT v različnih razvojnih okoljih.

molekul kanonično NT signalizacija je tudi dokazano, da vplivajo na vranica in razvoj trebušne slinavke [30]. V podporo temu je bilo opaziti tudi vranica in trebušna slinavka hipoplazija v Six2
-CRe, Wnt9b
bi-transgenih miših (podatki niso prikazani). Ker Six2
-CRe ni izražena v teh tkivih, to pomeni, da se lahko signali iz posteriorni želodca mesenchyme na vpliva na vranico in trebušno slinavko med razvojem. To bi podpirajo hipotezo, da lahko piloricne regija deluje kot organizator za tvorbo teh pomožnih organov. Med razvojem, vranica prekurzorske celice začasno povezati z pilorusa regijo, pred njihovim prehodom na levi strani želodca, kjer kondenzira [31]. Čeprav ni zaznati Six2
-CRe izraz v vranice primordium ali mesothelium, ne moremo izključiti, da se prehodno izražanje Six2
-CRe v teh regijah je odgovoren za napake v vranici in trebušne slinavke . Nadaljnje študije so potrebne za neposredno preizkusiti te možnosti.

Če povzamemo, smo razvili nov model miške, ki omogoča časovno in prostorsko izražanje Wnt9b. V ledvicah v razvoju, lahko transgene Wnt9b
spodbudilo predčasno MET genske ekspresije v Six2
-positive ledvičnih matičnih celic, vendar to ni dovolj, da aktivirate celoten program diferenciacijo. Obstojne izraz Wnt9b v Six2
-positive celic vodi do ledvičnih cist in hude okvare organov. V želodcu, zunajmaternične NT β-catenin aktivnost v pilorično regiji spremeni oblikovanje zapiralke in distalni želodčne patterning. Skupaj, te ugotovitve izpostavljajo pomen strogega nadzora NT dejavnosti, in kažejo, da so Six2 in β-catenin vključene v vzorčenje organov v različnih kontekstih.

Materiali in metode

Etika izjava

študije na živalih so bili odobreni odbor za oskrbo živali in uporabo Saint Louis University (protokol 1460) in St. Louis VA (protokol 0305). Vsi postopki, ki vključujejo živali, so v skladu z institucionalnimi dobrega počutja živali predpisi, standardi in politikami.

Miške

Wnt9b
transgenih miših so prestopile vsako od treh različnih CRE linij [32 ]. 1) β-actin- ust je bila uporabljena za izražanje Wnt9b povsod (slika 1, [33]) 2) Hoxb7
-CRe. EGFP je bil uporabljen za čezmerno Wnt9b v svoji endogeno lokaciji v ledvicah je ureteric bud (slika 2, [34].) in 3) BAC Six2
-CRe: EGFP transgen bila uporabljena za izražanje Wnt9b eksogeno v želodcu in ledvicah (sl 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• Plos ONE: žužkojede netopirje Digest hitina v želodcu Uporaba kisla sesalce Chitinase
• Plos ONE: Vključevanje želodčne vsebine in stabilnih izotopov Analize za Količinsko prehrani Pygoscelid Penguins