PLoS ONE: Betinget ekspression af Wnt9b i Six2-positive celler forstyrrer Mave og Nyre Function

Abstrakt

Under nyre udvikling, kanonisk Wnt signalering aktiverer differentiering, mens transskription faktor Six2 fastholder stamfader pool. Disse modsatrettede signaler bidrage til at regulere nephron dannelse og sikre fuldtallige nefroner dannes. Da disse to faktorer styrer forskellige skæbner i nyre mesenkym, vi hypotese, at overekspression af Wnt9b
i Six2
udtrykkende celler ville forstyrre nyre dannelse og kan ændre celle differentiering beslutninger i andre væv. Vi skabte en transgen mus, der betinget udtrykte kanoniske Wnt ligand i udviklingslandene nyre, Wnt9b
. Transgenet aktiveres af cre-rekombinase og udtrykker GFP. Vi først afprøvet sin biologiske aktivitet ved hjælp af Hoxb7-CRE
og fandt, at transgene Wnt9b var i stand til at inducere differentiering gener og redde nyre udvikling i Wnt9b ^{- /- Salg homozygot defekte mus. I modsætning hertil udtryk for Wnt9b
i celler ved hjælp af Six2-cre
forårsagede mave nød og svær nyresvigt hos voksne mus. Transgene nyrer havde talrige cystisk tubuli og forhøjet kreatinin værdier (0,652 ± 0,044) sammenlignet med vildtype-mus (0,119 ± 0,002). Disse dyr udstillet også et misdannet pylorus lukkemuskel, duodenogastrisk reflux, og en transformation af den distale mave i proksimal skæbne. Genekspressionen observerede ændringer til Wnt9b: EGFP
transgen blev sammenlignet med en stabiliseret β-catenin-allel for at bestemme, at Wnt9b aktiverer den kanoniske Wnt-vejen i de analyserede væv. Disse resultater viser, at ekspressionen af ​​ Wnt9b
i Six2
-positive celler forstyrrer celle skæbne beslutninger i nyrer og mave-tarmkanalen}

Henvisning:. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) Betinget ekspression af Wnt9b i Six2
-Positiv Cells forstyrrer mave og nyrefunktion. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10,1371 /journal.pone.0043098

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: Februar 29, 2012; Accepteret: 17 juli 2012; Udgivet: 17 august, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud R01 DK067222 (http://nih.gov/) og American Heart Association Etablerede Investigator 0840117N (http://www.heart.org) til MR. SK blev understøttet af en Saint Louis University Presidential Research Fund Award (www.slu.edu). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den kanoniske Wnt signalvejen er en vigtig regulator af celle skæbne, celledeling, og celleadhæsion under udviklingen og gennem hele voksenlivet. Talrige positive og negative mediatorer er blevet identificeret som arbejder sammen for at opnå stram regulering af β-catenin signalering. Den centrale paradigme er, at cytoplasmatisk β-catenin afsondres i en ødelæggelse kompleks, phosphoryleres med GSK3p, og målrettet mod ubiquitin ødelæggelse pathway i fravær af et Wnt-signal. Wnt binding inhiberer phosphorylering og destruktion af β-catenin, gør det muligt at translokere til kernen for at påvirke målrette genekspression med TCF /LEF faktorer (gennemgået af MacDonald et al. [1]). Talrige musemodeller er blevet oprettet for at studere denne vej, herunder både gevinst og tab af funktion alleler af Wnts, Wnt receptorer, β-catenin, og TCF /LEF transkriptionelle regulatorer. Disse modeller har afdækket væsentlige roller for kanonisk Wnt signalering i knogler, hår, tarm, blod, og kræft [2]. En spirende tema fra disse studier er, at mange biologiske processer er akut følsomme for styrken af ​​kanoniske Wnt-signalering.

Denne stramme regulering af kanoniske Wnt signalering er væsentlig for nyre udvikling. Under de indledende faser af nyre-dannelse, er Wnt9b secerneres fra ureteric bud og signaler til progenitorceller i hætten mesenkym at inducere nephron differentiering. Behandling med lithiumchlorid eller aktivering af β-catenin kan inducere nephron differentiering i fravær af ureteric bud og Wnt9b, hvilket tyder på, at en stigning i kanoniske Wnt signalering er tilstrækkeligt til dette induktive begivenhed [3], [4]. Nogle cap mesenchym prolifererer at opretholde progenitorcellerne, der kræves for efterfølgende gentagelser af denne proces [5]. Denne balance mellem stamcelle vedligeholdelse og induktion af differentiering er af afgørende betydning at sikre, at nyren danner fuldtallige nefroner [5], [6], [7], [8], [9].

Flere faktorer udtrykt i hætten mesenkym har vist sig at modvirke Wnt-stimuleret differentiering, herunder transskription faktor Six2
. Sletning af Six2
resultater i ektopisk differentiering, udtynding af cap mesenchym stamceller og nyre agenesi [9]. Selv om den nøjagtige mekanisme endnu ikke er kendt, er en hypotese blevet foreslået, hvorved høje niveauer af kanoniske Wnt signalering drive forpligtelsen til differentiering hvorimod høj Six2 aktivitet i de samme celler opretholder stamfader skæbne [7]. Vi har skabt en ny musemodel til betinget overudtrykker Wnt9b at aktivere den kanoniske Wnt signalvejen. Vi har brugt denne model til at teste, om øget Wnt9b aktivitet er tilstrækkelig til at ødelægge balancen mellem stamfædre og differentiering i hætten mesenkym.

En anden sted, hvor både Six2 aktivitet og Wnt signalering spiller en vigtig rolle er pylorus lukkemuskel . Pylorus sphincter er dannet ved den distale ende af maven og fungerer som en ventil for at muliggøre ordentlig fordøjelse af fødevarer, inden det føres ind i duodenum. Dysfunktion af sphincter kan resultere i tilbageløb af duodenale indhold i maven udgør en øget risiko for gastrisk metaplasi og cancer [10], [11]. Denne region er også stedet for medfødte misdannelser, herunder den sjældne lidelse primære duodenogastrisk reflux og den mere almindelige misdannelse pylorusstenose [12]. Six2
mangel fører til agenese af pylorus lukkemuskel og antagonisering Wnt aktivitet med Sfrp1 og Sfrp2 er forpligtet til mønster maven [13], [14]. Dette førte os til at hypotesen, at kanoniske Wnt aktivitet skal tæt reguleret i pylorus ligner det, der er foreslået i nyrerne. For at teste dette har vi brugt Six2
-cre at aktivere Wnt9b
transgen i Six2
udtrykke domæner i nyre og mave.

Den betingede Wnt9b
transgene allel rapporteret her udtrykker Wnt9b
og GFP når de aktiveres af cre rekombinase. Det er biologisk aktiv og i stand til at redde nyre dannelse i Wnt9b ^{- /-
embryoner. Overekspression af Wnt9b
i nyrerne ureteric bud er stand til at inducere gener associeret med differentiering af hætten mesenkym, men undergår ikke mesenchymale-til-epitel overgang (Met) til frembringelse morfologisk forskellige vesikel strukturer. Wnt9b
transgen aktivering i Six2
-positive celler forårsager nyre cyster og en transformation af de distale mave regioner i proksimal mave skæbne. Sammenligning af Wnt9b
transgene til en allel, der producerer stabiliserede β-catenin-protein viser dosis-responsive gen ændringer og foreslår, at disse stammer repræsenterer en allel serie, der bør være værdifuld til modulering kanonisk Wnt signalering i andre væv.}

Resultater

Transgene mus udtrykker Wnt9b når det aktiveres af cre rekombinase

Wnt9b transgen blev konstrueret med en lox-STOP kassette [15] for at oprette en betinget aktiv Wnt9b der afhænger af cre rekombinase til ekspression (fig. 1A). Når den er aktiveret, transgenet-udtrykte Wnt9b kan skelnes fra endogen Wnt9b fordi det indeholder et C-terminalt influenza hæmagglutinin epitopmærke og transgene celler vil udvise GFP-fluorescens som følge af den IRES-EGFP kassette. For at teste nøjagtigheden af ​​transgenet, undersøgte vi cre-afhængig ekspression i dyrkede celler og in vivo i embryoner (fig. 1B). Epitopmærket Wnt9b kunne påvises i lysater af celler cotransficeret med transgenet og en CRE plasmid, og ikke i transfektioner af alene transgenet. Tilsvarende lysater fra embryoner, der var positive for både Wnt9b og β-actin-CRE transgener indeholdt Wnt9b-FLU mens enlige Wnt9b transgene ikke gjorde. GFP-fluorescens blev observeret i Wnt9b /β-actin-Cre dobbelt positive embryoner og ikke i Wnt9b kuld (fig. 1C-F). Ekspressionsniveauet af transgen Wnt9b korreleret med intensiteten af ​​GFP-fluorescens for hver grundlægger linje. (Fig. 1D). Fire uafhængige grundlægger linjer var ude af stand til at producere levende β-actin-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dobbelt heterozygote hvalpe, der viser, at allestedsnærværende forhøjet Wnt9b udtryk er embryonale dødelige. Analyse af embryonale stadier afslørede, at β-actin-cre tg /+, Wnt9b tg /+ dobbelt heterozygote embryoner blev påvist på mindre end forventet mendelske frekvenser på E11-E12. En enkelt dobbelt heterozygote embryoner blev observeret fra en stifter med meget høj ekspression (fig. 1A, n = 23, forventet frekvens 25%) og 16% blev observeret fra en anden stifter (n = 25). Wnt9b /ß-actin-Cre dobbelt transgene embryoner havde mindre hjerter med pooling af blod, hvilket tyder på hjerteinsufficiens som dødsårsagen.}

Transgene Wnt9b er biologisk aktiv

For at afgøre, om transgene Wnt9b er biologisk aktive, vi testede, om det var i stand til at erstatte vildtype Wnt9b
under nyre udvikling. Wnt9b <sup>- /-
embryoner udviser høj penetrans ganespalte og renale agenesis fænotyper (figur 2).. Aktivering af transgen Wnt9b i ureteric opløbet med Hoxb7
-cre reddet nyre dannelse, men ikke Gane lukning E14.5 i alle Hoxb7
-cre tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b tg /+ embryoner (n = 7). Denne nyre-specifikke redning bekræfter, at transgen Wnt9b udtryk er afhængig af ska aktivering, fordi ganen ikke udtrykker Hoxb7
-cre. Kvantitativ PCR af vildtype, Wnt9b - /-
Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ transgene nyrer viste, at transgene Wnt9b
blev udtrykt ved 2.3- fold højere niveauer end vildtype-genet, mens ekspression af Ret
var uændret (fig. 2 G-i). Evne transgene Wnt9b at signalere til mesenchymet at erstatte vildtype Wnt9b
aktivitet bekræfter, at det er biologisk aktiv in vivo.</sup>

Et væld af data har vist, at Wnt9b og β-catenin signalering er kritiske induktive signaler, der initierer differentiering af cap mesenkym i epitheliserede nyre vesikler [4], [8], [16]. Wnt9b produceret i ureteric bud aktiverer den kanoniske Wnt signalvejen i den tilstødende mesenkym og resulterer i ekspressionen af ​​gener, der regulerer mesenkymale at epiteliale overgang (Met). Derfor testede vi, om overekspression af Wnt9b
i ureteric opløbet ville signalere til mesenchymet at aktivere MET genekspression og at fremme øget induktion af nefroner. Wnt9b
blev overudtrykt i ureteric opløbet med Hoxb7
-cre: EGFP. E12.5 embryoer blev genotype ved kvantitativ PCR-analyse for at afgøre, om de var hemizygote eller homozygote for Wnt9b
transgen og nyrerne blev indsamlet for genekspression analyse. Vi har registreret en dosisafhængig stigning i Wnt9b Hoteller, som blev ledsaget af en proportional aktivering af ekspressionen af ​​de Wnt9b målgener, Wnt4
, Pax8
, og FGF8
i tre uafhængige pools af transgene nyrer (fig. 2J). Six2
udtrykkes i udifferentierede (cap) mesenkym og nedreguleres som vesikel differentiering ensues [17]. Six2
mRNA-ekspression er upåvirket i Hoxb7
-cre, Wnt9b
dobbelt transgene. Tilsvarende ureteric opløbet generne, Ret
og Wnt11
, ikke signifikant ændret ved overekspression af Wnt9b
. Den specifikke opregulering af gener i mesenkymet bekræfter, at transgene Wnt9b kan signalere fra ureteric bud at inducere gener er vigtige for MET imidlertid ingen histologiske tegn på ektopiske epitheliserede renale vesikler var tydelig (data ikke vist). Dette antyder, at opregulering af Wnt9b
i ureteric bud er tilstrækkelig for genaktivering i mesenkymet, men ikke for morfologisk differentiering af renale vesikler.

Misexpression af Wnt9b forstyrrer nyrefunktion og pylorus sphincter dannelse ved at aktivere kanonisk β-catenin signalering

paradigme opstå i nyrerne er, at der er en hårfin balance mellem stamcelle self fornyelse og aktivering af differentiering [6], [7], [9]. Den Wnt9b /β-catenin vej er nødvendig for differentiering og Six2 undertrykker differentiering i den indledende trin af engagement. Derfor fremsatte vi den hypotese, at evnen hos Six2 til at fremme beslutninger fate modsatte fra dem aktiveres ved høj β-catenin-aktivitet kunne være et fælles tema i udvikling. Vi testede denne mulighed ved aktivering af transgene Wnt9b
med Six2
-cre. De dobbelte transgene udtrykker Wnt9b
i de samme celler, der udtrykker Six2
og kunne forstyrre processer, der er koordineret reguleret i nyren og andre væv. Six2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
mus udstillet nød ved fravænning og kropsvægt målinger blev reduceret med 39% ved fire uger (14,5 ± 3,4 gram, p < 0,001) sammenlignet med cre-negative Wnt9b tg /+
kuld (23,6 ± 0,7 gram). Fænotypisk analyse viste, at denne reduktion i kropsvægt skyldes misdannelser i mave-tarmsystemet og nyrerne, to steder i Six2
-cre udtryk (fig. 3).}

Mange cyster af varierende størrelser var synlige i cortex og medulla af de dobbelte heterozygote nyrer (fig. 4, n = 11/11). Cysterne blev overvejende placeret i cortex og ydre medulla og var af proksimale tubulus oprindelse som demonstreret ved LTL-farvning. Cystisk sygdom blev først tydelig hurtigt efter fødslen (P7-10) i de proksimale dele af nephron (data ikke vist). Disse dobbelte heterozygote dyr udstillet forhøjede serum kreatinin niveauer i (0,652 ± 0,044, p < 0,005) sammenlignet med kontrol kuld (0,119 ± 0,002) så tidligt som -3 uger gamle, indikerer alvorlig nyresvigt. Ældre dyr med fremskreden sygdom indeholdt også cyster afledt fra mere distale segmenter, herunder Henles slynge (Tamm-Horsfall-positiv). I alle dyr med fremskreden nyresvigt undersøgte, vi observeret mange opsamlingskanal-afledte cyster, der udtrykte Aquaporin 2 eller bundet D. Biflorus
-lectin. Da Six2
-cre ikke udtrykkes i samlerørene, denne dilatation sandsynligvis sekundær til dilatation i mere proksimale segmenter. Tilstedeværelsen af ​​nyre cyster i Wnt9b
transgene dyr styrker den konklusion, at afbrydelse af Wnt signalsystem forårsager cystisk sygdom [7], [18], [19].

Selvom nyre cyster var ikke til stede før efter fødslen, opregulering af kanoniske Wnt signalering var tydelig på E12.5 når Six2
-cre er oprindeligt udtryk. LEF1 proteinekspression blev forøget i præ-rørformede aggregater og renale vesikel strukturer i de dobbelte transgene og blev yderligere forøget i de mange ektopiske vesikler dannet med stabiliserede p-catenin nyrer (n = 3, fig. 5). Dosis-responsive stigning i LEF1 ekspression understøtter offentliggjort data, Wnt9b, handler om den kanoniske Wnt signalvejen i udviklingslandene nyre [7]. Manglen på ektopisk vesikel strukturer i Wnt9b
transgene tyder på, at Wnt9b
allel udviser en moderat effekt på β-catenin signalering sammenlignet med den stabiliserede β-catenin allel.

Den anden fænotype bidrager til reduceret kropsvægt i Six2-cre ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
dobbelt heterozygoter var gastrisk nød. Gul fostervand blev observeret i maven af ​​dobbelt transgene og ikke i enkelt-transgene søskende (n = 6, fig. 6). Dette indikerede, at duodenogastrisk tilbagesvaling forekommende og kan skyldes unormal pyloric sphincter formation. Lukkemusklen mellem mavesækken og tolvfingertarmen blev aflang og udvidet i den dobbelte transgene (fig. 6, indsat). The TGFp-antagonist, Nephrocan, som normalt udtrykkes i en meget begrænset mønster på E16.5, blev udvidet i dobbelte transgener, hvilket antyder, at sphincter regionen ikke var korrekt begrænset. Denne aflange morfologi blev understøttet af immunhistokemisk farvning af den glatte muskulatur lag, der danner den tætte muskulære væg, der omgiver pylorus (fig. 6 E, F). I enkelte transgene kontroller blev den tykkeste muskulatur findes, hvor vævet udviser den mest konstriktion ved sphincter (linje). I de dobbelte transgene, blev tyk muscularity observeret, men denne region blev forskudt fra det område, der var den mest trange.}

Mis-mønsterruller defekter blev også observeret ved at analysere specifikke markører, der skelner mellem den proksimale (H ^{+ /K + ATPase) og den distale (Alcian blue) region af maven. Den proksimale mave (corpus) indeholder H + /K + ATPase-udtrykkende parietalceller, der er udelukket fra antrum-pylorus region. Omvendt antrum-pylorus indeholder slimhindeceller pletten med Alcian blå, der ikke findes i det proximale område [20]. De dobbelte transgener udviste persistent H + /K + ATPase farvning og fraværet af Alcian Blue-positive slimhinde i antrale mave-pylorus indikerer, at det distale område er mis-mønstrede til proximal skæbne ved Wnt9b
udtryk. Alcian blå farvning af slimceller i tarmen var intakt i både enkelt og dobbelt transgene fordi Six2
-cre ikke udtrykkes i tolvfingertarmen. Denne mis-mønsterdannelse antyder, at i lighed med paradigme i nyren, kanoniske β-catenin signalering angiver en skæbne, formaven region, og Six2 aktivitetsmønstre den distale identitet. Dette understøttes af udtrykket domæner af disse gener, idet en kanonisk Wnt signalering reporter udviser høj aktivitet kun i formaven, og Six2
er begrænset til den distale mave og pylorus [13], [14].}

Hvis kanoniske Wnt signalering er ansvarlig for den gastroduodenale reflux i Six2-CRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
dobbelt transgene, derefter misdannelser observeret bør sammenfattet i en musemodel, der udtrykker en stabiliseret β-catenin i samme domæne ( Ctnnb1 EX3 /+
, [21]). Efter cre aktivering, denne allel forhindrer proteolytisk nedbrydning af β-catenin og ville forventes at hæve kanoniske Wnt signalering i højere grad end Wnt9b ligand alene. Hele montere in situ analyse af E12.5 maver afslørede tre gener, Grem1
, NKX 2,5
, og GATA3
, der normalt udtrykkes i et tyndt bånd demarking den region, der bliver sphincter (n = 8, fig. 7). Ektopisk udtryk for Wnt9b
undertrykt BMP antagonist Grem1
transkriptionsfaktoren GATA3
i denne region, og disse gener blev yderligere nedreguleret, når β-catenin signalering blev øget. En dosisafhængig ekspansion blev observeret for transskriptionsfaktoren Nkx2.5
i begge mutanter. Gener, der udelukkende blev lokaliseret til tarmen ( villin
) eller formaven ( BMP4
) blev ikke ændret i enten mutant (data ikke vist). Øget kanonisk Wnt signalering i antrale maven og pylorus blev bekræftet ved isolering denne region og udføre kvantitativ PCR. De kanoniske Wnt target gener, der er opreguleret i den stabiliserede β-catenin allel, LEF1
og Axin2
blev også øget i pylorus region Six2
-cre tg /+, Wnt9b tg /+ dobbelt transgene [ LEF1
, 2,0 ± 0,25 og Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Tilsammen dosis-responsive genekspression ændringer observeret i pylorus region i Wnt9b
transgene og de stabiliserede β-catenin embryoer viser, at øget kanoniske Wnt signalering forstyrrer distal mave og pylorus lukkemuskel udvikling.}

diskussion

Disse resultater beskriver oprettelsen af ​​en ny musemodel, der betinget aktiverer kanoniske Wnt signalering. Wnt9b
transgen er induceres ved udsættelse for cre rekombinase og udtrykker GFP som en markør for induktion. Det bevarer også fuld biologisk aktivitet, da det kan redde Wnt9b ^{- /-
fænotyper i nyrerne. Disse mus er blevet opretholdt i vores koloni i over et år og fremkalde Wnt9b
udtryk ved avl til flere forskellige CRE stammer. Vi har udnyttet denne nye stamme at aktivere Wnt signalering i Six2
-positive celler og fundet skadelige virkninger i nyren og maven.}

I nyrerne Wnt9b udskilles fra ureteric bud epitel at inducere de tilstødende cap mesenkym progenitorceller at initiere differentiering. Til støtte for denne model, vores in vivo gain-of-funktion undersøgelser viser, at Wnt9b
opregulerer tidlige markører for renal vesikel differentiering såsom Wnt4
, FGF8
Pax8
. Men selv om nyre vesikel gener fremkaldt af den Wnt9b
transgen, vi ikke observere morfologiske tegn på øget eller ektopisk renal vesikel dannelse, som rapporteret for Six2
mutanter [9]. Foruden en Wnt induktiv signal, faktorer, der opretholder den renale progenitor pool (fx Six2
) også nedreguleret til fuldt ud at fremkalde renal vesikeldannelse. Six2
udtryk blev ikke ændret i vores Wnt9b
transgene og kan således forklare, hvorfor stigningen i Wnt9b ikke resulterede i ektopiske renale vesikler. Ektopisk induktion af renale vesikel markører induceres ved aktivering af β-catenin i Six2
-positiv metanephric mesenkym hjælp af stabiliserede β-catenin allel [4] derfor forskellen mellem disse to gain-of-function eksperimenter kan vedrøre hvilken grad de aktiverer kanonisk Wnt aktivitet. Desuden er det sandsynligt, at aktivering af kanoniske signalering ved Wnt9b i metanephric mesenchyme inducerer feedback inhibering, som bemærket i andre Wnt responsive væv og derved forhindre induktion af fuldstændig differentiering program [22]. De seneste data støtter denne idé for feedback hæmning siden Wnt9b /β-catenin signalering kræves ikke kun for differentiering af metanephric mesenchyme, men paradoksalt nok det samme signal er også påkrævet for vedligeholdelse eller udvidelse af den renale stamfader pool [7]. Vi spekulere, at den stabiliserede β-catenin, der handler nedstrøms i vejen, kan omgå disse reguleringsmekanismer. Disse muligheder kan afprøves med fremtidige undersøgelser ved, at sammenligne nedstrøms genaktivering i renale stamceller ved hjælp af Wnt9b
transgen og stabiliseret β-catenin gain-of-funktion mus.

Forstyrrelser i den kanoniske Wnt signalvej har vist sig at være vigtige i patogenesen af ​​renal cystisk sygdom (oversigt af Patel et al. [23]). Transgen ekspression af en stabiliseret β-catenin eller mangel på APC i renal tubulær epitel medfører renal cystisk sygdom, understøtter den konklusion, at ektopisk kanoniske Wnt signalering er tilstrækkelig til cystogenesis [18], [19]. Nyresvigt og cystisk dilatation i Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ dobbelt heterozygoter støtter yderligere den hypotese, at opreguleret kanoniske Wnt signalering forårsager cyster. Afbrydelse af ikke-kanoniske Wnt signalering (PCP) vej er også vigtigt i nyrecyste dannelse [24]. Således er det muligt, at cystedannelse i vores model er ikke blot skyldes aktivering af kanoniske signalering, men er et resultat af afbrydelse af den relative balance mellem kanoniske og ikke-kanoniske signalering. Til støtte for denne idé, generne, der er muteret i nedarvede former af cystisk sygdom ( pKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) lokalisere til cilia og disse organeller er for nylig blevet vist at være i stand til at regulere balancen mellem kanoniske og ikke-kanoniske Wnt signalering [25], [26].}

Der var en alvorlig nyre fænotype, selvom Wnt9b
mRNA-ekspression er forøget ca. 2 gange i vores transgen, hvilket indikerer, at relativt lavt niveau, vedvarende aktivering af denne pathway fører til renal dysfunktion. Dette niveau af opregulering af Wnt9b i ureteric opløbet med Hoxb7
-cre ikke producere cyster, tyder på, at cystogenesis i samlekanalerne i Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ double transgene er sandsynligvis en sekundær effekt af dilaterede rørformede segmenter (data ikke vist). Til støtte for dette, i post-natal dag 7-10 dyr, cystisk sygdom er tydelig i kun rørformede segmenter proksimale til indsamling kanalen. Svarende til polycystisk nyresygdom hos patienter, de transgene mus udviklede svær nyresvigt, selv om de fleste nefroner ikke udvikler cyster. Dette rejser spørgsmålet om, hvorvidt nyretubuli uden åbenlyse cyster er unormale og bidrage væsentligt til progressiv funktionsnedsættelse i disse lidelser. Nylige undersøgelser viser at voksne nyretubuli epiteler udtrykker Wnt9b, Frizzled receptorer og LRP5 /6 co-receptorer, der er i stand til at mediere kanonisk Wnt signalering som respons på akut iskæmisk beskadigelse [27]. I denne indstilling, Wnt signalering fremmer tubulus reparation og regeneration. Imidlertid har Wnt signaleringsaktivitet også været impliceret i at fremme renal fibrose efter beskadigelse, såsom i UUO modellen [28]. Samlet set har disse undersøgelser understreger vigtigheden af ​​at regulere Wnt signalering i den voksne nyre at balancere gavnlige reaktioner, såsom reparation /regeneration, og utilpasset reaktioner, der fører til fibrose og kronisk organsvigt.}

pylorus region af maven repræsenterer en kritisk grænse, der adskiller maven fra tarmen. Sphincter lukning når en fødevare bolus kommer ind i maven muliggør ordentlig fordøjelse før transit til tyndtarmen. Den molekylære basis for dannelsen af ​​denne diskrete region er ikke godt forstået, selvom nogle detaljer dukker. Disse resultater antyder, at en stram styring af Wnt-signalering er afgørende for udvikling af pylorus. Kanonisk Wnt aktivitet detekteres i fundus og legeme (corpus) men udelukket fra den distale mave og pylorus [13]. I Barx1
- /- mus, maven er lille, antrale-corpus grænse er sløret, og der er agenesi af pylorus lukkemuskel. Elegant væv rekombination undersøgelser tyder på, at disse fænotyper skyldes tab af ekspressionen af ​​Wnt-antagonister Sfrp1 og Sfrp2. Men da Barx1
mangel har globale virkninger på fortarm udvikling, var det ikke klart, om nedregulering af kanonisk Wnt aktivitet specielt kræves for dannelse af pylorus. Vores undersøgelser mere direkte testet denne mulighed ved at målrette ektopisk Wnt aktivitet til et begrænset område lige foran pylorus med Six2
-cre.

Vi fandt, at ektopisk Wnt aktivitet specifikt forstyrrer dannelsen af ​​pylorus lukkemuskel i mangel af globale defekter i maven udvikling. Således er nedregulering af kanonisk Wnt aktivitet kræves for at mønsteret pylorus region, der adskiller maven fra tarmen. Ektopisk ekspression af Wnt9b liganden og stabiliseret β-catenin i transgene mus kunne overvinde virkningerne af secernerede endogene Wnt antagonister Sfrp1 /2, i overensstemmelse med den af ​​Kim et al [13] model. Svarende til vores resultater, i Six2
mutanter der er reduceret ekspression af Nkx2.5
Gremlin
, gener, der er vigtige for pylorus sphincter udvikling i chick [14] , [29]. Dette antyder, at Six2
Wnt
regulere en fælles genetisk kaskade i den formodede pylorus lukkemuskel. Vi postulerer, at en vigtig funktion af Six2
kan være at fortolke kanoniske Wnt-signaler i forskellige udviklingsmæssige sammenhænge.

opreguleret kanoniske Wnt signalering har også vist sig at påvirke milt og bugspytkirtel udvikling [30]. Til støtte for denne, blev milt og bugspytkirtel hypoplasi også observeret i Six2
-cre, Wnt9b
bi-transgene mus (data ikke vist). Da Six2
-cre ikke udtrykkes i disse væv, dette tyder på, at signalerne fra den bageste mave mesenkym kan påvirke milt og bugspytkirtel under udvikling. Dette ville støtte den hypotese, at pyloric regionen kan fungere som arrangør for dannelsen af ​​disse accessoriske organer. Under udvikling, milt precursorceller transient forbinder med pyloric region, før deres vandring til venstre i maven, hvor de kondensere [31]. Selvom vi ikke opdage Six2
-cre udtryk i milten primordium eller mesothelium, vi kan ikke udelukke, at forbigående ekspression af Six2
-cre i disse regioner er ansvarlig for mangler i milten og bugspytkirtel . Fremtidige undersøgelser er nødvendige for direkte at teste disse muligheder.

Sammenfattende har vi udviklet en ny mus model, der giver mulighed for tidsmæssig og rumlig udtryk for Wnt9b. I udviklingslandene nyrerne, kan transgene Wnt9b
fremkalde tidligt MET genekspression i Six2
-positive renale stamfædre, men det er ikke tilstrækkeligt til at aktivere den fulde differentiering programmet. Vedvarende udtryk for Wnt9b i Six2
-positive celler fører til nyre cyster og alvorlig organsvigt. I maven, ektopisk Wnt β-catenin-aktivitet i pylorus region ændrer sphincter dannelse og distale mave mønsterdannelse. Tilsammen udgør disse resultater understreger betydningen af ​​en stram styring af Wnt aktivitet og foreslå, at Six2 og β-catenin er involveret i orgel mønster i forskellige sammenhænge.

Materialer og metoder

Etik erklæring

de dyreforsøg blev godkendt af pasning af dyr og brug udvalg af Saint Louis University (protokol 1460) og St. Louis VA (protokol 0305). Alle procedurer, der involverer dyr var i overensstemmelse med de institutionelle dyrevelfærd forskrifter, standarder og politikker.

Mus

Wnt9b
transgene mus blev krydset til hver af tre forskellige CRE linjer [32 ]. 1) β-actin- CRE blev anvendt til at udtrykke Wnt9b ubikvitært (figur 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre:. EGFP blev anvendt til at overudtrykke Wnt9b i dets endogene placering i nyren, det ureteric knop (fig 2, [34].), og 3) BAC Six2
-cre: EGFP transgen blev anvendt til at udtrykke Wnt9b eksogent i maven og nyrerne (figur 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• PLoS ONE: Kødædende Bats Digest chitin i maven anvendelse af sure Mammalian chitinase-
• PLoS ONE: Integration maveindhold og stabile isotoper Analyser at kvantificere kost af Pygoscelid Penguins