PLoS ONE: Betinget uttrykk for Wnt9b i Six2-positive celler forstyrrer magen og nyrefunksjon

Abstract

I løpet av nyre utvikling, aktiverer kanoniske Wnt signal differensiering, mens transkripsjonsfaktor Six2 opprettholder stamcellepoolen. Disse motstridende signaler bidrar til å regulere nephron dannelse og sikre full bemanning av nephrons dannes. Siden disse to faktorene kontrollere ulike skjebner i nyre mesenchyme, hypotese vi at overekspresjon av Wnt9b
i Six2
-expressing celler ville forstyrre nyre dannelse og kan endre celle differensiering beslutninger i andre vev. Vi skapte en transgen mus som betinget uttrykte kanoniske Wnt ligand i utviklings nyre, Wnt9b
. Transgenet blir aktivert ved ere rekombinase og uttrykker GFP. Vi testet først sin biologiske aktivitet ved hjelp av Hoxb7-ere Hotell og funnet at transgene Wnt9b var i stand til å indusere differensiering gener og redde nyre utvikling i Wnt9b ^{- /-
homozygot mangelfull mus. I kontrast, uttrykk for Wnt9b
i celler ved hjelp av Six2-ere
forårsaket gastrointestinale plager og alvorlig nyresvikt hos voksne mus. Transgene nyrer hadde mange cystisk tubuli og forhøyet kreatinin verdier (0,652 ± 0,044) sammenlignet med villtype mus (0,119 ± 0,002). Disse dyrene også utstilt en misformet pylorusstenose sphincter, duodenogastric reflux, og en transformasjon av den fjerne magen i proksimale skjebne. De genuttrykk endringene som er observert for Wnt9b: EGFP
transgenet ble sammenlignet med en stabilisert β-catenin allelet for å fastslå at Wnt9b aktiverer den kanoniske Wnt veien i vev analysert. Disse resultatene viser at uttrykk for Wnt9b
i Six2
-positive celler forstyrrer celle skjebne beslutninger i nyre og mage-tarmkanalen}

Citation. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) betinget uttrykk for Wnt9b i Six2
-positive Cells forstyrrer magen og nyrefunksjon. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10,1371 /journal.pone.0043098

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

mottatt: 29 februar 2012; Godkjent: 17 juli 2012; Publisert: 17 august 2012

Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend R01 DK067222 (http://nih.gov/) og American Heart Association Etablert Investigator 0840117N (http://www.heart.org) til MR. SK ble støttet av en Saint Louis University Presidential Research Fund Award (www.slu.edu). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Den kanoniske Wnt signalveien er en viktig regulator av celle skjebne, celleproliferasjon og celle adhesjon under utvikling og gjennom hele voksenlivet. Mange positive og negative mediatorer har blitt identifisert som arbeider sammen for å oppnå stram regulering av β-catenin signalering. Den sentrale paradigme er at cytoplasmisk β-catenin blir sekvestrert i en ødeleggelse kompleks, fosforylert av GSK3P, og målrettet til ubiquitin ødeleggelse bane i fravær av en Wnt signal. Wnt binding hemmer fosforylering og destruksjon av β-catenin, slik at det å translocate til kjernen til å påvirke målrette genekspresjon med TCF /LSF faktorer (gjennomgått av MacDonald et al. [1]). Mange musemodeller har blitt opprettet for å studere denne banen, herunder både gevinst og tap av funksjon alleler av Wnts, Wnt reseptorene, β-catenin, og TCF /LSF transcriptional regulatorer. Disse modellene har avdekket viktige roller for kanoniske Wnt signal i bein, hår, tarm, blod og kreft [2]. En begynnende type fra disse studiene er at mange biologiske prosesser er akutt følsomme for styrken av kanoniske Wnt signaliseringen.

Denne tette regulering av kanonisk Wnt signalering er avgjørende for utvikling nyre. Under den innledende fasen av nyre formasjon, er Wnt9b skilles fra ureter knopp og signaler til stamceller i hatten mesenchyme å indusere nephron differensiering. Behandling med litiumklorid eller aktivering av β-catenin kan indusere nevronet differensiering i fravær av ureter knoppen og Wnt9b, noe som tyder på at en økning i kanonisk Wnt signalering er tilstrekkelig for dette induktive aktivitet [3], [4]. Noen hetten mesenkymceller proliferere for å opprettholde stamceller som er nødvendig for påfølgende gjentagelser av denne prosess [5]. Denne balansen mellom stamfar vedlikehold og induksjon av differensiering er av største betydning for å sikre at nyrene danner omfattende tilbud av nephrons [5], [6], [7], [8], [9].

Flere faktorer uttrykt i lokket mesenchyme har vist seg å antagonisere Wnt-stimulert differensiering, inkludert transkripsjonsfaktor Six2
. Sletting av Six2
resultater i ektopisk differensiering, uttømming av hetten mesenchyme stamfedre, og nyre agenesis [9]. Selv om den eksakte mekanismen ennå ikke er kjent, har en hypotese er foreslått der høye nivåer av kanonisk Wnt signal drive satsing på differensiering, mens høy Six2 aktivitet i de samme cellene opprett stamfar skjebne [7]. Vi har opprettet en ny musemodell til betinget overuttrykker Wnt9b å aktivere den kanoniske Wnt signalveien. Vi har brukt denne modellen for å teste om økt Wnt9b aktiviteten er tilstrekkelig til å forstyrre balansen mellom stamfedre og differensiering i hetten mesenchyme.

Et annet område der både Six2 aktivitet og Wnt signale spille en viktig rolle er pyloric sphincter . Den pyloriske ringmuskelen er dannet ved den distale ende av magen og fungerer som en ventil for å muliggjøre riktig fordøyelse av mat før sin inntreden i tolvfingertarmen. Dysfunksjon av sphincter kan resultere i tilbakeløps av duodenale innholdet i magesekken noe som utgjør en øket risiko for magekreft metaplasi og [10], [11]. Denne regionen er også stedet for medfødte misdannelser, inkludert den sjeldne lidelsen primære duodenogastric reflux og mer vanlig fødsel defekt pylorusstenose [12]. Six2
mangel fører til agenesis av pyloric sphincter og motvirke Wnt aktivitet med Sfrp1 og Sfrp2 er nødvendig for å mønster magen [13], [14]. Dette førte oss til hypoteser som kanoniske Wnt aktivitet må være strengt regulert i pylorus som ligner på det som har blitt foreslått i nyrene. For å teste dette har vi brukt Six2
-cre å aktivere Wnt9b
transgenet i Six2
uttrykke domener i nyrene og magen.

Den betingede Wnt9b
transgen allelet rapporteres her uttrykker Wnt9b Hotell og GFP når den aktiveres av ere rekombinase. Det er biologisk aktive og kan redde nyre formasjonen i Wnt9b ^{- /-
embryoer. Overekspresjon av Wnt9b
i nyrene ureter knopp er istand til å indusere gener assosiert med differensiering av hetten mesenchyme, men gjennomgår mesenchymale-til-epitelial overgang (MET) for å frembringe morfologisk distinkte vesikkel strukturer. Wnt9b
transgen aktivering i Six2
-positive celler forårsaker nyre cyster og en transformasjon av de ytre mage regionene i proksimale magen skjebne. Sammenligning av Wnt9b
transgene til et allel som produserer stabilisert β-catenin protein demonstrerer dose responsive genet endringer og antyder at disse stammene representerer en allel-serien som skal være verdifull for modulerende kanoniske Wnt signal i andre vev.}

Resultater

trans~~POS=TRUNC mus uttrykke Wnt9b når den aktiveres av ere rekombinase

Wnt9b transgenet ble konstruert med en lox-STOP kassett [15] for å opprette en betinget aktiv Wnt9b som er avhengig av cre rekombinase for ekspresjon (fig. 1A). Når aktivert, transgenet uttrykt Wnt9b skiller seg fra endogent Wnt9b fordi den inneholder en C-terminal influensa hemagglutinin epitop tag og transgene celler vil stille GFP fluorescens på grunn av IRES-EGFP kassett. For å teste fidelity av transgenet, undersøkte vi cre avhengig uttrykk i dyrkede celler og in vivo i embryoer (Fig. 1B). Epitop-tagget Wnt9b kunne påvises i lysater av celler ko-transfektert med transgenet og en cre plasmid, og ikke i transfeksjoner av transgenet alene. Tilsvarende lysatene fra embryoer som var positive for både Wnt9b og β-aktin-Cre transgener inneholdt Wnt9b-FLU mens enkelt Wnt9b transgene ikke. GFP fluorescens ble observert i Wnt9b /β-aktin-CRE doble positive embryoer og ikke i Wnt9b kullsøsken (Fig. 1C-F). Uttrykket nivået av transgen Wnt9b korrelert med intensiteten av GFP fluorescens for hver grunnlegger linje. (Fig. 1D). Fire uavhengige grunnlegger linjene var ikke i stand til å produsere levende β-actin-ere ^{tg /+, Wnt9b TG /+ dobbel heterozygot unger, viser at stedsnærværende forhøyet Wnt9b uttrykk er embryonale dødelig. Analyse av embryonale stadier avslørte at β-aktin-ere tg /+, Wnt9b TG /+ doble heterozygote embryoer ble oppdaget, mindre enn forventet mendelsk frekvenser ved E11-E12. En enkelt dobbel heterozygot embryo ble observert fra en grunnlegger med meget høy ekspresjon (Fig. 1 A, n = 23, forventet frekvens 25%) og 16% ble observert fra en annen grunnleggerne (n = 25). Wnt9b /ß-aktin-Cre doble transgene embryoer hadde mindre hjerter med pooling av blod, noe som tyder på hjertesvikt som dødsårsak.}

Transgene Wnt9b er biologisk aktiv

For å finne ut om transgen Wnt9b er biologisk aktive, vi testet om det var i stand til å erstatte villtype Wnt9b
under nyre utvikling. Wnt9b <sup>- /-
embryoer utviser høy pene ganespalte og nyre agenesis fenotyper (fig 2).. Aktivering av transgene Wnt9b i ureter knopp med Hoxb7
-cre reddet nyre formasjon, men ikke gane ping E14.5 i alt Hoxb7
-cre tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b tg /+ embryoer (n = 7). Dette nyre-spesifikk redning bekrefter at transgen Wnt9b uttrykk er avhengig av cre aktivering, fordi ganen ikke uttrykke Hoxb7
-cre. Kvantitativ PCR av villtype, Wnt9b - /- Hotell og Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ transgene nyrer avdekket at transgene Wnt9b
ble uttrykt ved 2.3- ganger høyere nivåer enn villtype-genet, mens uttrykk for Ret
var uendret (fig. 2 G-i). Muligheten av transgen Wnt9b å signalisere til mesenchyme å erstatte villtype Wnt9b
aktivitet bekrefter at det er biologisk aktiv in vivo.</sup>

Et vell av data har vist at Wnt9b og β-catenin signale er kritiske induktive signaler som initierer differensiering av hetten mesenchyme inn epithelialized nyre vesikler [4], [8], [16]. Wnt9b produsert i ureter knopp aktiverer kanoniske Wnt signalveien i tilstøtende mesenchyme og resultater i uttrykket av gener som regulerer mesenchymale til epitel overgang (MET). Derfor testet vi om overekspresjon av Wnt9b
i ureter knopp ville signal til mesenchyme å aktivere MET genekspresjon og for å fremme økt induksjon av nephrons. Wnt9b
ble overuttrykt i ureter bud ved hjelp av Hoxb7
-cre: EGFP. E12.5 embryoer ble genotypet ved kvantitativ PCR-analyse for å fastslå om de var hemizygous eller homozygot for Wnt9b
transgen og nyrene ble samlet inn for analyse av genuttrykk. Vi oppdaget en doseavhengig økning i Wnt9b Hotell som ble ledsaget av en proporsjonal aktivering av uttrykk for de Wnt9b målgener, Wnt4
, Pax8
, og Fgf8
i tre uavhengige dammer av transgene nyrer (fig. 2J). Six2
er uttrykt i udifferensiert (cap) mesenchyme og er nedregulert som vesikkel differensiering følger [17]. Six2
mRNA uttrykk er upåvirket i Hoxb7
-cre, Wnt9b
doble transgene. Tilsvarende ureter bud gener, Ret Hotell og Wnt11
, er ikke vesentlig endret ved overekspresjon av Wnt9b
. Den spesifikke oppregulering av gener i mesenchyme bekrefter at transgene Wnt9b er i stand til å signalisering fra den ureteric knoppen å indusere gener som er viktige for MET imidlertid ingen histologiske tegn på ektopiske epithelialized renale vesikler var tydelig (data ikke vist). Dette tyder på at oppregulering av Wnt9b
i ureter bud er tilstrekkelig for genaktivering i mesenchyme, men ikke for morfologisk differensiering av nyre vesikler.

Misexpression av Wnt9b forstyrrer nyrefunksjon og pylorusstenose sphincter dannelse ved å aktivere kanonisk β-catenin signale

paradigmet dukker opp i nyrene er at det er en hårfin balanse mellom stamfar selvfornyelse og aktivering av differensiering [6], [7], [9]. Den Wnt9b /β-catenin pathway er nødvendig for differensiering og Six2 undertrykker differensiering på første trinn av forpliktelse. Derfor hypotese vi at evnen til Six2 å fremme skjebne beslutninger motsatt fra de som aktiveres av høy β-catenin aktivitet kan være et felles tema i utvikling. Vi testet denne muligheten ved aktivering av transgene Wnt9b
med Six2
-cre. Den doble transgene uttrykker Wnt9b
i de samme cellene som uttrykker Six2 Hotell og kan forstyrre prosessene som coordinately regulert i nyrene og andre vev. Six2-ere ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
mus utstilt nød på avvenning og kroppsvekt målinger ble redusert med 39% på fire uker (14,5 ± 3,4 gram, p < 0,001) sammenlignet med cre-negative Wnt9b tg /+
kullsøsken (23,6 ± 0,7 gram). Fenotypeanalyser avdekket at denne reduksjonen i kroppsvekt skyldtes misdannelser i mage-systemet og nyrene, to områder av Six2
-cre uttrykk (Fig. 3).}

Mange cyster av varierende størrelser var synlig i cortex og medulla av dobbelt heterozygot nyrene (fig. 4, n = 11/11). Cyster ble hovedsaklig ligger i cortex og medulla ytre og var av proksimale tubuli opprinnelse som demonstrert ved LTL-farging. Den cystisk sykdom ble først tydelig kort tid etter fødselen (P7-10) i de proksimale deler av nevronet (data ikke vist). Disse doble heterozygote dyr utstilt forhøyede serumkreatininnivåer i (0,652 ± 0,044, p < 0,005) sammenlignet med kontroll kullsøsken (0,119 ± 0,002) så tidlig som ~3 ukers alder, som indikerer alvorlig nyresvikt. Eldre dyr med avansert sykdom også inneholdt cyster som stammer fra flere distale segmenter inkludert løkken av Henle (Tamm-Horsfall-positive). I alle dyr med avansert nyresvikt undersøkt, observerte vi mange samlekanal-avledet cyster som uttrykte aquaporin to eller bundet D. Biflorus
-lectin. Siden Six2
-cre ikke er uttrykt i samlekanal, er dette utvidelse trolig sekundært til utvidelse i mer proksimale segmenter. Tilstedeværelsen av nyre cyster i Wnt9b
transgene dyr styrker konklusjonen om at forstyrrelse av Wnt signalsystemet forårsaker cystisk sykdom [7], [18], [19].

Selv om nyrecyster var ikke tilstede før etter fødselen, oppregulering av kanoniske Wnt signal var tydelig på E12.5 når Six2
-cre er i utgangspunktet uttrykt. Lef1 proteinekspresjon ble øket i pre-rørformede aggregater og nyre vesikkel strukturer i de doble transgene og ble ytterligere øket i de mange ektopisk vesiklene er dannet i stabiliserte p-catenin nyrer (N = 3, fig. 5). Dosen-responsive økning i Lef1 uttrykk støtter publisert data som Wnt9b handler om den kanoniske Wnt signalveien i utviklings nyre [7]. Mangelen på ektopisk vesikkel strukturer i Wnt9b
transgene tyder på at Wnt9b
allelet viser en moderat effekt på β-catenin signal i forhold til den stabiliserte β-catenin allel.

Den andre fenotype bidra til redusert kroppsvekt i Six2-ere ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
doble heterozygoter var mavesmerter. Gul fostervann ble observert i magen av doble transgene og ikke i enkle transgene kullsøsken (n = 6, fig. 6). Dette indikerte at duodenogastric reflux var oppstått og kan skyldes unormal pylorusstenose sphincter formasjon. Sphincter mellom magesekken og tolvfingertarmen ble forlenget og utvidet i den doble transgene (fig. 6, innfelt). Den TGFfi antagonist, Nephrocan, som normalt uttrykkes i et meget begrenset mønster ved E16.5, ble utvidet i doble transgene, noe som tyder på at lukkemuskelen regionen ikke ble riktig begrenset. Denne langstrakte morfologi ble støttet ved immunhistokjemisk farging av glatt muskulatur lag som danner den tette muskulære veggen rundt pylorus (fig. 6 E, F). I enkelte transgene kontrollene ble det tykkeste muskulaturen funnet der vevet viser den mest innsnevring på lukkemuskelen (linje). I de doble transgene, ble tykk muscularity observert, men denne regionen ble forskjøvet fra området som var den mest innsnevret.}

Mis-mønstrings defekter ble også observert ved å analysere spesifikke markører som skiller mellom den proksimale (H ^{+ /K + ATPase) og den distale (Alcian blått) region av magen. Den proksimale magen (corpus) inneholder H + /K + ATPase-uttrykke parietalceller som er utelukket fra antrum-pylorus regionen. Omvendt, inneholder antrum-pylorus mukosaceller som flekker med Alcian blå som ikke finnes i det proksimale området [20]. Den doble transgene viste vedvarende H + /K + ATPase flekker og fravær av Alcian blått-positive slimhinner i antral mage-pylorus som indikerer at den distale regionen er mis-mønstret for å proksimale skjebnen av Wnt9b
uttrykk. Alcian blå farging av slimceller i tarmen var intakt i både enkle og doble transgene fordi Six2
-cre er ikke uttrykt i tolvfingertarmen. Dette mis-mønster antyder at, i likhet med den paradigme i nyrene, angir kanonisk β-catenin signale en skjebne, forestomach region, og Six2 aktivitet mønstre den distale identitet. Dette støttes av ekspresjonskarakteristikkene domenene til disse genene ettersom en kanonisk Wnt signal reporter oppviser høy aktivitet bare i forestomach, og Six2
er begrenset til den distale magen og pylorus [13], [14].}

Hvis kanoniske Wnt signal er ansvarlig for gastroduodenal reflux i Six2-Cre ^{TG /+
, Wnt9b TG /+
doble transgene, deretter misdannelser observert bør rekapitulert i en musemodell som uttrykker en stabilisert β-catenin i samme domene ( Ctnnb1 EX3 /+
, [21]). Etter cre aktivering, forhindrer dette allel den proteolytiske nedbrytning av β-catenin og ville forventes å heve kanoniske Wnt signalering til en høyere grad enn Wnt9b ligand alene. Hele mount in situ analyse av E12.5 mager avdekket tre gener, Grem1
, Nkx 2,5
, og Gata3
, som vanligvis uttrykkes i en tynn bånd demarking region som skal bli sphincter (n = 8, fig. 7). Ektopisk uttrykk for Wnt9b
trykkes BMP antagonist Grem1 Hotell og transkripsjonsfaktoren Gata3
i denne regionen, og disse genene ble ytterligere nedregulert når β-catenin signal ble økt. En doseavhengig utvidelse ble observert for transkripsjonsfaktoren Nkx2.5
i begge mutanter. Gener som ble lokalisert utelukkende til tarmen ( villin
) eller til forestomach ( Bmp4
) ble ikke endret i enten mutant (data ikke vist). Økt kanonisk Wnt signalering i antral magen og pylorus ble bekreftet ved isolering av denne regionen og utføre kvantitativ PCR. De kanoniske Wnt målgener som er oppregulert i den stabiliserte β-catenin allelet, Lef1 Hotell og Axin2
, ble også økt i magesekken av Six2
-cre tg /+, Wnt9b TG /+ doble transgene [ Lef1
, 2,0 ± 0,25 og Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Sammen doserespons genekspresjon endringene som er observert i sekken i Wnt9b
transgene og de stabiliserte β-catenin embryoer demonstrere at økt kanoniske Wnt signal forstyrrer distal magen og pylorusstenose sphincter utvikling.}

diskusjon

Disse resultatene beskriver opprettelsen av en ny mus modell som betinget aktiverer kanoniske Wnt signalering. Wnt9b
transgenet er induserbar ved eksponering for ere rekombinase og uttrykker GFP som en markør for induksjon. Den beholder også full biologisk aktivitet siden det kan redde Wnt9b ^{- /-
fenotyper i nyrene. Disse mus har blitt opprettholdt i vår koloni i over et år og indusere Wnt9b
uttrykk på avl til flere forskjellige Cre stammer. Vi har benyttet denne romanen belastning å aktivere Wnt signal i Six2
-positive celler og funnet skadelige effekter i nyrene og magen.}

I nyrene, Wnt9b utskilles fra ureter bud epitel for å indusere de tilstøtende lokk mesenchyme forløperceller for å initiere differensiering. Til støtte for denne modellen, vår in vivo gain-of-funksjon studier viser at Wnt9b
oppregulerer tidlige markører for renal vesikkel differensiering som Wnt4
, Fgf8 Hotell og Pax8
. Men selv om nyre vesikkel gener indusert av Wnt9b
transgen vi ikke observere morfologiske tegn på økt eller ektopisk nedsatt vesikkeldannelse, som rapportert for Six2
mutanter [9]. I tillegg til en Wnt induktiv signal, faktorer som opprettholder nedsatt stamcellepoolen (f.eks Six2
) må også være nedregulert til fullt lokke fram nedsatt vesikkel formasjon. Six2
uttrykk ble ikke endret i vår Wnt9b
transgen og kan dermed forklare hvorfor økningen i Wnt9b ikke resulterte i ektopisk nyre blemmer. Ektopisk induksjon av nyre vesikkel markører induseres ved aktivering av β-catenin in Six2
-positivt metanephric mesenchyme ved hjelp av den stabiliserte β-catenin allelet [4] er derfor differansen mellom disse to gain-of-funksjon eksperimenter kan være knyttet til i hvilken grad de aktiverer kanonisk Wnt aktivitet. I tillegg er det sannsynlig at aktivering av kanonisk signalering ved Wnt9b i metanephric mesenchyme induserer feedback-inhibering, som nevnt i andre wnt responsive vev, for derved å hindre induksjon av hele differensieringsprogram [22]. Nyere data støtter denne ideen for tilbakemelding inhibering siden Wnt9b /β-catenin signalering er nødvendig ikke bare for differensiering av metanephric mesenchyme, men paradoksalt nok den samme signal er også nødvendig for vedlikehold eller utvidelse av nyrenes stamcellepoolen [7]. Vi spekulerer i at den stabiliserte β-catenin, som handler nedstrøms i veien, kan omgå disse reguleringsmekanismer. Disse mulighetene kan bli testet i fremtidige studier i at sammenligne nedstrøms genet aktivering i nyre stamceller ved hjelp av Wnt9b
transgen og stabilisert β-catenin gain-of-funksjon mus.

forstyrrelser i den kanoniske Wnt signalveien er blitt vist å være viktige i patogenesen av renal cystisk sykdom (gjennomgått av Patel et al. [23]). Transgen uttrykk for en stabilisert β-catenin eller mangel av APC i tubulær epitel fører til nedsatt cystisk sykdom, støtter konklusjonen om at ektopisk kanoniske Wnt signal er tilstrekkelig for cystogenesis [18], [19]. Nyresvikt og cystisk utvidelse i Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b TG /+ doble heterozygoter støtter videre hypotesen om at oppregulert kanoniske Wnt signal forårsaker cyster. Forstyrrelse av ikke-kanonisk Wnt signalering (PCP) veien er også viktig i renal cyste formasjon [24]. Således er det mulig at cyste dannelse i vår modell er ikke bare på grunn av aktivering av kanoniske signalering, men er et resultat av forstyrrelse av den relative balanse mellom kanonisk og ikke-kanonisk signalering. Til støtte for denne ideen, de gener som er mutert i arvede former av cystisk sykdom ( PKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) lokalisere til cilia og disse organeller har nylig blitt vist å være i stand til å regulere balansen mellom kanoniske og ikke-kanonisk Wnt signalering [25], [26].}

det var en alvorlig nyre fenotype selv om Wnt9b
mRNA-ekspresjon økes ~ 2-fold i vår transgenet, noe som indikerer at forholdsvis lavt nivå, vedvarende aktivering av denne vei fører til nyredysfunksjon. Dette nivået av oppregulering av Wnt9b i ureter bud ved hjelp av Hoxb7
-cre ikke produsere cyster, noe som tyder på at cystogenesis i innsamling kanaler i Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ doble transgene er sannsynligvis en sekundær effekt av utvidede rørformede segmenter (data ikke vist). Til støtte for dette i post-natal dag 7-10 dyr, er cystisk sykdom tydelig i bare rørformede segmenter proksimale til samlekanal. I likhet med polycystisk nyresykdom hos pasienter, de transgene mus utviklet alvorlig nyresvikt, selv om de fleste nephrons ikke utvikler cyster. Dette reiser spørsmålet om nyretubuli uten åpenlys cyster er unormal og bidra vesentlig til progressiv funksjonsnedsettelse i disse lidelsene. Nyere studier viser at voksne nyretubuli epitel uttrykke Wnt9b, frizzled reseptorer og LRP5 /6 co-reseptorer som er i stand til å mediere kanoniske Wnt signalering som respons på akutt iskemisk skade [27]. I denne innstillingen, fremmer Wnt signal tubule reparasjon og regenerering. Imidlertid har Wnt signale aktivitet har også vært implisert i å fremme renal fibrose etter skade, så som i UUO modellen [28]. Samlet disse studiene fremheve viktigheten av å regulere Wnt signal i voksen nyre for å balansere gunstige reaksjoner, slik som reparasjon /regenerering og maladaptive reaksjoner som fører til fibrose og kronisk organdysfunksjon.}

sekken i magen representerer en kritisk grense som skiller magen fra tarmen. Sphincter lukking når en bolus mat kommer inn i magen muliggjør riktig fordøyelse før transporten til tynntarmen. Det molekylære grunnlaget for dannelsen av denne diskret regionen er ikke godt forstått, men noen detaljer dukker opp. Disse resultater antyder at streng kontroll av Wnt signalering er avgjørende for utvikling av pylorus. Canonical Wnt aktivitet blir oppdaget i fundus og kropp (corpus), men ekskludert fra den distale magen og pylorus [13]. I Barx1 Z - /- mus, er magen liten, antrum-korpuset grensen er uklart, og det er agenesis av pyloric sphincter. Elegant vev rekombinasjon studier tyder på at disse fenotyper følge av tap av uttrykk for Wnt antagonister Sfrp1 og Sfrp2. Men siden Barx1
mangel har globale effekter på forutgående utvikling, var det ikke klart om nedregulering av kanoniske Wnt aktivitet er spesielt nødvendig for dannelsen av pylorus. Våre studier mer direkte testet denne muligheten ved å målrette ektopisk Wnt aktivitet til et begrenset område bare anterior til pylorus med Six2
-cre.

Vi fant at ektopisk Wnt aktivitet spesifikt forstyrrer dannelsen av pyloric lukkemuskelen i fravær av globale defekter i magen utvikling. Således blir nedregulering av kanoniske Wnt aktivitet er nødvendig for å påføre mønster på sekken som skiller mage fra tarmen. Ektopisk uttrykk for Wnt9b ligand og stabilisert β-catenin i transgene mus kunne overvinne virkningene av utskilte endogene Wnt antagonister Sfrp1 /2, i samsvar med modellen foreslått av Kim et al [13]. I likhet med våre resultater, i Six2
mutanter det er redusert uttrykk for Nkx2.5 Hotell og Gremlin
, gener som er viktige for pylorusstenose sphincter utvikling i dama [14] , [29]. Dette tyder på at Six2 Hotell og Wnt
regulere en felles genetisk kaskade i presumptive pyloric sphincter. Vi postulere at en viktig funksjon av Six2
kan være å tolke kanoniske Wnt signaler i ulike utviklings sammenhenger.

oppregulert kanoniske Wnt signal har også vist seg å påvirke milt og bukspyttkjertel utvikling [30]. Til støtte for dette, milt og bukspyttkjertel hypoplasi ble også observert i Six2
-cre, Wnt9b
bi-transgene mus (data ikke vist). Siden Six2
-cre ikke er uttrykt i disse vev, tyder dette på at signalene fra den bakre magen mesenchyme kan påvirke milt og bukspyttkjertel under utvikling. Dette ville støtte hypotesen om at magesekken kan fungere som en organisator for dannelsen av disse tilbehørs organer. Under utviklingen milt forløperceller transient forbinder med sekken, før deres migrering til venstre i magen hvor de kondenserer [31]. Selv om vi ikke oppdager Six2
-cre uttrykk i milten primordium eller mesothelium, vi kan ikke utelukke at forbigående uttrykk for Six2
-cre i disse regionene er ansvarlig for mangler i milten og bukspyttkjertelen . Fremtidige studier er nødvendig for å direkte teste disse mulighetene.

I sammendraget, har vi utviklet en ny musemodell som gjør det mulig for tidsmessig og romlig uttrykk for Wnt9b. I utviklings nyre, kan transgene Wnt9b
indusere tidlig MET genuttrykk i Six2
-positive nyrestamfedre, men det er ikke tilstrekkelig for å aktivere full differensiering programmet. Vedvarende uttrykk for Wnt9b i Six2
-positive celler fører til nyre cyster og alvorlig organsvikt. I magesekken, ektopisk Wnt β-catenin aktivitet i magesekken endrer sphincter dannelse og distale mage mønster. Sammen utgjør disse funnene fremheve viktigheten av streng kontroll av Wnt aktivitet og foreslår at Six2 og β-catenin er involvert i organ mønster i ulike sammenhenger.

Materialer og metoder

Etikk uttalelse

de dyrestudier ble godkjent av dyr omsorg og bruk komité av Saint Louis University (protokoll 1460) og St. Louis VA (protokoll 0305). Alle prosedyrer som involverer dyr var i samsvar med institusjonelle dyrevelferd forskrifter, standarder og retningslinjer.

Mus

Wnt9b
gene mus ble krysset til hver av tre forskjellige Cre linjer [32 ]. 1) β-actin- cre ble brukt til å uttrykke Wnt9b overalt (fig 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre. EGFP ble brukt til å overuttrykker Wnt9b i sin endogene beliggenhet i nyre, den ureter knopp (figur 2, [34].), og 3) den BAC Six2
-cre: EGFP transgenet ble brukt for å uttrykke Wnt9b eksogent i magen og nyre (figur 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• PLoS ONE: insectivorous Flaggermus Digest Chitin i magen Bruke Surt pattedyr Chitinase
• PLoS ONE: Integrering mageinnhold og stabile isotoper Analyser å kvantifisere dietter av Pygoscelid Penguins