Ploche ONE: Podmienené Expresia Wnt9b v Six2-pozitívnych buniek narušuje žalúdka a obličiek Function

abstraktné

Počas vývoja obličiek, kanonické Wnt signalizácie aktivuje diferenciáciu, zatiaľ čo transkripčný faktor Six2 udržuje predok bazén. Tieto protichodné signály pomáhajú regulovať tvorbu nefrónov a zaistí sa tvoria plný počet nefrónov. Vzhľadom k tomu, tieto dva faktory kontrolovať rozdielne osudy v obličkách mesenchyme, my sme predpokladali, že nadmerná expresia Wnt9b
v Six2
Epidermal Growth Factor bunky by narušiť tvorbu obličiek a môže sa meniť rozhodnutie diferenciácie buniek v iných tkanivách. Vytvorili sme transgénnej myš, ktorá podmienečne vyjadril kánonickú Wnt ligand v rozvojovom obličky, Wnt9b
. Transgén sa aktivuje Cre rekombinázy a vyjadruje GFP. Prvý sme testovali svoju biologickú aktivitu pomocou Hoxb7-CRE stroje a zistil, že transgénne Wnt9b bolo schopné indukovať diferenciácie génov a záchranu vývoj obličiek v Wnt9b ^{- /-
homozygotnou deficitných myší. Naproti tomu výraz Wnt9b
v bunkách pomocou Six2-CRE
spôsobila zažívacieho traktu a ťažkým zlyhaním obličiek u dospelých myší. Transgénnej obličky mal početné cystickej kanáliky a zvýšená hladina kreatinínu (0,652 ± 0,044) v porovnaní s divokým typom myší (predstavujú 0,119 ± 0,002). Tieto zvieratá tiež vykazoval chybne pyloru zvierača, duodenogastrický refluxu a transformáciu distálnej žalúdka do bližšom osudu. Génovej expresie pozorované zmeny za Wnt9b: EGFP
transgén boli porovnané s stabilizovaného β-katenin alely určiť, že Wnt9b je aktivácia kanonickej Wnt dráhu v analyzovaných tkanivách. Tieto výsledky ukazujú, že expresia Wnt9b
v Six2
-pozitívne buniek sa naruší bunková osud rozhodnutie v obličkách a tráviaceho traktu}

Citácia :. Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) Podmienené Expresia Wnt9b v Six2
-pozitívne bunky narúša žalúdok a funkcie obličiek. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10,1371 /journal.pone.0043098

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japonsko

prijatá: 29. februára 2012; Prijaté: 17.července 2012; Uverejnené: 17.augusta 2012

Toto je článok o otvorený prístup, bez všetky autorské práva, a môže byť voľne reprodukovať, distribuovať, prenášať, úprave, postavený na, alebo inak používať ktokoľvek, pre akýkoľvek zákonný účel. Práca je sprístupnený v rámci public domain venovanie Creative Commons CC0

Financovanie :. Táto práca bola podporená National Institutes of Health grantu R01 DK067222 (http://nih.gov/) a American Heart Association Established vyšetrovateľ 0840117N (http://www.heart.org) na MR. SK bol podporený Award Saint Louis University Prezidentské Research Fund (www.slu.edu). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

kanonické Wnt signalizácie je kľúčovým regulátorom bunkového osudu, bunkovej proliferácie a bunkovej adhézie počas vývoja a v dospelosti. Početné pozitívne a negatívne mediátorov boli identifikované, ktoré pracujú spoločne, aby bolo dosiahnuté tesnou reguláciu β-katenin. Centrálne paradigma je, že cytoplazmatický β-katenin je izolovaný v zničení komplexu, fosforylované GSK3ÍJ a zamerané na ničenie ubikvitinové dráhy v neprítomnosti signálu Wnt. Wnt väzba zabraňuje fosforyláciu a deštrukcie beta-kateninu, ktoré mu umožnia translokáciu do jadra, aby vplyv expresia cieľového génu TCF /LEF faktorov (prehľad MacDonald et al. [1]). Početné myšou modely boli vytvorené, aby túto cestu, vrátane oboch zisku a straty funkčných alel Wnts, Wnt receptorov, beta-kateninu a TCF /LEF transkripčný regulátory. Tieto modely odhalili základné úlohy, kanonické Wnt signalizácie v kosti, vlasy, črevá, krv a rakoviny [2]. Vznikajúci motív z týchto štúdií je, že mnoho biologických procesov sú akútne citlivé na sile kanonickej Wnt signalizácie.

Toto tesné regulácia kanonickej Wnt signalizácie je nevyhnutná pre vývoj obličiek. V počiatočných fázach formovania obličiek, Wnt9b je vylučovaný z močovodu pupenca a signálov progenitorov vo viečku mezenchymu k indukcii diferenciácie nefrónov. Liečba s chloridom lítnym alebo aktivácia p-kateninu môžu indukovať diferenciáciu nefrónov v neprítomnosti močovodu výhonku a Wnt9b, čo naznačuje, že zvýšenie kanonické Wnt signalizácie je dostatočná pre túto indukciu [3], [4]. Niektoré viečko mezenchymu bunky proliferáciou zachovať progenitorové bunky, ktoré sú požadované pre následné iterácie tohto procesu [5]. Táto rovnováha medzi údržbou progenitorových a indukciu diferenciácie je nanajvýš dôležité, aby sa zabezpečilo, že obličky tvoria plný počet nefrónov [5], [6], [7], [8], [9].

Niekoľko faktorov vyjadrené v cap mezenchymu bolo preukázané, že antagonizujú Wnt-stimulovanej diferenciáciu vrátane transkripčného faktora Six2
. Výmaz Six2
výsledky v mimomaternicovom diferenciácii, vyčerpanie cap mesenchyme progenitorov a obličiek agenéza [9]. Hoci presný mechanizmus nie je doteraz známy, hypotéza bola navrhnutá, keď vysoké hladiny kanonickej Wnt signalizácie riadiť záväzok voči diferenciáciu zatiaľ čo vysoká Six2 činnosť v rovnakých bunkách udržuje predok osudu [7]. Vytvorili sme nový model myši podmienečne so zvýšenou expresiou Wnt9b k aktivácii kánonickej Wnt signalizácie. Použili sme tento model na testovanie, či zvýšená Wnt9b aktivita je dostatočná k narušeniu rovnováhy medzi progenitory a diferenciácie v uzávere mezenchymu.

Druhé miesto, kde obaja Six2 aktivita a Wnt signalizácie hrajú dôležitú úlohu, je pyloru zvierača , Pylorická zvierač je vytvorený na vzdialenejšom konci žalúdka a funguje ako ventil pre umožnenie správne trávenie potravy pred jej vstupom do dvanástnika. Dysfunkcia zvierača môže viesť k varu pod spätným chladičom dvanástnikových obsahu do žalúdka predstavujúce zvýšené riziko žalúdočnej metapláziu a rakoviny [10], [11]. Táto oblasť je tiež pozemok vrodených chýb vrátane vzácna porucha primárnej duodenogastrický refluxu a bežnejšie vrodená vada pylorostenózy [12]. Six2
nedostatok vedie k agenéza pyloru zvierača a znepriateliť Wnt aktivitu s Sfrp1 a Sfrp2 je povinný vzoru žalúdok [13], [14]. To nás viedlo k hypotéze, že kanonické Wnt činnosť musí byť prísne regulovaná v pyloru podobné s tým, čo bolo navrhnuté v obličkách. Tento test sme použili Six2
-Creme aktivovať Wnt9b
transgénne vo Six2
vyjadrenie domén v obličkách a žalúdka.

podmienečný Wnt9b
transgénne alely vykazujú tu vyjadruje Wnt9b stroje a GFP pri aktivácii cre rekombinázy. Je to biologicky aktívne a schopné záchranu tvorbu obličiek v Wnt9b ^{- /-
embryí. Nadmerná expresia Wnt9b
v obličkách, močovodu zárodku je schopná indukovať gény spojené s diferenciáciou uzáveru mezenchymu, ale neprechádza mezenchymálnych-to-epiteliálne prechodu (Met) za vzniku morfologicky odlišné vačkov štruktúry. Wnt9b
transgénne aktivácia v Six2
-pozitívnych bunky spôsobuje obličkové cysty a transformácie distálnej žalúdočnej regiónov do blízkeho žalúdka osudu. Porovnanie Wnt9b
transgénnej na alely, ktoré produkuje stabilizované β-katenin proteín demonštruje dávke citlivé zmeny génovej a naznačuje, že tieto kmene predstavujú alelickou sériu, ktorá by mala byť cenná pre moduláciu kanonickej Wnt signalizácie v ostatných tkanivách.}

Výsledky

Transgénne myši vyjadriť Wnt9b pri aktivácii Cre rekombinázy

Wnt9b transgén bol postavený s kazetou s lox-STOP [15] na vytvorenie podmienene aktívny Wnt9b, ktorá závisí na CRE rekombinázy pre expresiu (obr. 1A). Po aktivácii transgén exprimovaný Wnt9b sa líši od endogénneho Wnt9b, pretože obsahuje chrípkový hemaglutinín epitopovou koncovku C-terminálny a transgénne bunky budú vykazovať GFP fluorescencie vďaka kazety IRES-EGFP. Pre testovanie vernosť transgénu, sme sa zaoberali CRE-dependentný expresiu v kultivovaných bunkách a in vivo v embryách (Obr. 1B). Epitop značený Wnt9b bola detekovateľná v lyzáty buniek ko-transfekovány s transgénu a CRE plazmidmi, a to v transfekcia samotného transgénu. Rovnako tak lyzáty z embryí, ktoré boli pozitívne na Wnt9b a beta-aktínu-CRE transgény obsiahnuté Wnt9b chrípky, zatiaľ čo jednotlivé Wnt9b transgénne nie. GFP fluorescencie bola pozorovaná v Wnt9b /β-aktínu vytvori dvojité pozitívnych embryí, a nie v Wnt9b súrodencov (Obr. 1C-F). Hladina expresie transgénnej Wnt9b v korelácii s intenzitou fluorescencie GFP pre každý riadok zakladateľa. (Obr. 1D). Štyri nezávislé zakladajúci línie boli schopné produkovať živé β-aktínu-CRE ^{tg /+, Wnt9b TG /+ dvojité heterozygotné mláďat, ktoré preukazujú, že všadeprítomná zvýšená Wnt9b výraz embryonálny smrteľná. Analýza embryonálnych štádiách ukázalo, že β-aktínu-CRE tg /+, Wnt9b TG /+ dvojité heterozygotná embryá bola zistená u menej, než sa očakávalo Mendelovej frekvencií na E11-E12. Jediný double heterozygotné embryo bolo pozorované od zakladateľa s veľmi vysokou expresiu (Obr. 1A, n = 23, očakáva, že frekvencia 25%) a 16% bolo pozorované z iného zakladateľa (n = 25). Wnt9b /SS-aktínu-Cre double transgénne embryá mal menšie srdca združovania krvi, čo naznačuje, srdcová nedostatočnosť ako príčina smrti.}

Transgénnej Wnt9b je biologicky aktívny

Ak chcete zistiť, či transgénne Wnt9b je biologicky aktívne, sme testovali, či to bolo schopné nahradiť divoký typ Wnt9b
počas vývoja obličiek. Wnt9b <sup>- /- www.Booked.cz embryá vykazujú vysokú penetráciou rázštep podnebia a agenéza fenotyp (obr. 2). Aktivácia transgénnej Wnt9b v močovodu zárodku s Hoxb7
-Creme zachránil tvorbu obličiek, ale nie, poschodie uzáver na E14.5 vo všetkom Hoxb7
-Creme tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b TG /+ embryá (n = 7). Tento záchranný obličiek špecifické potvrdzuje, že transgénne Wnt9b expresie je závislá na aktiváciu Čerpadlá CRE, pretože poschodia nevyjadruje Hoxb7
-Creme. Kvantitatívne PCR divokého typu, Wnt9b - /- stroje a Wnt9b - /-
Wnt9b tg /+ transgénne obličky bolo zistené, že transgénne Wnt9b
bol exprimovaný 2.3- krát vyššej úrovni než génu divokého typu, zatiaľ čo expresia Ret
bola nezmenená (obr. 2 G-I). Schopnosť transgénnej Wnt9b signalizovať mezenchymu nahradiť divokého typu Wnt9b
aktivita potvrdzuje, že je biologicky aktívny in vivo.</sup>

Veľké množstvo údajov ukázala, že Wnt9b a β-katenin signalizácia sú kritické indukčné signály, ktoré iniciujú diferenciáciu čiapky mesenchyme do epithelialized obličkových vačkov [4], [8], [16]. Wnt9b vyrobené v močovodu zárodku aktivuje kanonickej Wnt signalizácie v susednom mezenchymu a vedie k expresii génov, ktoré regulujú mezenchymálnych na epiteliálnych prechodu (Met). Preto sme testovali, či zvýšená expresia Wnt9b
v močovodu zárodku by signalizovať mezenchymu k aktivácii génovej expresie THP a podporovať zvýšenú indukciu nefrónov. Wnt9b
bol nadmerne vystavený v močovodu zárodku pomocou Hoxb7
-Creme: EGFP. E12.5 embryá boli genotyp kvantitatívne analýzou PCR na určenie, či boli hemizygotní alebo homozygotnou pre Wnt9b
transgénu a obličky boli zbierané na analýzu génovej expresie. Zistili sme, zvýšenie v závislosti od dávky Wnt9b
, ktorý bol sprevádzaný úmerným aktiváciou expresie cieľových génov Wnt9b, Wnt4
Pax8 stroje a fgf8
v troch nezávislých transgénnych bazénoch obličiek (obr. 2J). Six2
je vyjadrená v nediferencovaných (SPP) mesenchyme a je downregulated ako vačkov diferenciácia vyplýva [17]. Six2
mRNA expresie je ovplyvnený vo Hoxb7
-Creme, Wnt9b
double transgénne. Rovnako tak ureterální púčik gény, Ret stroje a Wnt11
nie sú významne ovplyvnená nadmernou expresiou Wnt9b
. Špecifická up-regulácia génov v mezenchymu potvrdzuje, že transgénne Wnt9b je schopný signalizácia z močovodu bud pre indukciu génov dôležitých pre MET však žiadny histologicky dokázaným ektopických epithelialized obličiek vačkov bolo zrejmé (dáta nie sú uvedené). To naznačuje, že upregulace Wnt9b
v močovodu zárodku je dostatočná pre aktiváciu génu v mezenchymu, ale nie pre morfologické diferenciácie obličiek vačkov.

Misexpression z Wnt9b narúša funkciu obličiek a tvorbu pyloru zvierača aktiváciou kánonický p-katenin

vzor objavujúce sa v obličkách, je, že existuje jemná rovnováha medzi progenitorových vlastné obnovy a aktivácii diferenciácie [6], [7], [9]. Wnt9b /β-katenin cesta je nutná pre diferenciáciu a Six2 potláča diferenciáciu v počiatočnom kroku záväzku. Preto sme predpokladali, že schopnosť Six2 podporovať rozhodnutie osudu naproti od tých, ktoré aktivuje vysoko β-katenin činnosti by mohla byť spoločnou témou vo vývoji. Testovali sme túto možnosť aktiváciou transgénnych Wnt9b
s Six2
-Creme. Dvojité transgénne expresné Wnt9b
v rovnakých bunkách, ktoré exprimujú Six2 stroje a môže narušiť procesy, ktoré sú koordinovane regulovaná v obličkách a iných tkanivách. Six2-CRE ^{tg /+
Wnt9b tg /+
myši vykazovali úzkosť pri odstavení a meranie telesnej hmotnosti boli znížené o 39% za štyri týždne (14,5 ± 3,4 gramov, p 0,001) v porovnaní s CRE-negatívne Wnt9b tg /+
vrhu (23,6 ± 0,7 gramov). Fenotypová analýza ukázala, že toto zníženie telesnej hmotnosti bolo spôsobené chybou gastrointestinálneho traktu a obličiek, dvoch lokalít Six2
-Creme výraz (obr. 3).}

početné cysty rozlišné boli veľkosti viditeľné v kôre a dreni dvojitých heterozygotných obličiek (obr. 4, n = 11/11). Cysty boli prevažne v mozgovej kôre a vonkajšie drene a boli z proximálneho tubulu pôvodu, ako bolo preukázané farbením LTL. Cystická choroba bola najprv viditeľné čoskoro po narodení (P7-10) v proximálnych segmentoch nefrónu (dáta nie sú uvedené). Tieto dvojité heterozygotné zvieratá naznačila zvýšené hladiny sérového kreatinínu (0,652 ± 0,044, p < 0,005) v porovnaní ku kontrole vrhu (predstavujú 0,119 ± 0,002) ako skoro ako ~ 3 týždňoch veku, s uvedením závažné zlyhanie obličiek. Staršie zvieratá s pokročilým ochorením tiež obsahoval cysty odvodené z viac distálnej segmentov vrátane slučky Henly (Tamm-Horsfall-pozitívne). U všetkých zvierat sa zlyhaním obličiek pokročilé skúmaných sme pozorovali mnoho zbieranie cysty potrubné odvodený že vyjadrené aquaporin 2 alebo viazanej D. Biflorus
-lectin. Vzhľadom k tomu, Six2
-Creme nie je vyjadrený v zbernej potrubia, táto dilatácie je pravdepodobné, že sekundárne dilatácie vo viacerých proximálnych segmentoch. Prítomnosť obličkových cýst vo Wnt9b
transgénnych zvierat posilňuje k záveru, že narušenie Wnt signalizačného systému spôsobuje, cystická choroba [7], [18], [19].

Hoci obličkové cysty boli nie je prítomný až po pôrode, up-regulácia kanonickej Wnt signalizácie bola zrejmá u E12.5 pri Six2
-Creme je spočiatku vyjadril. Expresia proteínu bola zvýšená Lef1 v pre-rúrkových agregátov a obličkových vačkov štruktúr v dvojitých transgénnych rastlín a bola ďalej zvýšená v početných ektopické vačkov vytvorených vo stabilizovaných beta-katenin obličiek (n = 3, obr. 5). Zvýšenie dávky reagujúce na Lef1 výraze podporuje zverejnené dáta, ktorá sa Wnt9b pôsobiaci keď kanonickej Wnt signalizácie v rozvojovom obličkách [7]. Nedostatok ektopických vačkov štruktúr v Wnt9b
transgénnych rastlín ukazuje, že Wnt9b
alela vykazuje mierny vplyv na β-katenin v porovnaní s stabilizovaného β-katenin alely.

Druhý fenotyp prispieva k zníženiu telesnej hmotnosti Six2-cre ^{TG /+
Wnt9b TG /+
dvojlôžkové heterozygotes bol žalúdočné núdzi. Žltá plodovej vody bolo pozorované v žalúdku dvojitých génovej manipulácie, a nie v jednotlivých transgénnych súrodencov (n = 6, obr. 6). To ukazuje, že duodenogastrického refluxu sa deje a môžu byť spôsobené abnormálne vrátnika tvorbe zvierača. Zvierač medzi žalúdka a dvanástnika bola pretiahnutá a rozšírený v dvojitom transgénnych (obr. 6, vložka). Antagonista TGFp, Nephrocan, ktorý je normálne exprimovaný vo veľmi obmedzenom vzorom na E16.5, bol rozšírený v dvoch transgénnych rastlín, čo naznačuje, že zvierač región nebol správne obmedzený. Tento podlhovastý morfológia bola podporená imunohistochemickým farbením hladkej svaloviny, ktorá tvorí husté svalovú stenu obklopujúcu vrátnik (obr. 6 E, F). V jednotlivých transgénnych kontrol sa zistilo, že najhrubšia svalstvo, kde tkanivo vykazuje najväčšiu zúženie na zvierača (riadku). V dvojlôžkových transgénnych rastlín, s hrúbkou muscularity bola pozorovaná, ale táto oblasť bola vyrovnaná z oblasti, ktorá bola najviac zúžená.}

vady Mis-vzorovanie boli pozorované tiež analýzou konkrétnych markerov, ktoré rozlišujú medzi proximálnym (H ^{+ /k + ATPáza) a distálnej (Alcian modrá) oblasť žalúdka. Proximálny žalúdka (corpus) obsahuje H + /K + ATPázy expresiou parietálnej bunky, ktoré sú vylúčené z antra-pylorus regiónu. Naopak, antra-pylorus obsahuje slizničnej bunky, ktoré škvrnu Alcian modrí, ktoré nie sú nájdené v blízkej oblasti [20]. Dvojité transgénnej vykazovali trvalé H + /K + ATPázy, farbenie a absencia Alcian blue-pozitívne sliznice v antrálnej žalúdočnej-pyloru ukazuje, že distálny oblasť je mis-vzorované k proximálnemu osud Wnt9b
výraz. Alcian modrí pohárikových buniek v čreve bol neporušený v jedno a dvojlôžkových génové manipulácie, pretože Six2
-Creme nie je vyjadrený v dvanástniku. Tento mis-vzorovanie naznačuje, že podobný paradigmy v obličkách, kánonický β-katenin špecifikuje jeden osud, predného žalúdka oblasť a vzory Six2 činnosť distálnej identity. Toto je podporované expresných domén týchto génov od kanonickej Wnt signalizácie reportér vykazuje vysokú aktivitu len v ústi pažeráka, a Six2
sa obmedzuje na distálnej žalúdka a pyloru [13], [14].}

Ak je zodpovedný za gastroduodenálnej reflux Six2-CRE ^{tG /+
Wnt9b tG /+
Dvojstranná transgenics, potom malformácií kanonické Wnt signalizácie pozorovať treba zrekapituloval na myšiam modelu, ktorý vyjadruje stabilizovaný p-katenin v rovnakej doméne ( Ctnnb1 EX3 /+
, [21]). Po aktivácii cre, táto alela zabraňuje proteolytické degradácii beta-kateninu a očakáva sa povýšiť kanonickej Wnt signalizácie na vyššej miere, ako je sám Wnt9b ligandu. Celá montáž v analýze in situ E12.5 žalúdkov odhalila tri gény, Grem1
NKX 2,5
a Gata3
, ktoré sa zvyčajne vyjadrujú v tenkom páse demarking región, ktorý sa stane zvierač (n = 8, obr. 7). Ektopická expresia zo Wnt9b
potlačil antagonista BMP Grem1 stroje a transkripčný faktor Gata3
v tomto regióne, a tieto gény boli ďalej downregulated pri β-katenin bola zvýšená. Expanznej závislá od dávky bola pozorovaná pre transkripčný faktor Nkx2.5
v oboch mutantov. Gény, ktoré boli lokalizované výlučne čreva ( Villino
) alebo ústi pažeráka ( Bmp4
) neboli ovplyvnené buď v mutantných (dáta nie sú uvedené). Zvýšená kanonickej Wnt signalizácie v antrálnej žalúdku a pyloru bola potvrdená izolovať túto oblasť a prevedenie kvantitatívnej PCR. Kanonické Wnt cieľové gény, ktoré sú up-regulované v stabilizovanom β-katenin alely, Lef1 stroje a Axin2
Rovnako boli zvýšené v pylorické regióne Six2
-Creme tg /+, Wnt9b TG /+ double transgénne [ Lef1
2,0 ± 0,25 a Axin2
1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Spoločne dávky reagujúce na génovej expresie zmeny pozorované v pylorických kraji v Wnt9b
génové manipulácie a stabilizovaných β-katenin embryí ukazujú, že zvýšená kanonické Wnt signalizácie narušuje distálnej žalúdka a pyloru vývoj zvierača.}

Diskusia

Tieto výsledky popisujú vytvorenie nového myšiam modelu, ktorý podmienečne aktivuje kanonickej Wnt signalizácie. Wnt9b
transgén je indukovatelná pri vystavení cre rekombinázy a vyjadruje GFP ako marker indukcie. Rovnako si zachováva plnú biologickú aktivitu, pretože sa môže zachrániť Wnt9b ^{- /-
fenotypmi v obličkách. Tieto myši boli udržiavané v našej kolónii dlhšie ako rok a vyvolávajú Wnt9b
vyjadrenie na chov do niekoľkých rôznych kmeňov CRE. Využili sme tohto nového kmeňa k aktivácii Wnt signalizácie v Six2
-pozitívne buniek a našiel škodlivé účinky na obličky a žalúdok.}

V obličkách, Wnt9b je vylučovaný z ureterálního bud epitelu prinútiť susedné cap mezenchým progenitorov pre začatie diferenciácie. Na podporu tohto modelu, naše in vivo gain-of-funkcie štúdie ukazujú, že Wnt9b
upregulates skoré markery renálnej vačkov diferenciácie, napríklad Wnt4
fgf8
a Pax8
. Avšak, hoci obličkovej vačku génov nevyvoláva Wnt9b
transgénne sme nespozorovali morfologický dôkaz zvýšeného alebo ektopické tvorby obličkových vačkov, ktorý vykázal za Six2
mutanty [9]. Okrem Wnt indukčné signál, faktory, ktoré udržujú obličkovej kmeňovým bunkám (napr. Six2
), musí byť tiež downregulated plne vyvolanie tvorby obličkových vačku. Six2
expresie nebola zmenená na našom Wnt9b
transgénnych a môžu teda vysvetliť, prečo zvýšenie Wnt9b neviedlo k ektopických obličiek vačky. Ektopická indukcia obličiek vačkov markerov je vyvolaná aktiváciou beta-kateninu v Six2
-pozitívne metanephric mezenchým s použitím stabilizovaného β-katenin alely [4], a preto je rozdiel medzi týmito dvoma pokusmi gain-of-funkcie môže súvisieť s mierou, do akej aktiváciu kánonickej Wnt aktivitu. Okrem toho, že je pravdepodobné, že aktivácia kanonické signalizácie Wnt9b v metanephric mezenchymu vyvoláva inhibíciu spätnej väzby, ako je uvedené v ďalších Wnt tkanív reagujúcich, a tým bráni indukcii úplné diferenciácie programu [22]. Nedávne údaje potvrdzujú túto myšlienku inhibícia spätnej väzby od Wnt9b /β-katenin je potrebný nielen pre diferenciáciu metanephric mezenchymu, ale paradoxne je tiež potrebné rovnaký signál pre údržbu alebo rozšírenie obličkovej kmeňovým bunkám [7]. Domnievame sa, že stabilizovaný β-katenin, pôsobiace v smere na dráhe, môže obísť tieto regulačné mechanizmy. Tieto možnosti by mohli byť testované v ďalších štúdiách vo ktoré porovnávajú downstream aktivácia génu obličiek progenitorových buniek pomocou Wnt9b
transgén a stabilizované gain-of-funkcie myši β-katenin.

odchýlok v kánonickom Wnt signalizácie bolo preukázané, že sú dôležité pri patogenéze ochorení obličiek cystickej (prehľad Patel et al. [23]). Transgénnej expresie stabilizovaného beta-kateninu alebo nedostatku APC v renálnej tubulárnej epitelu vedie ku obličiek cystická ochorení, čo podporuje záver, že ektopická kanonické Wnt signalizácie je dostačujúca pre cystogenesis [18] [19]. Zlyhanie obličiek a cystická dilatácia v Six2
-Creme ^{tg /+, Wnt9b TG /+ dvojité heterozygotes ďalej podporuje hypotézu, že stimulovaná kanonické Wnt signalizácie spôsobuje cysty. Rozrušenie nekanonické Wnt signalizácie (PCP) dráhy, je tiež dôležité, v tvorby obličkových cýst [24]. Je teda možné, že tvorba cýst v našom modeli, nie je len v dôsledku aktivácie kanonické signalizácie, ale je výsledkom narušenie relatívna rovnováhu medzi kanonické a non-kanonické signalizácia. Na podporu tejto myšlienky, gény, ktoré sú mutované vo zdedené formy cystickej ochorenia ( PKD1
PKD2
PKHD1
Inversin
) lokalizovať do rias a tieto organely boli v poslednej dobe dokázané, že je schopný regulovať rovnováhu medzi kanonické a nekanonické Wnt signalizácie [25], [26].}

došlo k závažným fenotypom obličiek, hoci Wnt9b
mRNA expresie je zvýšená ~ 2-krát v našej transgénu, čo naznačuje, že relatívne nízka úroveň, pretrvávajúce aktivácii tejto cesty vedie k renálnej dysfunkcie. Táto úroveň up reguláciu Wnt9b v močovodu zárodku pomocou Hoxb7
-Creme nepriniesla cysty, čo naznačuje, že cystogenesis v zberných kanálikov vo Six2
-Creme ^{TG /+, Wnt9b tg /+ dvojité transgénnej je pravdepodobné, že druhotný účinok rozšírenými rúrkových segmentov (dáta nie sú uvedené). Na podporu tohto, v postnatálnej deň 7-10 zvierat, cystická choroba sa prejavuje iba lineárnych segmentov proximálnej do zberného potrubia. Podobne ako u polycystické ochorenie obličiek u pacientov, transgénne myší sa vyvinula ťažká zlyhanie obličiek, aj keď väčšina nefrónu nevyvinú cysty. To vyvoláva otázku, či obličkové kanáliky bez zjavných cysty sú abnormálne a významne prispievajú k postupnému funkčnému poškodeniu v týchto porúch. Nedávne štúdie ukazujú, že dospelí kanálikoch obličiek epitel expresné Wnt9b, Frizzled receptory a LRP5 /6 ko-receptory, ktoré sú schopné sprostredkovať kanonickej Wnt signalizácie v reakcii na akútnej ischemickej poranenia [27]. V tomto nastavení Wnt signalizácie podporuje a regeneráciu tkaniva kanálik. Avšak, Wnt signalizácie aktivita bola tiež podieľa na podpore obličkovej fibrózy po poranení, ako je napríklad v modeli UUO [28]. Celkovo tieto štúdie zdôrazňujú význam regulácie Wnt signalizácie v dospelom obličkách vyvážiť priaznivé odozvy, ako sú opravy /regenerácie a maladaptivní reakcie, ktoré vedú k fibrózou a chronickou orgánových dysfunkcií.}

pyloric región žalúdka reprezentuje kritickej hranice, ktorá oddeľuje od žalúdka čriev. Uzáver zvierač, keď sa jedná o potravinu bolus vstúpi do žalúdka umožňuje správne trávenie pred tranzit do tenkého čreva. Molekulárna základ pre tvorbu tejto diskrétne oblasti nie je dobre známa, aj keď niektoré detaily sa objavujú. Tieto výsledky naznačujú, že prísna kontrola z Wnt signalizácie je zásadné pre vývoj pyloru. Kanonické Wnt aktivita je detekovaná vo fundu a tela (corpus), ale vylúčená z distálneho žalúdka a pyloru [13]. V Barx1
- /- myší, žalúdok je malý, antrálnej hora hranica je rozmazaný a je agenéza pyloru zvierača. Elegantné štúdie tkanivo rekombinácie naznačujú, že tieto fenotypy výsledkom strata expresie Wnt antagonistov Sfrp1 a Sfrp2. Vzhľadom k tomu, Barx1
deficit má globálny vplyv na vývoj foregut, že nie je jasné, či down-regulácia kanonickej Wnt činnosti je osobitne potrebné pre tvorbe pyloru. Naša štúdia priamejšie testovali túto možnosť, a to určením ektopickej Wnt aktivitu do menšieho regiónu, len vpredu od vrátnika s Six2
-Creme.

Zistili sme, že ektopická Wnt aktivita špecificky narúša tvorbu pylorické zvierač pri absencii globálnych vád vo vývoji žalúdku. Tak, down-regulácia kanonickej Wnt činnosti je nutné, aby sa vzor pyloru oblasť, ktorá oddeľuje od žalúdka čriev. Ektopická expresia z Wnt9b ligand a stabilizovaný p-katenin u transgénnych myší by mohla prekonať následky vylučovaných endogénnych Wnt antagonistov Sfrp1 /2, v súlade s modelom navrhovaným Kim et al [13]. Podobne ako u našich výsledkov, v časti Six2
mutanti tam je znížená expresia Nkx2.5 stroje a Gremlin
, gény, ktoré sú dôležité pre rozvoj pyloric zvierač v kuriatko [14] , [29]. To naznačuje, že Six2 stroje a Wnt
regulovať spoločný genetický kaskádu pri predpokladanej pyloru zvierača. Predpokladáme, že dôležitá funkcia Six2
môže byť k interpretácii kanonickej Wnt signály v rôznych vývojových súvislostiach.

upregulovány kanonickej Wnt signalizácie bolo tiež preukázané, že ovplyvňujú sleziny a vývoj pankreasu [30]. Na podporu tohto, sleziny a slinivky hypoplázia sa pozoroval aj u Six2
-Creme, Wnt9b
bi-transgénne myši (dáta nie sú uvedené). Vzhľadom k tomu, Six2
-Creme nie je exprimovaný v týchto tkanivách, čo naznačuje, že signály zo zadnej žalúdka mezenchymu môže mať vplyv na slezinu a pankreas počas vývoja. To by podporilo hypotézu, že pyloric región môže pôsobiť ako organizátor pre tvorbu týchto orgánov príslušenstva. Počas vývoja, sleziny prekurzorov buniek prechodne pridružiť k vrátnika oblasti, pred ich migráciou na ľavej strane v žalúdku, kde kondenzujú [31]. Hoci sme nezistil Six2
-Creme výraz v sleziny primordium alebo mesothelium, nemôžeme vylúčiť, že prechodné expresie Six2
-Creme v týchto regiónoch je zodpovedný za vady sleziny a slinivky brušnej , Budúce štúdie sú potrebné k priamemu testovanie týchto možností.

V súhrne sme vyvinuli nový model myši, ktorá umožňuje časové a priestorové vyjadrenie Wnt9b. V rozvojovom obličkách, transgénne Wnt9b
môže vyvolať čoskoro THZ génovej expresie v Six2
-pozitívne obličiek progenitorových buniek, ale nie je dostatočná pre aktiváciu plnej diferenciácie programu. Perzistentné expresie Wnt9b v Six2
-pozitívne bunkách vedie k obličkových cýst a ťažkým zlyhaním orgánov. V žalúdku, ektopickej Wnt β-katenin činnosť v oblasti pyloru mení tvorbu zvierača a distálnej žalúdočnej šablónovanie. Spoločne tieto zistenia zdôrazňujú dôležitosť tesnou kontrolou Wnt aktivity a naznačujú, že Six2 a β-katenin sú zapojené do orgánov vzorovaním v rôznych kontextoch.

materiáloch a metódach

etika vyhlásenie

Tieto štúdie na zvieratách boli schválené starostlivosti zvierat a používanie výboru Saint Louis University (protokol 1460) a St. Louis VA (protokol 0305). Všetky postupy zahŕňajúce zvierat boli v súlade s inštitucionálnymi dobrých životných podmienok zvierat predpisov, noriem a zásad.

Myši

Wnt9b
transgénne myši boli prešiel ku každému z troch rôznych CRE liniek [32 ]. 1) β-actin- CRE bol použitý pre expresiu Wnt9b akomkoľvek mieste (obr 1, [33]) 2), Hoxb7
-Creme :. EGFP bol použitý k nadmernej expresii Wnt9b vo svojom endogénnym polohe v obličkách sa ureterální bud (obr 2, [34].), a 3) BAC Six2
-Creme: EGFP transgén bol použitý pre expresiu Wnt9b exogénne v žalúdku a obličiek (obr 3, 4, 5, [. ,,,0],35]).

• PLoS ONE: hmyzožravé Netopiere Digest chitínu v žalúdku Použitie kyslá cicavčie chitinázy
• Ploche ONE: Integrácia obsah žalúdka a stabilný izotop analýz kvantifikovať jedálnička Pygoscelid Penguins