PLoS ONE: Ehdollinen ilmentyminen Wnt9b in Six2-positiivisten solujen häiritsee Vatsa ja munuaisten toiminta

tiivistelmä

aikana munuaisen kehitystä, kanoninen Wnt signalointi aktivoi erilaistumista, kun taas transkriptiotekijä Six2 ylläpitää progenitorivarastoon. Nämä vastakkaiset signaalit auttavat säätelemään nephron muodostumiseen ja varmistetaan täysi nephrons muodostuvat. Koska nämä kaksi tekijää ohjaavat erilaiset kohtalot munuaisissa mesenkyymikudokseen me arveltu, että yliekspressio Wnt9b
in Six2
ilmentävillä solut häiritä munuaisten muodostumista ja voi muuttaa solujen erilaistumista päätöksiä muissa kudoksissa. Loimme siirtogeeninen hiiri, joka ehdollisesti ilmaisi kanoninen Wnt ligandin kehittyvässä munuaisessa, Wnt9b
. Siirtogeeni aktivoidaan cre rekombinaasi ja ilmaisee GFP. Ensin testataan sen biologinen aktiivisuus käyttäen Hoxb7-cre
ja totesi, että siirtogeenisiä Wnt9b kykeni indusoimaan geenien ja pelastamisen munuaisen kehityksen Wnt9b ^{- /-
homotsygoottinen hiirillä. Sitä vastoin ilmaus Wnt9b
soluissa käyttämällä Six2-CRE
aiheutti ruoansulatuskanavan häiriöt ja vaikeaa munuaisten vajaatoimintaa aikuisten hiirillä. Siirtogeeniset munuaiset oli lukuisia kystinen tubulukset ja kohonneet kreatiniiniarvot (0,652 ± 0,044) verrattuna villityypin hiiriin (0,119 ± 0,002). Nämä eläimet oli myös epämuodostunut mahaportin sulkijalihaksen, duodenogastric refluksi, ja muunnoksen distaalisen mahasta proksimaaliseen kohtalon. Geeniekspression muutokset havaittiin Wnt9b: EGFP
siirtogeenin verrattiin stabiloitua β-kateniinin alleelin määrittämiseksi, että Wnt9b aktivoi kanoninen Wnt-reitin kudoksissa analysoitiin. Nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen Wnt9b
in Six2
positiivisten solujen häiritsee solun kohtalon päätöksiä munuaisissa ja ruoansulatuskanavassa.}

Citation: Kiefer SM, Robbins L, Rauchman M (2012) Ehdollinen ilmentäminen Wnt9b in Six2
positiivisten solujen häiritsee Vatsa ja munuaisten toiminta. PLoS ONE 7 (8): e43098. doi: 10,1371 /journal.pone.0043098

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 29 helmikuu 2012; Hyväksytty: 17 heinäkuu 2012; Julkaistu: 17 elokuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health avustuksen R01 DK067222 (http://nih.gov/) ja American Heart Association Perustettu tutkija 0840117N (http://www.heart.org) MR. SK tukivat Saint Louisin yliopiston Presidentin Research Fund Award (www.slu.edu). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kanoninen Wnt-signalointireitin on keskeinen säätelijä solun kohtalon, soluproliferaatiota, ja soluadheesion kehityksen aikana ja koko aikuisuuden. Lukuisat positiiviset ja negatiiviset välittäjien on tunnistettu, että toimivat yhdessä saavuttaakseen tiukka sääntely β-kateniinin signalointi. Keskeinen paradigma on, että sytoplasminen β-kateniinin on erottautuvat hävittämisluetteloon monimutkainen, fosforyloituu GSK3p, ja suunnattu ubikitiinipromoottori tuhoa väylän puuttuessa Wnt-signaalin. Wnt sitova inhiboi fosforylaatiota ja tuhoaminen β-kateniinin, jolloin se voi tumaan vaikuttavan kohdistaa geeniekspression TCF /LEF tekijät (katsaus MacDonald et al. [1]). Lukuisat hiiri malleja on luotu tutkimaan tämän reitin mukaan lukien sekä voitto ja lakkaa toimimasta alleelin Wnts, Wnt reseptorit, β-kateniinin, ja TCF /LEF transkription sääntelyviranomaisten. Nämä mallit ovat paljastaneet olennainen roolit kanoninen Wnt signalointia luun, hiukset, suoli, veren, ja syöpä [2]. Kasvava teema Näistä tutkimuksista on, että monet biologiset prosessit ovat akuutisti herkkiä vahvuus kanoninen Wnt signalointia.

Tämä tiukka sääntely kanoninen Wnt signalointi on välttämätön munuaisen kehitystä. Alkuvaiheissa munuaisten muodostumisen, Wnt9b erittyy ureteric alkuunsa ja signaaleja kantasolujen korkki mesenchyme aiheuttavan Nefroni erilaistumista. Käsittelemällä litium-kloridi tai aktivoitumista β-kateniinin voi aiheuttaa nephron eriyttäminen puuttuessa ureteric alkuunsa ja Wnt9b, viittaa siihen, että kasvu kanoninen Wnt signalointi on riittävä tämän aiheuttavan tapahtuman [3], [4]. Jotkut cap mesenkyymin solut lisääntyvät säilyttää esisolujen, joita tarvitaan myöhemmin toistojen tämän prosessin [5]. Tämä tasapaino kantaisä huolto- ja erilaistumisen induktioon on ensiarvoisen tärkeää varmistaa, että munuainen muodostaa täysi nephrons [5], [6], [7], [8], [9].

Useat tekijät ilmaistaan ​​korkki mesenchyme on osoitettu antagonisoida Wnt-stimuloi erilaistumisen lukien transkriptiotekijä Six2
. Poistaminen Six2
tuloksia kohdunulkoinen erilaistumiseen, ehtyminen cap mesenchyme esisolujen, ja munuaisten agenesis [9]. Vaikka tarkkaa mekanismia ei vielä tiedetä, hypoteesi on ehdotettu jolloin korkea kanoninen Wnt signalointia ajaa sitoutuminen erilaistumista taas korkea Six2 toimintaa samalla soluissa pitää kantaisä kohtalo [7]. Olemme luoneet uuden hiirimallissa ehdollisesti yli-ilmentää Wnt9b aktivoida kanoninen Wnt signalointireitille. Olemme käyttäneet tätä mallia testata onko lisääntynyt Wnt9b toiminta riittää häiritä tasapaino progenitorisolujen ja eriyttäminen korkki mesenchyme.

Toinen sivusto, jossa sekä Six2 toimintaa ja Wnt signalointia tärkeässä asemassa on mahanportin sulkijalihaksen . Mahanportin sulkijalihaksen on muodostettu distaaliseen päähän mahassa ja toimii venttiilin avulla asianmukaisen ruuansulatusta ennen sen saapumista pohjukaissuoleen. Toimintahäiriö sulkijalihaksen voi aiheuttaa refluksi pohjukaissuolikasvainten sisältö vatsaan aiheuttavat lisääntynyt riski mahalaukun metaplasiaa ja syöpä [10], [11]. Tämä alue on myös paikalla synnynnäisten epämuodostumien mukaan lukien harvinainen sairaus ensisijainen duodenogastric refluksi ja yleisempää epämuodostuman mahaportin ahtauma [12]. Six2
puutos johtaa agenesis mahanportin sulkijalihaksen ja antagonisoinnissa Wnt toimintaa Sfrp1 ja Sfrp2 tarvitaan mallia vatsassa [13], [14]. Tämä sai meidät oletuksen, että kanoninen Wnt toiminta on tiukasti säädeltyä pylorus samanlainen kuin mitä on ehdotettu munuaisissa. Tämän testaamiseksi käytimme Six2
-cre aktivoida Wnt9b
siirtogeenin Six2
ilmentävien verkkotunnuksia munuais- ja vatsassa.

Ehdollinen Wnt9b
siirtogeenisiä alleeli raportoitu tässä ilmaisee Wnt9b
ja GFP kun aktivoidaan cre rekombinaasi. Se on biologisesti aktiivinen ja joka voi pelastaa munuaisten muodostumisen Wnt9b ^{- /-
alkioita. Yliekspressio Wnt9b
munuaisessa ureteric alkuunsa pystyy aiheuttamaan liittyvien geenien eriyttäminen cap mesenkyymikudokseen mutta ei tapahdu mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtyminen (MET) tuottamaan morfologisesti erilliset rakkula rakenteita. Wnt9b
siirtogeenin aktivaatio Six2
positiivisten solujen aiheuttaa munuaisten kystat ja muodonmuutoksen distaalisen vatsaan alueet jaetaan proksimaaliseen vatsaan kohtalon. Vertailu Wnt9b
transgeeniset sen alleeli, joka saadaan stabiloituja β-kateniinin proteiini osoittaa annoksesta reagoiva geenin muutokset ja viittaa siihen, että nämä kannat ovat alleelinen sarja, joka olisi arvokasta vaihdella sellaisten kanoninen Wnt signalointia muissa kudoksissa.}

tulokset

siirtogeenisiä hiiriä ilmaista Wnt9b kun aktivoidaan cre rekom-

Wnt9b siirtogeeni rakennettiin kanssa lox-STOP kasetti [15] luoda ehdollisesti aktiiviseen Wnt9b joka riippuu cRE rekombinaasi ilmentymisen (Fig. 1A). Kun se on aktivoitu, siirtogeeni-ilmaistuna Wnt9b on erotettavissa endogeeninen Wnt9b, koska se sisältää C-terminaalisen Influenssahemagglutiniinitrimeerien epitooppi-tag ja siirtogeeniset solut osoittavat GFP johtuva fluoresenssi IRES-EGFP kasetti. Testaamiseksi uskollisuus siirtogeenin, tutkimme cre riippuvaista ilmentyminen viljellyissä soluissa ja in vivo alkioiden (Fig. 1 B). Epitooppimerkitty Wnt9b oli havaittavissa lysaatit soluista kotransfektoitiin siirtogeenin ja cre plasmidi, eikä transfektioissa siirtogeenin yksin. Samoin lysaatit alkioista, jotka olivat positiivisia sekä Wnt9b ja β-aktiini-CRE siirtogeenien sisälsi Wnt9b-FLU taas yhden Wnt9b siirtogeeniset ei. GFP-fluoresenssi havaittiin Wnt9b /β-aktiini-Cre kaksinkertainen positiivinen alkioita eikä Wnt9b littermates (Fig. 1 C-F). Ilmaisu taso Siirtogeenisten Wnt9b korreloi intensiteetti GFP fluoresenssi kullekin perustaja linjaa. (Fig. 1 D). Neljä itsenäistä kantaisälinjasta eivät pystyneet tuottamaan live β-aktiini-CRE ^{tg /+, Wnt9b tg /+ kaksinkertainen heterotsygoottinen pentua, jotka osoittavat, että kaikkialla läsnä kohonnut Wnt9b ilme on alkion tappava. Analyysi alkion vaiheissa paljasti, että β-aktiini-CRE tg /+, Wnt9b tg /+ kaksinkertainen heterotsygoottinen alkiot havaittu odotettua vähemmän Mendelin taajuuksia E11-E12. Yksi kaksinkertainen heterotsygoottinen alkion havaittiin alkaen perustaja erittäin korkea ilme (Fig. 1A, n = 23, odotettu taajuus 25%) ja 16% havaittiin toisesta perustaja (n = 25). Wnt9b /SS-aktiini-Cre kaksinkertainen siirtogeenisiä alkioita oli pienempi sydämet veren kertymisen, mikä viittaa sydämen vajaatoiminnan kuin kuolinsyy.}

Siirtogeenisten Wnt9b on biologisesti aktiivinen

Voit selvittää siirtogeenisiä Wnt9b on biologisesti aktiivisia, testasimme jos se kykenee korvaamaan villityyppisen Wnt9b
aikana munuaisen kehitystä. Wnt9b <sup>- /-
alkiot osoittavat suurta penetrance suulakihalkiota ja munuaisten agenesis fenotyypit (Fig. 2). Aktivointi siirtogeenisiä Wnt9b vuonna ureteric alkuunsa kanssa Hoxb7
-cre pelastettu munuainen muodostumista, mutta ei kitalaessa suljetaan E14.5 kaikissa Hoxb7
-cre tg /+, Wnt9b
- /-, Wnt
9b tg /+ alkioiden (n = 7). Tämä munuaisen erityinen pelastus vahvistaa, että siirtogeeninen Wnt9b ilme riippuu CRE aktivointia, koska maku ei ilmaise Hoxb7
-cre. Kvantitatiivinen PCR villityypin, Wnt9b - /-
ja Wnt9b - /-
, Wnt9b tg /+ siirtogeenisiä munuaiset paljasti, että siirtogeenisiä Wnt9b
ilmentyi 2.3- kertaisesti korkeammilla tasoilla kuin villityypin geeni, kun taas ekspressio Ret
oli muuttumaton (kuvio. 2 G-I). Kyky Siirtogeenisten Wnt9b signaloimaan mesenchyme korvata villityypin Wnt9b
toimintaa vahvistaa, että se on biologisesti aktiivisia in vivo.</sup>

Runsaasti tiedot ovat osoittaneet, että Wnt9b ja β-kateniinin signalointi ovat kriittisiä induktiivinen signaaleja, jotka käynnistävät erilaistuminen cap mesenchyme osaksi epitelisoituun munuaisten rakkulat [4], [8], [16]. Wnt9b tuotettu ureteric alkuunsa aktivoi kanoninen Wnt signalointireitin viereisessä mesenchyme ja johtaa geenien, jotka säätelevät mesenkymaaliset epiteeli- siirtyminen (MET). Siksi testasimme yliekspressio Wnt9b
että ureteric alkuunsa olisi merkki, että mesenchyme aktivoida MET geenien ilmentymistä ja edistämään suurempaa induktion nephrons. Wnt9b
yliekspressoitiin virtsanjohdinsilmusta alkuunsa käyttämällä Hoxb7
-cre: EGFP. E12.5 alkiot genotyypitettiin kvantitatiivisella PCR-analyysillä määrittää, jos he olivat hemizygous tai homotsygoottisia Wnt9b
siirtogeenin ja munuaiset kerättiin geenin ilmentymisen analyysi. Olemme havainneet annosriippuvainen kasvu Wnt9b
, että mukana oli suhteellinen aktivointi ilmentymisen Wnt9b kohdegeenien, Wnt4
, Pax8
, ja Fgf8
kolmessa riippumattomassa allasta siirtogeenisten munuaiset (Fig. 2J). Six2
ilmaistaan ​​eriytymättömissä (cap) mesenchyme ja on vaimentua rakkula erilaistuminen ensues [17]. Six2
mRNA ilmaisu on entiseen tapaan Hoxb7
-cre, Wnt9b
kaksinkertainen transgeeniset. Samoin ureteric alkuunsa geenit, Ret
ja Wnt11
, eivät muutu merkitsevästi yliekspressiolla Wnt9b
. Erityiset säätelyä geenien mesenkyymissä vahvistaa, että siirtogeeninen Wnt9b pystyy signalointia ureteric alkuunsa indusoivan geenejä tärkeää MET ei kuitenkaan histologiset ektooppisen epitelisoitu munuaisten vesikkelit oli ilmeistä (tuloksia ei ole esitetty). Tämä viittaa siihen, että säätelyä Wnt9b
että ureteric alkuunsa riittää geeniaktivaatiota mesenkyymissä, mutta ei morfologisia erilaistumiseen munuaisten rakkulat.

Misexpression of Wnt9b häiritsee munuaistoiminnan ja mahanportin sulkijalihaksen muodostumiseen aktivoimalla kanoninen β-kateniinin signalointi

paradigma syntymässä munuaiset, että on olemassa herkkä tasapaino kantaisä itseuudistumiseen ja aktivointi erilaistumista [6], [7], [9]. Wnt9b /β-kateniinin reitin tarvitaan erilaistumiseen ja Six2 estää erilaistumista alku- vaiheessa sitoutumista. Siksi me arveltu, että kyky Six2 edistää kohtalon päätöksiä vastapäätä niistä aktivoidaan korkea β-kateniinin toiminta voisi olla yhteinen teema kehittämiseen. Testasimme tätä mahdollisuutta aktivoimalla siirtogeenisiä Wnt9b
kanssa Six2
-cre. Kaksinkertainen transgeeniset ilmaista Wnt9b
samoissa soluissa, jotka ilmentävät Six2
ja häiritä prosesseja, jotka säädellään keskitetysti munuaisissa ja muissa kudoksissa. Six2-CRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
hiirten merihädässä vieroituksen ja painon mittaukset vähennettiin 39% neljän viikon (14,5 ± 3,4 grammaa, p < 0,001) verrattuna cRE-negatiivisten Wnt9b tg /+
poikuesisaruksia (23,6 ± 0,7 grammaa). Fenotyypin analyysi osoitti, että tämä painonlaskua johtui epämuodostumia ruoansulatuskanavan ja munuaisten, kahdessa kohtaa Six2
-cre ilmentymistä (Fig. 3).}

Lukuisat kystat vaihtelevia koot olivat näkyvissä aivokuori ja ydin kaksinkertaisen heterotsygoottista munuaiset (Fig. 4, n = 11/11). Kystat olivat pääasiassa sijaitsee cortex ja ulomman ytimen ja olivat läheisen munuaistiehye alkuperää osoituksena LTL-värjäys. Kystisen sairauden oli ensimmäinen ilmeistä pian syntymän jälkeen (P7-10) proksimaalisessa segmenttien nephron (tuloksia ei ole esitetty). Nämä kaksinkertainen heterotsygoottinen eläimet osoittivat kohonnutta seerumin kreatiniinipitoisuuksia (0,652 ± 0,044, p < 0,005) verrattuna poikuekumppaniverrokista (0,119 ± 0,002) jo ~ 3 viikon iässä, mikä osoittaa vaikea munuaisten vajaatoiminta. Vanhemmat eläimiä edennyt sairaus sisälsi myös kystat johdettu enemmän distaalisesta segmenteistä lukien silmukan Henle (Tamm-Horsfall-positiivinen). Kaikilla eläimillä on pitkälle edennyt munuaisten vajaatoiminta tutkitaan, havaitsimme paljon kokoojakanavaan johdettuja kystat joka ilmaisi akvaporiini 2 tai sidottu D. Biflorus
-lectin. Koska Six2
-cre ei ilmaistu kerätä kanavaan, tämä laajentuma on todennäköisesti pitkään laajentuma enemmän proksimaalisessa segmenteissä. Läsnäolo munuaisten kystat Wnt9b
siirtogeenisiä eläimiä tukisi päätelmää, että häiriöt Wnt merkinantojärjestelmä aiheuttaa kystinen sairaus [7], [18], [19].

Vaikka munuaisten kystat olivat ole läsnä vasta syntymän jälkeen, säätelyä kanoninen Wnt signalointi oli nähtävissä E12.5 kun Six2
-cre aluksi ilmaistu. Lef1 proteiinin ekspressio lisääntyi valmiiksi putkimainen aggregaatteja ja munuaisten rakkula rakenteiden kaksinkertainen siirtogeeniset ja lisättiin edelleen lukuisissa kohdunulkoinen rakkulat muodostuu vakiintunut β-kateniinin munuaiset (N = 3, Fig. 5). Annos-reagoiva kasvu Lef1 ilmentymisen tukee julkaistut tiedot, että Wnt9b toimii, vaikka kanoninen Wnt-signalointireitin kehitysmaissa munuaisissa [7]. Puute kohdunulkoinen rakkula rakenteiden Wnt9b
transgeeniset viittaa siihen, että Wnt9b
alleeli osoittaa kohtalainen vaikutus β-kateniinin signalointi verrattuna stabiloitua β-kateniinin alleelin.

toinen fenotyyppi tavoitteena on vähentää painoa Six2-cRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
kaksinkertainen heterozygootit oli vatsahäiriötä. Keltainen lapsivesi havaittiin vatsassa kaksinkertaisen transgeeniset ja irrallisina siirtogeenittömien poikasten (n = 6, Fig. 6). Tämä osoitti, että duodenogastric refluksointia esiintyviä ja voivat olla epätavallisen mahaportin sulkijalihaksen muodostumista. Sulkijalihaksen välillä mahassa ja pohjukaissuoli oli pitkänomainen ja laajennettiin vuonna kaksinkertainen siirtogeenisissä (Fig. 6, upotus). TGFp antagonisti, Nephrocan, joka on normaalisti ilmaistaan ​​hyvin rajoitetun kuvio at E16.5, laajennettiin vuonna kaksinkertainen transgeeniset, mikä viittaa siihen, että sulkijalihaksen aluetta ei ole asianmukaisesti kiinnitetty. Tämä pitkänomainen morfologia tukivat immunohistokemiallisella värjäyksellä sileän lihaksen kerros, joka muodostaa tiheän lihasten ympäröivän seinämän mahanportin (Fig. 6 E, F). Kerta siirtogeenisiä valvontaa, paksuin lihaksisto todettiin jossa kudos esiintyy eniten supistumista klo sulkijalihaksen (linja). Vuonna kaksinkertainen siirtogeeniset, paksu muscularity havaittiin, mutta tämä alue oli sivussa alue, joka oli kaikkein ahdas.}

Mis-kuviointi vikoja havaittiin myös analysoimalla erityisiä markkereita, jotka erottaa proksimaalisen (H ^{+ /K + -ATPaasi) ja distaalisen (Alcian sininen), alueen mahassa. Proksimaalisen mahaan (corpus) sisältää H + /K + ATP-ilmentävien parietaalisoluissa jotka eivät kuulu antrumiin-pylorus alue. Päinvastoin, antrum-pylorus sisältää limakalvon soluja, jotka värjäytyvät Alcian Blue, joita ei löydy proksimaalisen alueen [20]. Kaksinkertainen transgeeniset esillä pysyviä H + /K + ATP värjäystä ja puuttuminen Alcian blue-positiivisia limakalvo antral vatsalle mahaportissa osoittaa, että distaalinen alue on väärin kuviollinen proksimaaliseen kohtalon Wnt9b
ilme. Alcian sinivärjäyksen Pikarisolujen suolistossa oli ehjä sekä yhden ja kahden hengen transgeeniset koska Six2
-cre ei ilmenny pohjukaissuoleen. Tämä mis-kuviointi viittaa siihen, samanlainen paradigman munuaisissa, kanoninen β-kateniinin signalointi määrittää yksi kohtalo, The forestomach alue, ja Six2 työvoimaosuudessa distaalinen identiteettiä. Tätä tukee ekspressiodomeenit näiden geenien koska kanoninen Wnt signalointia toimittaja osoittaa suurta aktiivisuutta vain forestomach, ja Six2
rajoittuu distaaliseen vatsa ja pylorus [13], [14].}

Jos kanoninen Wnt signalointi vastaa maha- refluksi Six2-cRE ^{tg /+
, Wnt9b tg /+
kaksinkertainen transgeeniset, niin epämuodostumat havaittu tulisi toisteta hiirimallissa, joka ilmentää stabiloitua β-kateniinin samalla toimialueella ( Ctnnb1 EX3 /+
, [21]). Jälkeen CRE aktivointi, tämä alleeli estää proteolyyttisen hajoamisen β-kateniinin ja voidaan olettaa, nostaa kanoninen Wnt signalointia suuremmassa määrin kuin Wnt9b ligandi yksinään. Koko mount in situ analyysi E12.5 mahat paljasti kolme geeniä, Grem1
, Nkx 2.5
, ja GATA3
, jotka normaalisti ilmaistaan ​​ohut nauha demarking alueella, joka tulee sulkijalihaksen (n = 8, Fig. 7). Ektooppinen ilmentyminen Wnt9b
tukahdutti BMP-antagonisti Grem1
ja transkriptiotekijä GATA3
tällä alueella, ja nämä geenit ovat edelleen vaimentua, kun β-kateniinin signaloinnin lisättiin. Annoksesta riippuva laajennus havaittiin transkriptiotekijän Nkx2.5
sekä mutantteja. Geenit, jotka olivat paikallisia yksinomaan suolistossa ( villiiniä
) tai forestomach ( BMP4
) ei muuttunut joko mutantin (tuloksia ei ole esitetty). Lisääntynyt kanoninen Wnt signalointia antral mahassa ja pylorus varmistettiin eristämällä tällä alueella ja suorittamalla kvantitatiivinen PCR. Kanoninen Wnt tavoite geenejä, jotka yläreguloituja stabiloitua β-kateniinin alleeli, Lef1
ja Axin2
, lisääntyivät myös mahanportin alueella Six2
-cre tg /+, Wnt9b tg /+ kaksinkertainen transgeeniset [ Lef1
, 2,0 ± 0,25 ja Axin2
, 1,4 ± 0,06 (n = 6)]. Yhdessä annos-reagoiva geenin ilmentymisen muutoksia havaittiin mahanportin alueella Wnt9b
transgeeniset ja vakiintunut β-kateniinin alkioita osoittavat, että lisääntynyt kanoninen Wnt signalointia häiritsee distaalinen vatsa ja mahaportin sulkijalihaksen kehittämiseen.}

keskustelu

Nämä tulokset kuvaavat uuden hiiren malli ehdollisesti aktivoi kanoninen Wnt signalointia. Wnt9b
siirtogeeni on indusoituva altistuessaan CRE rekom- ja ilmaisee GFP markkerina induktio. Lisäksi se on täysi biologinen aktiivisuus, koska se voi pelastaa Wnt9b ^{- /-
fenotyyppejä munuaisissa. Nämä hiiret ovat säilyneet meidän siirtomaa yli vuoden ja aiheuttaa Wnt9b
ilmaus siitä jalostukseen useille eri CRE kantoja. Olemme hyödyntäneet tämän uuden kannan aktivoida Wnt signalointia Six2
positiivisten solujen ja todettu haitallisia vaikutuksia munuaisissa ja mahassa.}

munuaisissa, Wnt9b erittyy ureteric alkuunsa epiteelin aiheuttavan viereiseen korkki mesenchyme progenitorisolujen aloittaa erilaistumista. Tämän tueksi mallin, meidän in vivo voitto-of-function tutkimukset osoittavat, että Wnt9b
ylössäätelee varhainen merkkiaineiden munuaisten rakkula erilaistumisen kuten Wnt4
, Fgf8
ja Pax8
. Vaikka munuaisten rakkula geenit indusoi Wnt9b
siirtogeenin, emme tarkkailla morfologisia näyttöä lisääntyneestä tai kohdunulkoinen munuaisten rakkuloiden muodostumisesta, kuten raportoitu Six2
mutantit [9]. Sen lisäksi Wnt induktiivinen signaali, tekijöitä, jotka pitää munuaisten progenitorivarastoon (esim. Six2
) on myös vaimentua kokonaan esiin munuaisten rakkula muodostumista. Six2
ilmentyminen ei muuttunut meidän Wnt9b
siirtogeenisiä ja mikä voi selittää kasvun Wnt9b ei aiheuttanut kohdunulkoinen munuaisten rakkulat. Ektooppinen induktio munuaisten rakkulan markkereita indusoi aktivaatio β-kateniinin Six2
positiivisten metanephric mesenkyymiin käyttämällä stabiloitua β-kateniinin alleelin [4], näin ollen, ero näiden kahden vahvistuksen-of-function kokeet voivat koskea, missä määrin ne aktivoivat kanoninen Wnt aktiivisuutta. Lisäksi on todennäköistä, että aktivointi kanonisen signalointi Wnt9b on metanephric mesenkyymissä indusoi palaute esto, kuten edellä muiden Wnt reagoiva kudoksissa, mikä estää induktio koko erilaistumisprosessia [22]. Viimeaikaiset tiedot tukevat tätä ajatusta palaute esto, koska Wnt9b /β-kateniinin signalointi tarvitaan paitsi erilaistumista metanephric mesenkyymikudokseen mutta paradoksaalisesti sama signaali myös tarvitaan huoltoa tai laajentamista munuaisten progenitorivarastoon [7]. Me spekuloida, että vakiintunut β-kateniinin, joka toimii alavirtaan koulutusjakson, voi ohittaa nämä sääntelymekanismeja. Näitä mahdollisuuksia voitaisiin testata tulevaisuudessa tutkimuksissa, jotka vertaavat loppupään geeniaktivaatiota munuaisten esisolut käyttämällä Wnt9b
siirtogeenin ja vakiintunut β-kateniinin voitto-of-function hiirillä.

häiriöt kanoninen Wnt-signalointireitin on osoitettu olevan tärkeitä patogeneesissä munuaisten kystinen tauti (katsaus Patel et ai. [23]). Siirtogeeniset ilmaus stabiloitua β-kateniinin tai puute APC munuaistiehyiden epiteeli johtaa munuaisten kystinen sairaus, joiden perusteella voidaan päätellä, että kohdunulkoinen kanoninen Wnt signalointi riittää cystogenesis [18], [19]. Munuaisten vajaatoiminta ja kystinen dilatation in Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ kaksinkertainen heterotsygootteja edelleen tukee oletusta, että voimistunut kanoninen Wnt signalointia aiheuttaa rakkuloita. Häiriöt kaanoniin Wnt signalointia (PCP) reitti on tärkeää myös munuaiskysta muodostumiseen [24]. Siten on mahdollista, että kystamuodostusta meidän malli ei yksinkertaisesti johtuu aktivoinnin kanoninen signalointi, mutta on seurausta häiriöitä suhteellinen tasapaino kanoninen ja ei-kanoninen signalointi. Tämän tueksi idea, geenejä, jotka mutatoitiin perinyt muotoihin kystinen tauti ( PKD1
, PKD2
, PKHD1
, Inversin
) paikallistaa ja värekarvojen ja nämä soluelimiin on äskettäin osoitettu pystyvän säätelemään tasapainoa kanoninen ja ei-kanoninen Wnt signalointia [25], [26].}

oli vaikea munuaissairaus fenotyyppi vaikka Wnt9b
mRNA ilmentyminen lisääntyy ~ 2-kertaiseksi meidän siirtogeenin, mikä osoittaa, että suhteellisen alhainen, jatkuva aktivointi tämän reitin johtaa munuaisten toimintahäiriö. Tämän tason säätelyä Wnt9b että ureteric alkuunsa käyttämällä Hoxb7
-cre ei tuottanut kystat, mikä viittaa siihen, että cystogenesis kokoojaputkissa in Six2
-cre ^{tg /+, Wnt9b tg /+ kaksinkertainen transgeeniset todennäköisesti sivuvaikutus laajentuneet putkimaisten segmenttien (tuloksia ei ole esitetty). Tämän tukemiseksi, vuonna synnytyksen jälkeinen päivä 7-10 eläimiä, kystinen tauti näkyy vain putkimaisten segmenttien proksimaalisesti kerätä kanavaan. Samanlainen PKD potilailla, siirtogeeninen hiirille kehittyi vakava munuaisten vajaatoiminta, vaikka useimmat nephrons eivät kehity kystat. Tämä herättää kysymyksen siitä, onko munuaistiehyeissä ilman avointa kystat ovat poikkeavia ja vaikuttavat merkittävästi asteittaista toiminnallinen vajaatoiminta näissä taudeissa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että aikuisten munuaistiehyiden epiteelin ilmaista Wnt9b, Frizzled reseptorit ja LRP5: stä /6 koreseptorit jotka kykenevät välittämään kanoninen Wnt signalointia vastauksena akuutin iskeemisen vahingon [27]. Tässä asetelmassa, Wnt signalointi edistää tubule korjaus- ja uudistumista. Kuitenkin Wnt signalointia aktiivisuus on myös liitetty edistämisessä munuaisfibroosin loukkaantumisen jälkeen, kuten on UUO malli [28]. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset korostavat säännellä Wnt signalointia aikuisen munuaisessa tasapainoa hyödyllisiä vastauksia, kuten korjaus /uudistaminen, ja maladaptive vasteet johtavat fibroosi ja krooninen elimen toimintahäiriötä.}

mahanportin alueella mahassa edustaa kriittisen rajan, joka erottaa mahassa suolistossa. Sulkijalihaksen sulkeminen Kun elintarvikealan bolus saapuu vatsaan mahdollistaa asianmukaisen ruoansulatusta ennen kauttakulku ohutsuoleen. Molekyylitason perustan muodostumista tämän diskreetti alueen ei ymmärretä hyvin, vaikka jotkut yksityiskohdat ovat kehittymässä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tiukka valvonta Wnt signalointi on elintärkeää kehitykselle pylorus. Canonical Wnt aktiivisuus havaitaan silmänpohjan ja ruumiin (corpus), mutta jätetty distaalisesta vatsa ja pylorus [13]. Vuonna Barx1
- /- hiirissä, vatsa on pieni, antral-corpus raja on hämärtynyt, ja siellä on agenesis mahanportin sulkijalihaksen. Elegantti kudoksen rekombinaatio tutkimukset viittaavat siihen, että nämä fenotyypit ovat seurausta menetys ilmentymisen Wnt antagonistien Sfrp1 ja Sfrp2. Koska Barx1
puute on maailmanlaajuinen vaikutuksia foregut kehittämiseen, ei ollut selvää, jos alas-säätely kanoninen Wnt toiminta sitä nimenomaisesti vaatii muodostumista pylorus. Tutkimuksemme suoremmin testannut tämän mahdollisuuden kohdistamalla kohdunulkoinen Wnt toimintaa rajatulle alueelle vain anteriorisesti pylorus kanssa Six2
-cre.

Huomasimme, että kohdunulkoinen Wnt aktiivisuus nimenomaan häiritsee muodostumista mahanportin sulkijalihaksen puuttuessa globaalin vikoja vatsassa kehittämiseen. Siten alas-säätely kanoninen Wnt toiminta edellyttää kuvio mahanportin alueella, joka erottaa mahassa suolistossa. Kohdunulkoinen ilmaus Wnt9b ligandin ja vakiintunut β-kateniinin siirtogeenisissä hiirissä voisi voittaa vaikutuksia erittyvä endogeenisten Wnt antagonistien Sfrp1 /2, sopusoinnussa ehdottama malli Kim et al [13]. Samanlaisia ​​meidän tuloksin Six2
mutanttien on heikentynyt ilmentymä Nkx2.5
ja Gremlin
, geenejä, jotka ovat tärkeitä mahaportin sulkijalihaksen kehityksen poikasen [14] , [29]. Tämä viittaa siihen, että Six2
ja Wnt
säädellä yhteinen geneettinen kaskadin oletetuilla mahanportin sulkijalihaksen. Oletamme, että tärkeä tehtävä Six2
voi olla tulkitsemaan kanoninen Wnt signaaleja eri kehitysvaiheissa yhteyksissä.

voimistunut kanoninen Wnt signalointia on myös osoitettu vaikuttavan perna ja haima kehittämiseen [30]. Tämän tueksi, perna ja haima hypoplasia havaittiin myös Six2
-cre, Wnt9b
bi-transgeenisiä hiiriä (tuloksia ei ole esitetty). Koska Six2
-cre ei ole ilmaistu näissä kudoksissa, tämä viittaa siihen, että signaalit posterior vatsan mesenchyme voi vaikuttaa perna ja haima kehityksen aikana. Tämä tukisi hypoteesia, että mahanportin alueella voi toimia järjestäjä muodostumista näiden sukuelinten. Kehityksen aikana, pernan edeltäjä soluihin väliaikaisesti liittävät mahanportin alueella, ennen niiden siirtymistä vasemmalla vatsaan, jossa ne tiivistyvät [31]. Vaikka emme havaitse Six2
-cre ilmentyminen pernassa primordium tai mesothelium, emme voi sulkea pois, että ohimenevää ilmentymistä Six2
-cre näillä alueilla on vastuussa vioista pernassa ja haima . Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan suoraan testata näitä mahdollisuuksia.

Yhteenvetona olemme kehittäneet uuden hiirimallissa, joka mahdollistaa ajallinen ja paikallinen ilmentyminen Wnt9b. Kehitysmaissa munuaisissa, siirtogeenisiä Wnt9b
voi aiheuttaa varhaisen MET-geenin ilmentymisen Six2
positiivisten munuaisten esiasteita, mutta se ei ole riittävä aktivoimaan koko erilaistumista ohjelman. Pysyvät ilmentyminen Wnt9b in Six2
positiivisten solujen johtaa munuaisten kystat ja vakava elimen vajaatoiminta. Vatsassa, ektooppinen Wnt β-kateniinin aktiivisuus mahanportin alueella muuttaa sulkijalihaksen muodostumista ja distaalinen vatsa kuviointi. Yhdessä nämä havainnot korostavat tiukka Wnt toiminnan ja viittaavat siihen, että Six2 ja β-kateniinin osallistuvat elimen kuviointi eri yhteyksissä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

eläinkokeissa oli hyväksynyt eläinten hoito ja käyttö komitea Saint Louisin yliopiston (protokolla 1460) ja St. Louis VA (protokolla 0305). Kaikki toimenpiteet, joissa eläimet olivat noudattaen institutionaalisten eläinten hyvinvointia määräykset, standardit ja politiikkaa.

Hiiret

Wnt9b
siirtogeenisiä hiiriä risteytettiin kaikkiin kolmeen eri cre riviä [32 ]. 1) β-actin- cre käytettiin ilmaisemaan Wnt9b kaikkialle (Fig. 1, [33]) 2) Hoxb7
-cre: käytettiin EGFP: tä yli-ilmentää Wnt9b sen endogeeninen sijainti munuaisissa, virtsanjohdinsilmusta bud (Fig. 2, [34]), ja 3) BAC Six2
-cre: EGFP siirtogeenin käytettiin ilmaisemaan Wnt9b eksogeenisesti mahassa ja munuaisissa (kuviot. 3, 4, 5, [ ,,,0],35]).

• PLoS ONE: hyönteisiä Bats Digest Kitiini vatsassa käyttäminen Happamat Nisäkkäiden Chitinase
• PLoS ONE: integrointi Vatsa sisältö ja vakaa isotooppi analyysit määrällisesti ruokavaliot Pygoscelid Penguins