Immunisering med det immunodominanta Helicobacter suis ureas-subenhet B inducerar partiellt skydd mot H. suis-infektion i en mus model

immunisering med den immunodominanta Helicobacter suis
ureas-subenhet B inducerar partiellt skydd mot H. suis
infektion i en musmodell
Sammanfattning
Helicobacter
(H.
) suis
är en svin och mänsklig gastric patogen. Tidigare studier i möss visade att en H. suis
infektion inte resulterar i skyddande immunitet, medan immunisering med H. suis
hel-cell-lysat (lysat) skyddar mot en efterföljande experimentell infektion. Därför var tvådimensionell gelelektrofores av H. suis
proteiner utförs, följt av immunoblotting med sammanslagna sera från H. suis
- infekterade möss eller möss immuniserade med lysatet. Svag reaktivitet mot H. suis
proteiner observerades i efter infektion sera. Sera från lysat-immuniserade möss, visade dock immunreaktivitet mot totalt 19 proteinfläckar som identifierades med hjälp av LC-MS /MS. H. suis
ureas subenhet B (UreB) visade mest uttalade reaktivitet mot sera från lysat-immuniserade möss och detekterades inte med sera från infekterade möss. Ingen av de sammanslagna sera detekteras H. suis
neutrofilaktiverande protein A (NAPA). Skyddseffekten av intranasal vaccinering av BALB /c-möss med H. suis
UreB och Napa, både rekombinant uttryckt i Escherichia coli
(rUreB och rNapA, respektive), jämfördes med den av H. suis
lysatet. Alla vacciner innehöll choleratoxin som adjuvans. Immunisering av möss med rUreB och lysat inducerade en signifikant reduktion av H. suis
kolonisering jämfört med icke-vaccinerade H. suis
-infekterade kontroller, medan rNapA hade ingen signifikant skyddande effekt. Förmodligen, en kombination av lokala Th1 och Th17 responser, kompletterat med antikroppssvar spelar en roll i skyddande immunitet mot H. suis
infektioner.
Introduktion
Helicobacter
(H.
) suis
är en världsomfattande spridning av patogener, främst kolonisera grisar. En infektion med denna gramnegativ bakterie har förknippats med sår i magsäcken icke-körtelslemhinnan [1, 2] och orsakar gastrit och minskad daglig viktökning [3] i grisar. H. suis
är också de vanligaste icke-Helicobacter pylori Helicobacter
arter i människor som lider av magsjukdomar [2] och grisar kan tjäna som en källa till H. suis
infektioner för människor [2, 4 ]. Kontroll av H. suis
infektioner av antibiotikabaserad terapi rekommenderas inte delvis på grund av en ökad risk att utveckla förvärvad antibiotikaresistens hos H. suis
stammar och i bakterier som hör till den normala svin floran [5]. Immunisering mot H. suis
kan därför utgöra ett värdefullt alternativ. Hittills dock få studier har behandlat vaccination mot denna svin och zoonotisk patogen.
Tidigare studier i en musmodell visade att en H. suis
infektion inte resulterar i skyddande immunitet, medan vaccinering baserat på homolog (H. suis
) eller heterologa (H. bizzozeronii
eller H. cynogastricus
) hel-cellysat inducerade en minskning eller till och med fullständig clearance av gastric kolonisering med H. suis
[6]. Emellertid har användningen av denna typ av vacciner har nackdelar, inklusive den mödosamma in vitro kultur av H. suis
, vilket resulterar i svårigheter att producera tillräckligt med antigen. Dessutom kan hela-cellysat innehålla både skyddande antigener och antigener undertrycker skydd [7]. Ett effektivt subenhetsvaccin kan vara ett bra alternativ för kontroll av H. suis
infektioner. Immunoproteomics är en lämplig metod för snabb identifiering av kandidatproteiner för vaccination och har använts för att studera och utveckla subenhetsvacciner för ett brett spektrum av patogener [8].
Det var syftet med denna studie att välja H. suis
proteiner som kan inducera skyddande immunitet mot H. suis
infektion. Därför, H. suis
proteiner som känns igen av sera från möss som immuniserats med H. suis
hel-cell-lysat och skyddas mot infektion identifierades genom användning av två-dimensionell (2D) gelelektrofores följt av immunoblotting och LC-MS /FRÖKEN. Sera av H. suis
- infekterade möss också, eftersom en infektion inte resulterar i skydd. Baserat på denna analys immun H. suis
ureas subenhet B (UreB) valdes för ytterligare in vivo-testning. Som en kontroll vi inkluderat H. suis
neutrofil-aktiverande protein A (NaPA), vilken tidigare har beskrivits som en möjlig virulensfaktor [9] men var inte igen av sera från möss som immuniserats med helcells-lysatet. Därefter skyddseffekten mot en H. suis
infektion av både subenhetsvacciner utvärderades och jämfördes med den hos H. suis
lysat i ett standardiserat musmodell.
Material och metoder
Bakteriestam
I alla experiment, H. suis
stam 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) användes. Denna stam isolerades från magslemhinnan av en gris i enlighet med den metod som beskrivs av Baele et al. [10] Djur
.
En vecka före initieringen av experimenten, fem veckor gamla specifik patogen -fri kvinnliga BALB /c-möss erhölls från en auktoriserad uppfödare (Harlan, Horst, Nederländerna). Djuren inhystes på steriliserade träspån i filtertoppen burar. De matades med en autoklav kommersiell diet (Teklad 2018S, HARLAN) och fick autoklaveras vatten efter behag
. Alla laboratorie djurförsök godkändes av Animal Care och etikkommittén vid fakulteten för veterinärmedicin, Ghent University.
Immunoproteomics av ​​H. suis
Tvådimensionell gelelektrofores (2D-PAGE) katalog HS5 odlades som beskrivits tidigare [11]. Bakterier skördades genom centrifugering (5000 g
, 4 ° C under 10 min) och tvättades fyra gånger med Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Totala proteiner (både lösliga och olösliga proteiner) extraherades i två steg med hjälp av ReadyPrep ™ Sekventiell Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. För att erhålla goda 2D-PAGE resultat ades homogen behandlades med lämpliga tillsatser (5 mg proteashämmare cocktail, en mikroliter DNas I, 1 mikroliter RNAs A, 10 mikroliter fosfatasinhibitorer PP2 och PP3 (Sigma-Aldrich, Stein, Tyskland) ). Slutligen tillsattes proteinkoncentrationen bestämdes med användning av RC DC
Protein Assay (Bio-Rad) och proteinerna vid -70 ° C tills vidare användning lagras. Totalt 100 pg av HS5-proteiner rehydrerades i 200 mikroliter rehydrering buffert (7M urea, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% bärare amfolyt pH3-4, 100 mM ditiotreitol (DTT) och bromfenolblått). Prover passivt absorberas i en ReadyStrip (11 cm, pH 3 till pH 10, Bio-Rad) och iso-elektrisk fokusering utfördes i en Protean lEF avdelningen (Bio-Rad) såsom beskrivits tidigare [12]. Efter iso-elektrisk fokusering, var remsorna jämvikt under 15 minuter i 1,5% DTT i ekvilibreringsbuffert (50 mM TrisHCl, pH 8,8 6M urea, 20% glycerol, 2% SDS) följt av en annan jämvikt i 4% jodacetamid i ekvilibreringsbuffert. Gelelektrofores utfördes på en 10% Tris-HCl SDS-PAGE med användning av 150V under 30 min, följt av 200V under 1 timme. Två geler kördes parallellt: en färgades med Sypro® Ruby Protein Gel färgning (Bio-Rad), medan den andra användes för immunblotting (se Western blotting beskrivs nedan). Före färgning, Gelerna fixerades i 10% MeOH, 7% ättiksyra. Efter färgning var H. suis
proteiner visualiserades med användning av VersaDoc Imaging System (Bio-Rad)
serumpooler
Tre pooler av mussera användes i denna studie:.

Sera från möss som immuniserats med H. suis
hel-cell-lysat (nedan kallade "lysat-immuniserade möss") (n
= 10). Dessa djur inokulerades intranasalt två gånger med tre veckors intervall med 100 mikrogram HS5 lysat + 5 mikrogram koleratoxin (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lysat framställdes såsom beskrivits tidigare men utan slutlig filtrering av supernatanten [6]. Tre veckor efter den sista immuniseringen uppsamlades blod och sera slogs samman. Denna immuniseringsprotokoll har visat sig vara (delvis) skydd mot H. suis
utmaning [6] och den skyddande effekten bekräftades här i ett preliminärt experiment (data ej visade).

Sera från H. suis
-infekterade möss (nedan kallad "infekterade möss") (n
= 10). Dessa djur inokulerades intragastriskt med 200 mikroliter Brucella buljong vid pH 5, innehållande 10 ^{8 nylagade H. suis
bakterier [11]. Fyra veckor efter infektion samlades blod och sera slogs samman.}

Sera från negativa kontrollmöss (n
= 10). Dessa djur erhöll HBSS intranasalt två gånger med en tre veckors intervall följt av intragastrisk inokulation med 200 mikroliter Brucella buljong vid pH 5 (4 veckor efter sista sken immunisering). Efter fyra veckor uppsamlades blod och sera slogs samman.
All sera vid -70 ° C tills vidare användning lagras.
Western blotting
Proteiner elektroöver från geler till nitrocellulosamembran (Bio-Rad) såsom beskrivits på annat håll [12]. Membranen blockerades i 5% skummjölk i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (blockeringsbuffert), inkuberades över natten (ON) med utspädd mussera (1/100 i blockeringsbuffert) vid rumstemperatur (RT), sköljdes i PBS med 0,3% Tween-20 (tvättbuffert) och inkuberades under 1 h vid RT med stabiliserad get-anti-mus-immunglobulin G (IgG) pepparrot-peroxidas (HRP) -konjugerad (1/1000 i blockeringsbuffert, Pierce, Rockford, IL, USA). Efter ett tvättsteg i tvättbuffert, var immundetektering av proteiner utförs av förbättrad upptäckt kemiluminescens med hjälp av supersignalen West Dura Extended Varaktighet Substrate (Pierce). Proteinmönster scannades och digitaliserades med användning av VersaDoc Imaging System. Alla experiment utfördes i triplikat.
In-gel proteinupptaget och identifiering genom masspektrometri
In-gel digestion av proteiner utfördes såsom beskrivits av Cheung et al., [13]. Före masspektrometri de isolerade peptiderna separerades på en U3000 nano högpresterande vätskekromatografi (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) såsom tidigare beskrivits [14] Identifiering av peptiderna.
Utfördes med användning av en elektrospray jonisering kvadrupol time-of-flight masspektrometri (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA) såsom beskrivits tidigare [14]. Dataanalys utfördes mot Helicobacter
proteindatabasen från NCBI (146 612 poster) med hjälp av den interna sökmotor Mascot Daemon (2,3, Matrix Science, London, UK). Ett feltolerant sökning genomfördes med carbamidomethyl (C) som fast modifikation. Carbamidomethyl (N-terminal) och oxidation (M) sattes som variabla modifieringar. Peptidmassa tolerans och fragment masstolerans var satt till 0,35 Da och 0,45 Da, respektive. Max två miscleavages tilläts. Proteiner endast anses vara korrekt kommenterad när betydelsen var under 0,05 (p
< 0,05) och åtminstone en peptid passerat de erforderliga fetstil röda kriterier från Mascot-demon, vilket tyder på att åtminstone en peptid hade rang 1 och en signifikans under 0,05.
endimensionell gelelektrofores (1D-PAGE) och Western blotting av rUreB
1D-PAGE av 10 | j, g rekombinant H suis
ureas-subenhet B (rUreB) utfördes såsom beskrivits av Van Steendam et al., [12]. Sera förberedelse och Western blot analyser utfördes såsom beskrivits ovan.
Skyddseffekt av rekombinant H. suis
proteiner i en musmodell
Framställning av rekombinant UreB Review, en fragment som kodar för H. suis
UreB sekvens (GenBank locus tagg HSUHS5_0285) amplifierades genom PCR med användning av en Pwo-polymeras med korrekturläsning aktivitet (Roche, Mannheim, Tyskland) från DNA av HS5 (framåtriktad primer: 5'-ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 '; bakåtriktad primer: 5'-CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC -3') och klonades in i proteinexpressionsvektor pET-24d. Den rUreB uttrycktes i E. coli
stam BL21 (DE3). Cellerna lyserades genom sonikering (5 gånger i 30 s) i buffert innehållande 50 mM Na.PO 4 pH7, 0,5 M NaCl, 1 M DTT, 1% Triton X-100 och 1 mM PMSF. Efter centrifugering (4 ° C, 20 000 g
under 30 min), fram rUreB renades från den lösliga fraktionen med användning av Ni-affinitetskromatografi i buffert bestående av 1 M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mM imidazol och 10% glycerol (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sverige) följt av gelfiltrering på en Superdex ™ 200 HR 16/60 kolonn (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Efter rening erhölls rUreB analyserades med användning av SDS-PAGE och Western blot-analys med användning av anti-hexahistidin-tagg mus monoklonal antikropp (Icosagen Cell Factory, Tartu, Estland). Detergenten Triton X-100 avlägsnades från det renade rUreB genom att använda Pierce Detergent Removal Spin-kolonner (Pierce) efter tillverkarens instruktioner. Proteinkoncentrationen bestämdes med RC DC
protein Assay (Bio-Rad) Framställning.
Av rekombinant NaPa
proteinet uttrycktes i E. coli
Expression System med Gateway® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) enligt följande. Ett fragment som kodar för H. suis
neutrofil-aktiverande protein A (NaPA) -sekvens (GenBank locus tagg HSUHS5_0014) amplifierades genom PCR med användning av en Pwo-polymeras med korrekturläsning aktivitet (Roche) från DNA av HS5 (framåtriktad primer: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 ', omvänd primer: 5'TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3') och klonades in i pENTR ™ /TEV /D-TOPO® vector och överfördes in i pDEST17 ™ destinationsvektor. Den valda pDEST17-NaPa plasmiden transformerades till BL21-AI ™ E.coli
och därefter odlades vid 37 ° C till en OD 600 av 0,6-1,0 i Luria Broth som kompletterats med 50 mikrogram /ml karbenicillin. Rekombinant H. suis
Napa (rNapA) expression framkallades genom att tillsätta 0,2% L- arabinos. Efter 4 h inkubation vid 37 ° C, skördades cellerna och återsuspenderades i lysbuffert: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lysozym, 20 mikrogram /ml DNAse, 1 mM proteasinhibitor (Sigma) och 1 mM MgCl 2. Cellerna lyserades genom sonikering (5 gånger under 30 s). Celldebris och inklusionskroppar isolerades genom centrifugering vid 4 ° C (20 000 g
under 30 min). Inklusionskropparna tvättades därefter två gånger baserat på följande protokoll: pelleten återsuspenderades i kall lysbuffert, sonikerades 5 gånger under 30 s, följt av centrifugering (4 ° C, 20 000 g
under 30 min). De tvättade inklusionskropparna solubiliserades i bindningsbuffert, pH 8 (6 M guanidium-HCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazol, 1 mM β-merkaptometanol) genom försiktig rotation under 1 h vid RT. Olösligt material avlägsnades genom höghastighetscentrifugering vid 4 ° C (100 000 g
under 30 min). rNapA renades från den klarnade supernatanten på en Ni-Sepharose-kolonn (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) enligt tillverkarens instruktioner. rNapA eluerades med elueringsbuffert, pH 8 (8 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazol, och 1 mM β-merkaptoetanol) och ON dialyserades mot PBS vid 4 ° C. Efteråt blev rNapA analyseras med hjälp av SDS-PAGE och proteinkoncentrationen bestämdes med användning av RC DC
Protein Assay (Bio-Rad).
Immunization och infektionsexperiment
experimentella utformningen sammanfattas i Figur 1. Fem grupper av 10 möss intranasalt inokulerades två gånger med 3 veckors intervall, varje gång med 17,5 mikroliter inokulat. I grupper 1, 2 och 3 bestod inokulum av HBSS med 5 | j, g CT, innehållande 30 ug rUreB, 30 | j, g rNapA och 100 | j, g HS5 lysat, respektive. Grupperna 4 (sham-immuniserad grupp) och 5 (negativ kontrollgrupp) inokulerades med HBSS. Tre veckor efter den andra intranasala immuniseringen samlades blod genom svans blödning från fem djur per grupp och en vecka senare, alla djur, utom den negativa kontrollgruppen, ympades intragastriskt med 200 mikroliter Brucella buljong vid pH 5 innehållande 10 8 livskraftiga H. suis
bakterier [11]. Den negativa kontrollgruppen inokulerades intragastriskt med 200 mikroliter Brucella buljong vid pH 5. Fyra veckor efter intragastrisk ympning möss avlivades genom cervikal dislokation efter isoflurananestesi (IsoFlo, Abbott, IL, USA). Från euthanized djur uppsamlades blod genom sterilhjärtpunktion, centrifugerades (1000 g
, 4 ° C, 10 min) och serum frystes vid -70 ° C tills vidare användning. Magarna skärs ut och dissekerades längs den större krökningen. Hälften av magarna, inklusive antrum och fundus, placerades omedelbart i en ml RNA Senare (Ambion, Austin, TE, USA) och lagrades vid -70 ° C under ytterligare RNA- och DNA-extraktion. En längsgående remsa av den gastriska vävnaden skars från matstrupen till duodenum längs den större krökningen för histopatologisk undersökning. Figur 1 Experimentell utformning av vaccinationsstudien. Per grupp 10 möss intranasalt immuniserade två gånger med 3 veckors intervall, varje gång med 30 | j, g rUreB + 5 | j, g koleratoxin (CT); 30 mikrogram rNapA + 5 mikrogram CT, och 100 mikrogram HS5 lysat + 5 mikrogram CT (grupperna 1, 2 och 3, respektive). Grupperna 4 (sham-immuniserad grupp) och 5 (negativ kontroll grupp) intranasalt inokulerades med HBSS. Tre veckor efter den andra immuniseringen, samlades blod från 5 möss per grupp och en vecka senare möss i grupperna 1, 2, 3 och 4 var intragastriskt ympades med 108 livskraftig H. suis
bakterier. Grupp 5 var intragastriskt inokulerades med HBSS. Fyra veckor efter intragastrisk utmaning mössen avlivas.
Kvantifiering av H. suis
i magen
Efter upptining var magen vävnader homogeniserades (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Tyskland) i 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Nederländerna) och DNA extraherades från inter- och organiska fasen enligt Tri Reagent® RT tillverkarens instruktioner. Bakteriehalten i magen bestämdes med användning av den tidigare beskrivna H. suis
specifik kvantitativ realtids-PCR (qPCR) [5] Analys av magen cytokinrespons
Expressionsnivåerna av IFN-γ.
, IL-4, IL-10, IL-17 och TNF-α bedömdes av qPCR användning av cDNA syntetiserade från magvävnad såsom beskrivits tidigare [15]. Tröskelcykeln (Ct) värdena normaliserades till det geometriska medelvärdet av CT-värdena från referensgener, varefter normaliserade mRNA-nivåer beräknades med hjälp av två -ΔΔCt metod [16].
Mätning av serumantikroppssvar genom enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA)
Protein Detector ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) användes för att utvärdera rUreB-, rNapA- och HS5 lysat specifik IgG i serum. I korthet var 96 brunnars flatbottnade plattor (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA) belades med 2 | ig /brunn av renat rNapA, 1 ug /brunn av renat rUreB, eller 1 | ig /brunn av H. suis
hela cellproteiner späddes i 100 | il beläggningsbuffert (24 h, 4 ° C). Efter blockering med 1% bovint serumalbumin i PBS tillsattes 100 | il av 1/400 utspätt serum sattes till varje brunn. Efter ytterligare tvättning, 100 mikroliter av HRP-märkt anti-mus-IgG (H + L) i en slutkoncentration av 50 ng per brunn tillsattes. Fem minuter efter tillsats av 2,2'-azino-bis (3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra) (ABTS) peroxidassubstrat-lösning, var absorbansen avlästes vid 405 nm (OD 405 nm).
Histopatologisk undersökning
de längsgående gastric vävnadsremsor fixerades i 4% fosfatbuffrad formaldehyd, behandlas av standardprocedurer och bäddas in i paraffin. För utvärdering av gastrit, hematoxylin - eosin (HE) färgade sektioner av 5 ^ m blint poängsätts baserat på graden av infiltrerande lymfocyter, plasmaceller och neutrofiler, med användning av en visuell analog skala liknande den Uppdaterad Sydney System (på en skala från 0- 3) [17] med följande specifikationer för varje gastrit poäng: 0 = ingen infiltration av mononukleära och /eller polymorfonukleära celler; 1 = mild diffus infiltration av mononukleära och /eller polymorfonukleära celler; 2 = måttlig diffus infiltration av mononukleära och /eller polymorfonukleära celler och /eller närvaron av en eller två inflammatoriska aggregat; 3 = markerad diffus infiltration av mononukleära och /eller polymorfonukleära celler och /eller närvaron av åtminstone tre inflammatoriska aggregat.
Statistisk analys
normalitet och varians homogenitet av data analyserades med hjälp av D'Agostino-Pearson och Shapiro- Wilk normalitet test. Signifikanta skillnader i H. suis
kolonisering och mRNA cytokinexpression bland grupper bedömdes genom att utföra en-vägs ANOVA analys. Bonferroni multipla jämförelsetest användes som post-hoc när lika vari bedömdes. Dunnetts T3 post-hoc-test användes när inga lika varianser bedömdes. OD 405nm nivåer från ELISA och histologiska inflammations poäng jämfördes genom Kruskall-Wallis-analys, följt av en Mann-Whitney U
test. För korrelationer mellan olika variabler, var Spearmans rho koefficient (ρ
) beräknas. GraphPad Prism5 programvara (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) användes för alla analyser. Statistiskt signifikanta skillnader mellan grupperna ansågs vid p Hotel < 0.05.
Resultat
Immunoproteomics av ​​H. suis
H. suis
proteiner separerades på 2D-PAGE (figur 2a). Efter 2D-immunoblotting med sammanslagna sera från lysat-immuniserade (figur 2b) eller H. suis
infekterade djur (Figur 2c), var en totalt 19 immunoreaktiva proteinfläckar vald. Dessa fläckar matchades med proteinfläckar som kan ses i den parallella 2D-PAGE (figur 2a). Liten reaktivitet mot H. suis
proteiner observerades i efter infektion sera jämfört med den höga reaktivitet mot sera från lysat-immuniserade möss. När blotten sonderades med en pool av sera erhållna från negativa kontrollmöss ades inga specifika immunreaktiva proteinfläckar detekteras (Ytterligare fil1). Fläckar av intresse (n
= 19) skars ut från gelén, digererades och identifierades med hjälp av LC-MS /MS-analys. De detaljerade resultaten av dessa proteiner är sammanfattade i Tabell 1. Ställen med den högsta reaktiviteten (spot 1-5) identifierades som UreB. H. suis
chaperonin GroEL, illustrerad som fläckar 9 och 10 på figur 2a visade också stark hybridisering med sera från lysat-immuniserade djur. Dessutom, sera från lysat-immuniserade möss visade stark reaktivitet mot ureas tillbehörsprotein (UreH) och ureas-subenheten A (urea) (fläckarna 15-19), vilket var mindre uttalad i den infekterade gruppen. Svag reaktivitet mot huvudflagellin Flaa (fläckar 11-13) var närvarande i båda blottar. Figur 2 H. suis 2D-proteomet profilen (A) och Western-blottar av en dubblett 2D-gel reagerade med sammanslagna sera från lysat-immuniserade möss (B) eller H. suis infekterade möss (C). 100 | j, g av totalt protein extrakt av H. suis
separerades genom 2D-elektrofores med användning av linjär pH 3 till 10 gradient i den första dimensionen och 10% TrisHCl SDS-PAGE i den andra dimensionen. De separerade proteinerna detekterades genom SYPRO®Ruby Protein färgning. De inramade områdena anger var immunoreaktiva antigener skars ut från gelén och utsattes för LC-MS /MS. Identifierade proteiner indikeras av punktnummer som anges i tabell 1. Lådor och siffror i rött identifierades som UreB. Positionen för molekylvikt (MW) ges till höger, och pH-värdet ges i botten.
Tabell 1 immunoreaktiva proteiner av H. suis identifieras genom LC-MS /MS
Spot no.1
vid Protein namn
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
Nej matchade peptider
Mascot score4
Cov. (%) 5
en
Ureas subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
117
1589
72
2 Review Ureas subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
80
1042
58
treonyl-tRNA-syntetas
EFX41598
operationer
6,34
69,315
7
186
60
3
Ureas subenhet B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
80
903
46 4
Ureas subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
4
103
6
5
Ureas subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967 4
103
6
6
30S ribosomala proteinet S1
EFX42427
rpsA
8,29
64,051
23
625
28
kinon reaktiva Ni /fe hydrogenas, stora subenheten
EFX41851
hydB
8,22
64,943
19
520
28
Ureas H. heilmannii
AAA65722
8,86
25,844
8
258
26
7
metyl-accepterande kemotaxi protein
EFX43528
7,1
48,907
35
905
50
8
förlängningsfaktor G
EFX41637
Fusa
5,15
77,242
57
1066
55
9
chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10
chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
135
2647
73
Ureas subenhet B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
43
682
41
11
flagellin A
EFX41982
Flaa
7,77
54,232
29
756
47
12
flagellin A
EFX41982
Flaa
7,77
54,232
57
1294
62
13
flagellin A
EFX41982
Flaa
7,77
54,232
46
1085
63
Trigger faktor
EFX42378
tig
vid 5,13
49,587
12
343
24
14
hydrogenase uttryck /bildande protein
EFX41790
HYPB
5,59
27,617
15
314
35
nicotinate-nukleotid pyrofosforylas
EFX42191
NADC
6,46
30,591
11
219
25
7-alfa-hydroxisteroid-dehydrogenas
EFX41880
6,62
28,246
6
186
24
konserverat hypotetiskt utsöndrat protein
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
hypotetiskt protein HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
peroxiredoxin
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
Ureas accessoriskt protein
EFX42255
ureH

6,79
30,447 4
106
13
16
Ureas subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
24
270
55
17
Ureas subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
28
112
45
18
Ureas subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
57
418
69
19
Ureas subenhet A
EFX42255
urea
7,79
27,389
75
568
73
en proteinfläck som motsvarar position på gel och blottar ( se figur 2) katalog 2NCBI
.. National Center for Biotechnology Information
3 Teoretisk isoelektrisk punkt (pl) och molekylvikt (MW) Review 4 för Helicobacter
data Mascot poäng mer. än 40 är signifikant (p
≤ 0,05).
5% av proteinsekvensen som omfattas av de peptider som identifierats Bekräftelse av serum reaktivitet mot rUreB
från 2D-analys.
, UreB visade distinkt reaktivitet med sera från lysat-immuniserade möss, som inte observerades i sera från icke-immuniserade men infekterade möss. För att bekräfta dessa data var en 1D-PAGE laddad med rUreB utförs, följt av immunodetektion med sera från lysat-immuniserade och H. suis
-infekterade möss. 0,01. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Karakterisering av genuttryck profiler för olika typer av mastceller poolats från mus magen underregioner av ett RNA amplifieringsmetod
• Kliniskt patologiska egenskaper och prognostisk analys av Lauren klassificering i magcancer i Kina