Immunization mat der immunodominant Helicobacter sinn urease subunit B induces partiell Schutz géint H. sinn Wonn an enger Maus Modell

Immunization mat der immunodominant Helicobacter sinn VerfÜgung urease subunit B induces partiell Schutz géint H. sinn VerfÜgung Wonn an enger Maus Modell VerfÜgung méiglech VerfÜgung Helicobacter VerfÜgung (H. VerfÜgung) sinn VerfÜgung ass engem porcine a mënschlech gastric pathogen. Virdrun Studien am Mais gewisen, datt en H. sinn VerfÜgung Wonn net zu Schutzpatrounin excellence heescht Resultat hierkommen immunization mat H. sinn VerfÜgung ganzt-Zell lysate (lysate) schützt géint eng Kierzunge experimentell Wonn. Dofir, war zwee-Dimensiounen gelies electrophoresis vun H. sinn VerfÜgung Proteinen duerno Leeschtung vun der hinzeginn Sera vum H. sinn VerfÜgung immunoblotting - Krankheet Mais oder Mais mat lysate immunized. Schwaach ofbaubar géint H. sinn VerfÜgung Proteinen war am Post-Wonn Sera observéiert. Sera aus lysate-immunized Mais, awer, awer immunoreactivity géint eng Total vun 19 FAQ Flecken déi LC-MS /MS identifizéiert sech benotzt. Den H. sinn VerfÜgung urease subunit B (UreB) zougedréckt stäerkste ausgeschwat ofbaubar géint Sera aus lysate-immunized Mais a war net mat Sera vum Personal Mais fonnt. Keen vun den hinzeginn Sera fonnt H. sinn VerfÜgung neutrophil-activating FAQ A (Ech wor). D'Schutz- Efficacitéit vun intranasal Impfpass vun BALB /c Mais mat H. sinn VerfÜgung UreB an de Bak, souwuel recombinantly ausgedréckt an Escherichia belaascht VerfÜgung (rUreB an rNapA, bzw.), war mat deem vun H. sinn VerfÜgung Verglach lysate. All Impfstoffer als adjuvant enthale choleratoxin. Immunization vun Mais mat rUreB an lysate engem däitleche Minus vun H. entschlof sinn VerfÜgung Kolonisatioun am Verglach zu Net-vaccinated H. sinn VerfÜgung Kontrollen -infected hierkommen rNapA kee groussen Schutzpatrounin Wierkung haten. Wahrscheinlech, eng Kombinatioun vun lokal Th1 an Th17 Äntwerte, kënnt vun antibody Äntwerte spillen eng wichteg Roll an der Schutzpatrounin excellence géint H. sinn VerfÜgung Aids. VerfÜgung Erschléisse VerfÜgung Helicobacter VerfÜgung (H. VerfÜgung) sinn VerfÜgung ass eng weltwäit verbreet pathogen, haaptsächlech colonizing Schwäin. Eng Wonn mat dësem Gramm-negativ Bakterie huet mat ulcers vun der gastric Net-glandular mucosa [1, 2] a bewierkt gastritis a rofgaang Dag Gewiicht kréien [3] an Schwäin assoziéiert gouf. H. sinn VerfÜgung ass och déi verwandelt Net-Helicobacter pylori Helicobacter VerfÜgung Arten am Mënschen aus gastric Krankheete leiden [2] an Schwäin déngen kann als Quell vun H. VerfÜgung Aids fir Mënschen sinn [2, 4 ]. Kontroll vun H. sinn VerfÜgung Aids vun Antibiotike-baséiert Therapie ass net deelweis wéinst eng fräi Risiko vun antimicrobial Resistenz zu H. sinn VerfÜgung analyséieren Qualifikatiounen recommandéiert Entwécklungslänner an Bakterien op der normal porcine microbiota gehéiert [5]. Immunization géint H. sinn VerfÜgung kann also eng wäertvoll Alternativ vertrieden. Bis elo un, allerdéngs puer Studien mat Impfpass traitéiert hunn géint dës porcine an zoonotic pathogen. VerfÜgung virdrun Studien an enger Maus Model gewisen, datt en H. sinn VerfÜgung Wonn net zu Schutzpatrounin excellence heescht Resultat hierkommen Impfpass baséiert op homologous (H. sinn VerfÜgung) oder heterologous (H. bizzozeronii VerfÜgung oder H. cynogastricus VerfÜgung) ganzt-Zell lysate eng Reduktioun oder esouguer komplett Minnen vun gastric Kolonisatioun mat H. sinn VerfÜgung entschlof [6]. Allerdéngs huet d'Benotzung vun dëser Zort vun Impfstoffer Nodeeler, dorënner d'Aarbechten iwwer kënschtlech Kultur vum H. sinn VerfÜgung, déi an Schwieregkeeten Resultater genuch antigen ze produzéieren. Och, ganzt-Zell lysates souwuel Schutzpatrounin antigens an antigens enthalen suppressing Schutz [7]. An effektiv subunit Impfungen kéint eng sënnvoll Alternativ fir d'Kontroll vun H. sinn VerfÜgung Aids ginn. Immunoproteomics ass eng adäquat Approche fir rapid Identifikatioun vum Kandidat Proteinen fir Impfpass an applizéiert gouf subunit Impfstoffer fir eng breet Palette vu pathogens [8]. VerfÜgung Et war d'Zil vun der presentéieren Etude déieren H. sinn ze studéieren an ze entwéckelen
Proteinen déi Schutz- excellence géint H. sinn VerfÜgung Wonn induce kéint. Dofir, unerkannt Proteinen H. sinn VerfÜgung vun Sera vun Mais mat H. sinn immunized VerfÜgung ganzt-Zell lysate a geschützt géint Wonn andems zwee-Dimensiounen (2D) gelies electrophoresis gefollegt vun immunoblotting an LC-MS identifizéiert goufen /MS. Sera vun H. sinn VerfÜgung - Krankheet Mais sech och, well eng Wonn net am Schutz heescht Resultat. Baséierend op dësem Analyse, VerfÜgung der immunoreactive H. sinn urease subunit B (UreB) gouf fir weider an VIVO Testen ausgewielt. Als eng Kontroll abegraff mir den H. sinn VerfÜgung neutrophil-activating FAQ A (Ech wor), deen als eng méiglech virulence Faktor beschriwwe virdrun gouf [9] mee war net vun Sera vun Mais mat ganzt-Zell lysate immunized unerkannt. Duerno, war d'Schutzpatrounin Efficacitéit géint eng H. sinn VerfÜgung Wonn souwuel subunit Impfstoffer évaluéiert an am Verglach mat deem vum H. sinn VerfÜgung lysate zu engem standardiséierte Maus Modell. VerfÜgung spontan a Methoden VerfÜgung bakteriell Deformatioun
An all Experiment, H. sinn VerfÜgung Deformatioun 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) benotzt gouf. Dëst Deformatioun vum gastric mucosa vun engem Schwäin no der Method vum Baele et al beschriwwen isoléiert huet. [10]. VerfÜgung Déieren VerfÜgung Eng Woch virun der Initiatioun vun den Experimenter, fënnef-Woch-al spezifeschen-pathogen -free weiblech BALB /c Mais sech aus eng autoriséiert Ziichter (Harlan, Horst, Holland) kritt. D'Déiere goufen op goen Holz shavings zu filter erop Käfeg waren. Si goufen mat enger autoclaved kommerziell Ernährung (TEKLAD 2018S, Harlan) z'iesse a Waasser ad libitum VerfÜgung autoclaved dobäi. All Labo Déier Experiment vun den Déieren Care an Ethik Comité vun der Fakultéit vun Veterinary Medezin, Gent University guttgeheescht. VerfÜgung Immunoproteomics vun H. sinn
Zwee-Dimensiounen gelies electrophoresis (2D-PAGE) VerfÜgung HS5 war virdrun ëmschriwwen ugebaut [11]. Bakterien sech duerch centrifugation (5000 g VerfÜgung, 4 ° C fir 10 min) gesammelt an Katakombe véier Mol mat Hank d'equilibréiert Salz Léisung (HBSS). Total Proteinen (souwuel soluble an insoluble Proteinen) waren an zwee Schrëtt mat der ReadyPrep ™ mi Extraktioun Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) laut Hiersteller d'Instruktioune ofgebaut. Fir gutt 2D-PAGE Resultater ze kréien, huet de homogenates mat adäquate Zousätz behandelt (5 mg protease inhibitor Cocktail, 1 μL DNAse ech, 1 μL RNAse A, 10 μL phosphatase inhibitors PP2 an PP3 (Fläch-Aldrich, Steinheim, Däitschland) ). Endlech, war d'FAQ Konzentratioun mat den RC DC VerfÜgung Protein Assay (Bio-Rad) alles an Proteinen sech bei -70 ° C bis weider benotzt ginn. Eng total vun 100 μg vun HS5 Proteinen sech zu 200 μL abordablel Prellbock (7m ureum, 2M thioureum, 2% Haréi, 0,2% Ballgewënn ampholyte pH3-4, 100mM dithiothreitol (DTT) an bromophenol blo) rehydrated. Echantillon waren passively an enger ReadyStrip (11 cm, pH3 zu pH10, Bio-Rad) an ISO-elektresch opgehollen war Themeschwéierpunkten an enger Protean IEF Chamber (Bio-Rad) duerchgefouert wéi virdru beschriwwen [12]. No ISO-elektresch leeën, goufen d'Strips (urea 50mM TrisHCl, pH 8,8 6m, 20% glycerol, 2% SDS) fir 15 min an 1,5% DTT zu equilibration gefiermt equilibrated vun aneren equilibration zu 4% iodoacetamide zu equilibration gefiermt gefollegt. Gelies electrophoresis war op engem 10% duerchgefouert TrisHCl SDS-PAGE mat 150V fir 30 min, gefollegt vun 200V fir 1 h. Zwee gels waren an parallel lafen: ee war Kierchefënster mat Sypro® Rubin Protein gelies staining (Bio-Rad), während déi aner fir immunoblotting benotzt gouf (kuck Western blotting ënnendrënner beschriwwe). Virum staining, gels sech zu 10% MeOH, 7% acetic Seier fest. . No staining, goufen H. sinn VerfÜgung Proteinen mat der VersaDoc Imaging System (Bio-Rad) VerfÜgung Serum déinen visualized VerfÜgung Dräi vun dëser Etude benotzt déinen vun Maus Sera goufen:

Sera aus Mais immunized mat H. sinn VerfÜgung ganzt-Zell lysate (verdéngt als "lysate-immunized Mais" bezeechent) (n VerfÜgung = 10). Dësen Déieren huet intranasally zweemol mat dräi Wochen November mat 100 μg HS5 lysate + 5 μg Cholera- toxin (Kosovo) (Lëscht biologesch Laboratoiren Galaxy, Madison, NJ, USA) inoculated. HS5 lysate war ëmschriwwen bereet virdrun awer ouni finalen filtration vun der supernatant [6]. Dräi Wochen no der leschter immunization, Blutt war gesammelt an Sera hinzeginn goufen. Dëst immunization Protokoll gouf gewisen gin (deelweis) Schutzpatrounin géint H. sinn VerfÜgung Géigespiller [6] an d'Schutzpatrounin Effekt huet hei zu engem virleefeg Experimenter bestätegt (Donnéeën net gewisen).

Sera vum H. sinn VerfÜgung -infected Mais (n VerfÜgung = 10) (verdéngt als "Krankheet Mais" bezeechent). Dësen Déieren huet intragastrically mat 200 μL Brucella läschen um pH 5, wouvun 10 8 frësch preparéiert H. sinn VerfÜgung Bakterien [11] inoculated. Véier Wochen no Wonn, war Blutt gesammelt an Sera sech hinzeginn.

Sera aus negativ Kontroll Mais (n VerfÜgung = 10). Dës Déieren scho HBSS intranasally zweemol mat engem nolauschterer dräi Wochen duerno vun intragastric inoculation mat 200 μL Brucella läschen um pH5 (4 Wochen no leschte Geldstrof immunization). No véier Wochen, war Blutt gesammelt an Sera hinzeginn goufen.
All Sera bei -70 ° C bis weider benotzen gespäichert goufen. Western blotting
Proteinen vun gels op nitrocellulose Schläimhait electrotransferred sech (Bio-Rad) wéi soss beschriwwen [12]. Schläimhait sech virbildlech op 5% Mëllech an phosphate gefiermt Salins (PBS) (erauszesichen gefiermt), Iwwernuechtung incubated UHT (ON) mat verdënntem Maus Sera (1/100 gefiermt an erauszesichen) bei Raumtemperatur (RT), rinsed vun PBS mat 0.3% Tween-20 (wäschen gefiermt) an fir 1 h op RT incubated mat stabiliséiert Geess anti-Maus immunoglobulin G (IgG) horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated (1/1000 vun erauszesichen Prellbock, Pierce, Rockford, IL, USA). No engem wäschen Schrëtt an wäschen Prellbock, immunodetection vu Proteinen war duerch verstäerkte chemiluminescence erkennen benotzt Supersignal West Dura Grenzgänger Dauer Realitéiten (Pierce) gesuergt. Protein Musteren si gescannt a Radio der VersaDoc Imaging System benotzt. All Experiment an triplicate gesuergt. VerfÜgung A-gelies FAQ unzereegen an Identifikatioun vun Mass spectrometry VerfÜgung A-gelies Verdauung vu Proteinen Leeschtung war wéi déi vun Cheung et al beschriwwen. [13]. Virum Mass spectrometry der isoléiert peptides sech op enger U3000 Nanotechnike-héich-Performance flësseg chromatography (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) getrennt als virdru beschriwwen [14]. VerfÜgung Umeldung vun der peptides Leeschtung war eng electrospray benotzt Eegeliichten quadrupole Zäit-vun-Vol Mass spectrometry (ESI-Q-Ënnerportal) Ultima (Waters, Milford, MA, USA) wéi virdru beschriwwen [14]. Donnéeën Analyse huet géint d'FAQ Datebank VerfÜgung Helicobacter standing aus NCBI (146 612 Referenzen) benotzt déi zu-Haus Sich Moteur Maskottchen DämonmodulComment (2,3, MATRIX Science, London, UK). E Feeler tolerant Sich war mat carbamidomethyl (C) als fix Modifikatioun gesuergt. Carbamidomethyl (N-Uschloss) an oxydéiert (M) huet als Variabel Modifikatioune virbereet. Peptide Mass Toleranz an ofgesprengt Mass Toleranz war bei 0,35 Da an 0,45 Da bzw. virbereet. Maximum zwee miscleavages sech erlaabt. Proteinen sech als eenzeg richteg forcéiert ginn, wou d'Bedeitung war ënnert 0,05 (p VerfÜgung &Si besteet; 0,05) an op d'mannst ee peptide batter néideg fett rout Critèrë vun Maskottchen DämonmodulComment, wat beweist, datt op d'mannst ee peptide haten Platz 1 an eng Bedeitung ënnert 0,05. VerfÜgung One-Dimensiounen gelies electrophoresis (1D-PAGE) a Western blotting vun rUreB VerfÜgung 1D-PAGE vun 10 μg recombinant H. sinn VerfÜgung urease subunit B (rUreB) war vun Van Steendam ëmschriwwen gesuergt et al. [12]. Sera Virbereedung a Western blot analyséiert goufen ëmschriwwen virun gesuergt. VerfÜgung Schutzpatrounin Efficacitéit vun recombinant H. sinn VerfÜgung Proteinen an enger Maus Modell VerfÜgung Virbereedunge recombinant UreB VerfÜgung A ofgesprengt Zeechesaatz vum H. sinn VerfÜgung mat engem Pwo polymerase mat proofreading Aktivitéit (Roche, Mannheim, Däitschland) vun der DNA vum HS5 (vir primer UreB Haaptrei (GenBank nët Markéierung HSUHS5_0285) war vun Hinnen alleguer Implikatioune: 5'- ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA Stoffel G -3 "; ëmgedréint primer: 5'- cta GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA Série TTG AGC -3) an an d'FAQ Ausdrock Vecteure Hausdéier-24d gekloonten. D'rUreB war zu Kolibakterie VerfÜgung Deformatioun BL21 (DE3) ausgedréckt. D'Zellen sech duerch sonication (5 Mol fir 30 s) zu gefiermt wouvun 50mM Na.PO 4 pH7, 0.5M NaCl, 1 m DTT, 1% Triton X-100 an 1mM PMSF lyzed. No centrifugation (4 ° C, 20 000 g VerfÜgung fir 30 min), rUreB war vun der soluble Ëmwandlung benotzt Ni-Affinitéit chromatography zu gefiermt sidd esou aus: 1 m NaCl, 50mM PBS, 1% Triton X-100, 250mM imidazole an 10% glycerol (seng GraviTrap, GE Gesondheetswiesen Bio-Sciences AB, Uppsala, Schweden), gefollegt vun gelies filtration op engem Superdex ™ 200 HR 16/60 Kolonne (GE Gesondheetswiesen Bio-Sciences AB). No Offäll, war rUreB analyséiert SDS-PAGE a Western blot Analyse mat anti-hexahistidine-Markéierung Maus monoclonal antibody (Icosagen Zell Factory, Tartu, Estland) benotzt. D'Nodeems Triton X-100 ass aus dem sidd rUreB geläscht andems Pierce Nodeems ewechhuelen Spin Kolonnen (Pierce) folgenden Fabrikant d'Uweisungen. Protein Konzentratioun war mat der RC DC VerfÜgung FAQ Assay (Bio-Rad). VerfÜgung Virbereedunge recombinant Ech wor bestëmmt VerfÜgung d'FAQ am Expression System mat Gateway® Technology (Invitrogen VerfÜgung Kolibakterie ausgedréckt huet, Karlsbad CA, USA) wéi follegt. A ofgesprengt den H. Zeechesaatz sinn VerfÜgung neutrophil-activating engem Pwo polymerase mat proofreading Aktivitéit (Roche) vun der DNA vum HS5 (vir primer FAQ A (Ech wor) Haaptrei (GenBank nët Markéierung HSUHS5_0014) vun Hinnen alleguer Implikatioune war: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; ëmgedréint primer: 5'- TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3) an gekloonten an der pENTR ™ /TEV /d-TOPO® Vecteure an transferéiert an der pDEST17 ™ Destinatioun Vecteure. Déi gewielte pDEST17-Bak plasmid war de BL21-AI ™ Kolibakterie VerfÜgung transforméiert a spéider bei 37 ° C an en sel 600 vun 0.6-1.0 an Luria läschen ergänzt mat 50 μg /ML carbenicillin ugebaut. Recombinant H. sinn VerfÜgung Ech wor (rNapA) Ausdrock war vun Schan 0,2% L- arabinose entschlof. No 4 h incubation bei 37 ° C, goufen d'Zellen gesammelt an an lysis gefiermt resuspended: 50mM TrisHCl, 100mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ML lysozyme, 20 μg /ML DNAse, 1mM protease inhibitor (Fläch) , an 1mM MgCl 2. D'Zellen sech duerch sonication (5 Mol fir 30 s) lyzed. Zell Protokoll an Inclusioun Kierper sech duerch centrifugation bei 4 ° C (20 000 g VerfÜgung fir 30 min) isoléiert. Der Inclusioun Kierper sech zweemol dono Katakombe baséiert op den folgenden Protokoll: de PELLET war zu kal lysis gefiermt resuspended, sonicated 5 Mol fir 30 Spiller vun centrifugation duerno (4 ° C, 20 000 g VerfÜgung fir 30 min). D'Katakombe Inclusioun Kierper sech zu verbindlechen gefiermt solubilized, pH8 (6m guanidium HCl, 20mM TrisHCl, 0.5M NaCl, 5mM imidazole, 1mM β-mercaptomethanol) vun sanft Rotatioun fir 1 h op RT. Insoluble Material war bei 4 ° C (fir 30 min 100 000 g VerfÜgung) duerch héich Vitesse centrifugation geläscht. rNapA war aus der Keess supernatant op engem Ni-sepharose Kolonn sidd (Seng GraviTrap, GE Gesondheetswiesen Bio-Sciences AB) no der Taktik vum Produzent. rNapA war mat elution Prellbock, pH8 (8m urea, 20mM TrisHCl, 0.5M NaCl, 0.5M imidazole, an 1mM β-mercaptoethanol) eluted an ON dialyzed géint PBS bei 4 ° C. Uschléissend, war rNapA analyséiert SDS-PAGE an FAQ Konzentratioun alles war mat RC DC VerfÜgung Protein Assay (Bio-Rad) benotzt. VerfÜgung Immunization an Wonn Experimenter VerfÜgung D'experimentell Design zu Dorënner zesummegefaasst ass 1. Five Gruppe vu 10 Mais sech intranasally zweemol mat 3 Wochen November, all Kéier mat 17,5 μL inoculum inoculated. An Gruppen 1, 2 an 3 aus der inoculum vun HBSS mat 5 μg CT, wouvun 30 μg rUreB, 30 μg rNapA an 100 μg HS5 lysate, bzw.. Gruppen 4 (Geldstrof-immunized Grupp) a 5 (negativ Kontroll Grupp) sech mat HBSS inoculated. Dräi Wochen no der zweeter intranasal immunization, Blutt war vun Schwäif gesammelt aus fënnef Déiere pro Grupp Hals an eng Woch méi spéit, all Déieren, ausser déi negativ Kontroll Grupp, huet intragastrically mat 200 μL Brucella läschen um pH inoculated 5 mat 10 8 liewensfäeg H. sinn VerfÜgung Bakterien [11]. Déi negativ Kontroll Grupp war intragastrically mat 200 μL Brucella läschen um pH5 inoculated. Véier Wochen no der intragastric inoculation, Mais sech duerch cervical dislocation folgenden isoflurane Anästhesie euthanized (IsoFlo; Abbott, IL, USA). Vun der euthanized Déieren, Blutt war déi steril härzwierksam ofgehaangen, centrifuged (1000 g VerfÜgung, 4 ° C, 10 min) an serum war gefruer bei -70 ° C bis weider benotzen gesammelt. Mamm sech laanscht de gréissere curvature excised an Leschten. One-Halschent vun der Mamm, dorënner antrum an fundus, war direkt gesat an 1 ml RNS spéit (Ambion, Austin, TE, USA) a gespäichert bei -70 ° C fir weider RNA- an DNA-Reduktioun. A longitudinal Sträif vun der gastric Otemschwieregkeeten war vun der esophagus fir d'Ausléiser laanscht de gréissere curvature fir histopathological Examen koum. Figur 1 hun Design vun Impfpass studéieren. Per Grupp 10 Mais sech intranasally zweemol mat 3 Wochen November, all Kéier mat 30 μg rUreB + 5 μg Cholera- toxin (Kosovo) immunized; 30 μg rNapA + 5 μg CT, an 100 μg HS5 lysate + 5 μg CT (Kategorien 1, 2 an 3, bzw.). Gruppen 4 (Geldstrof-immunized Grupp) a 5 (negativ Kontroll Grupp) waren intranasally mat HBSS inoculated. Dräi Wochen no der zweeter immunization, Blutt ass aus 5 Mais pro Grupp gesammelt an eng Woch méi spéit Mais vun Gruppen 1, 2, 3 a 4 waren intragastrically mat 108 Statiounen den H. sinn VerfÜgung Bakterien inoculated. Group 5 war intragastrically mat HBSS inoculated. Véier Wochen no intragastric Erausfuerderung, Mais sech euthanized. VerfÜgung Quantification vun H. sinn VerfÜgung am Mo. VerfÜgung No thawing, Mo. Stoffer goufen homogenized (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Däitschland) an 1 ml Dräilännereck Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Holland) an DNA war vun der inter- an organesch Phase ofgebaut no Dräilännereck Reagent® RT Fabrikant d'Uweisungen. D'bakteriell Laaschten vun de Mo. alles huet mat der virdru beschriwwen H. VerfÜgung spezifesch grouss real-Zäit Hinnen alleguer (qPCR) sinn [5]. VerfÜgung Analys vun Mo. cytokine Äntwert VerfÜgung den Ausdrock Niveau vun IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17 an TNF-α sech duerch qPCR évaluéieren cDNA aus Mo. Otemschwieregkeeten Wierderbuch benotzt wéi virdru beschriwwen [15]. D'loung Zyklus (Kosovo) Wäerter waren normalized dem geometreschen menge vun der CT-Wäerter aus dem rouenden Genen no deem mRNA Niveauen normalized waren der 2 berechent benotzt -ΔΔCt Method [16]. VerfÜgung Kilometréierung vun serum antibody Äntwerte déi Aktivitéit-Hausnummeren immunosorbent assay (Elisa) VerfÜgung D'Protein heescht ™ Elisa Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) war benotzt rUreB-, rNapA-, an HS5 lysate spezifesch IgG zu serum ze diskutéieren. An dowéinst, 96 gutt flaach ënnen Placke (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Bannen., Rochester, NY, USA) sech mat 2 μg Beschichtete /och vun sidd rNapA, 1 μg /och vun sidd rUreB, oder 1 μg /och vun H. sinn VerfÜgung ganz Zell Proteinen zu 100 μL zerwéiert gefiermt verdënntem (24 h, 4 ° C). No erauszesichen war mat 1% Bovine serum albumin vun PBS, 100 μL vun 1/400 verdënntem serum fir all gutt dobäi. No weideren wäschen, 100 μL vun HRP-Label anti-Maus IgG (H + L) vun engem Finale Konzentratioun vun 50 NG pro gutt derbäi war. Fënnef Minutte der Schan 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic Seier) (ABTS) peroxidase Realitéiten Léisung, absorbance war um 405nm liesen (sel 405nm). VerfÜgung Histopathological Ënnersichung VerfÜgung d'longitudinal gastric Otemschwieregkeeten Strips goufen zu 4% phosphate gefiermt formaldehyde fix, déi Norm Prozeduren Filteren an paraffin Ënnerbewosstsinn. Fir eng Evaluatioun vun gastritis, haematoxylin - eosin (HIEN) Kierchefënster Rubriken vun 5 μm sech blann op de Supérieur Faarwen baséiert lymphocytes, Plasma Zellen an neutrophils, mat engem visuellen Analog hätte fir de Aktualiséiert Sydney System (op enger Skala vun 0- vun infiltrating 3) [17] mat der folgender Spezifikatioune fir all gastritis stoung: 0 = keng einfach vun mononuclear an /oder polymorphonuclear Zellen; 1 = mëll diffusen einfach vun mononuclear an /oder polymorphonuclear Zellen; 2 = moderéiert diffusen einfach vun mononuclear an /oder polymorphonuclear Zellen an /oder d'Präsenz vun engem oder zwee demagogesch Bodrum; 3 = markéiert diffusen einfach vun mononuclear an /oder polymorphonuclear Zellen an /oder d'Präsenz vun op d'mannst dräi demagogesch Bodrum. Statistique Analyse VerfÜgung Zukunft an Varianz homogeneity vun Donnéeën VerfÜgung analyséiert huet andems D'Agostino-Pearson an Shapiro- Wilk Normalitéit Test. Differenze zu H. sinn VerfÜgung Kolonisatioun an mRNA cytokine Ausdrock tëschent Gruppe waren duerch leeschtungsfäeg Analyse eent-Manéier ANOVA évaluéieren. Bonferroni d'Pluralitéit Verglach Test war den Post-hoc benotzt wann selwecht variances évaluéieren goufen. DUNNETT d'T3 Post-hoc Test benotzt gouf, wou kee gläich variances évaluéieren goufen. Sel 405nm Niveau vun Elisa a histological inflammation Fändelen sech am Verglach zur Kruskall-Wallis Analyse, gefollegt vun engem Mann-Whitney U VerfÜgung Test. Fir kennenzeléieren tëscht verschiddene Verännerlechen, Spearman d'Rho souguer gemaach ginn (ρ VerfÜgung) war berechent. GraphPad Prism5 Software (GraphPad Software Galaxy San Diego, CA, USA) war fir all Analysë benotzt. Statistesch relevant Ënnerscheeder tëscht Gruppen waren um p VerfÜgung &Si besteet considéréiert; 0,05. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Immunoproteomics vun H. sinn
H. sinn VerfÜgung Proteinen op 2D-PAGE (Dorënner 2a) getrennt goufen. No 2D-immunoblotting mat hinzeginn Sera aus lysate-immunized (Dorënner 2b) oder H. sinn VerfÜgung -infected Déieren (Dorënner 2C), goufen am Ganzen 19 immunoreactive FAQ Flecken ausgewielt. Dës Flecken sech mat der FAQ Flecken stemmt dass am parallel 2D-PAGE (Dorënner 2a) gesinn gin konnt. Little ofbaubar géint H. sinn VerfÜgung Proteinen war am Post-Wonn Sera observéiert Verglach zu den héije ofbaubar géint Sera aus lysate-immunized Mais. Wann der blot mat engem Pool vu Sera aus negativ Kontroll Mais, keng spezifesch immunoreactive FAQ Flecken goufen erwëscht (Zousätzleche file1) kritt Komedie war. Flécken vun interesséieren (n VerfÜgung = 19) huet sech aus dem gelies Géigewier, verdaut an identifizéiert vun heescht vun LC-MS /MS Analyse. Déi detailléiert Resultater vun dësen Proteinen sinn an Table 1. Flecken mat der héchster ofbaubar (Plaz 1 bis 5) zesummegefaasst huet als UreB identifizéiert. H. sinn VerfÜgung chaperonin GroEL, wéi Flecken illustréiert 9 an 10 op Dorënner 2a, awer och staark hybridization mat Sera aus lysate-immunized Déieren. Ausserdeem, Sera aus lysate-immunized Mais awer staark ofbaubar géint d'urease Accessoire FAQ (UreH) an der urease subunit A (UreA) (Flecken 15 bis 19), déi zu der Krankheet Grupp manner ausgeschwat gouf. Schwaach ofbaubar géint déi grouss flagellin FlaA (Flecken 11 bis 13) war och präsent an zwee blots. Figur 2 H. sinn 2D-proteome Profil (A) a Western blots vun engem zweete 2D-gelies geklot mat hinzeginn Sera vun lysate-immunized Mais (B) oder vun H. sinn -infected Mais (C). 100 μg vun insgesamt FAQ Extrait vum H. sinn VerfÜgung war vun 2D-electrophoresis benotzt linear pH3 to10 Temperaturgefäll am éischte Volet an 10% TrisHCl SDS-PAGE an der zweeter Dimensioun getrennt. D'getrennt Proteinen sech duerch SYPRO®Ruby Protein staining fonnt. D'Statue Beräicher uginn wou immunoreactive antigens vum gelies an ënnerworf zu LC-MS /MS excised goufen. Identifizéiert Proteinen gi vun der Plaz Zuelen an Table 1. Këschte an Zuelen an rout entscheet uginn huet den UreB identifizéiert. D'Positioun vun molekulare Gewiicht (MW) ass op de Recht kritt, an de pH ass bei der leschter entscheet. VerfÜgung Table 1 Immunoreactive Proteinen vun H. sinn duerch LC-MS /MS VerfÜgung icon_thumright Platz 1 identifizéiert
zu Protein Numm
NCBI ID2
Gene
pI3
MW3
Nr iwwereneestëmmen peptides
Maskottchen score4
Cov. (%) 5
1 VerfÜgung Urease subunit B VerfÜgung EFX42254 VerfÜgung ureB
5,97 VerfÜgung 62,967 VerfÜgung 117 VerfÜgung 1589 VerfÜgung 72
2 VerfÜgung Urease subunit B VerfÜgung EFX42254 VerfÜgung ureB
5,97 VerfÜgung 62,967 VerfÜgung 80 VerfÜgung 1042 VerfÜgung 58 VerfÜgung Threonyl-tRNA synthetase VerfÜgung EFX41598 VerfÜgung thrS
6,34 VerfÜgung 69,315 VerfÜgung 7 VerfÜgung 186 VerfÜgung 60 VerfÜgung 3 VerfÜgung Urease subunit B VerfÜgung EFX42254 VerfÜgung ureB VerfÜgung
5,97 VerfÜgung 62,967 VerfÜgung 80 VerfÜgung 903 VerfÜgung 46 VerfÜgung 4 VerfÜgung Urease subunit B VerfÜgung EFX42254 VerfÜgung ureB
5,97 VerfÜgung 62,967 VerfÜgung 4 VerfÜgung 103 VerfÜgung 6 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung Urease subunit B VerfÜgung EFX42254 VerfÜgung ureB
5,97 VerfÜgung 62,967 VerfÜgung 4 VerfÜgung 103 VerfÜgung 6 VerfÜgung 6 VerfÜgung 30S ribosomal FAQ S1 VerfÜgung EFX42427 VerfÜgung rpsA
8,29 VerfÜgung 64,051 VerfÜgung 23 VerfÜgung 625 VerfÜgung 28 VerfÜgung Quinone-reaktiv Ni /géréiert hydrogenase, grouss subunit VerfÜgung EFX41851 VerfÜgung hydB
8,22 VerfÜgung 64,943 VerfÜgung 19 VerfÜgung 520 VerfÜgung 28 VerfÜgung Urease vun H. heilmannii
AAA65722 VerfÜgung 8,86 VerfÜgung 25,844 VerfÜgung 8 VerfÜgung 258 VerfÜgung 26 VerfÜgung 7 VerfÜgung Duerch-unhuelen chemotaxis FAQ VerfÜgung EFX43528 VerfÜgung 7.1 VerfÜgung 48,907 VerfÜgung 35
905 VerfÜgung 50 VerfÜgung 8 VerfÜgung Elongation Faktor G VerfÜgung EFX41637 VerfÜgung fusA
5,15 VerfÜgung 77,242 VerfÜgung 57 VerfÜgung 1066 VerfÜgung 55
9 VerfÜgung Chaperonin GroEL VerfÜgung EFX42237 VerfÜgung groEL
5,58 VerfÜgung 58,498 VerfÜgung 150 VerfÜgung 3085 VerfÜgung 78 zu 10 VerfÜgung Chaperonin GroEL VerfÜgung EFX42237 VerfÜgung groEL
5,58 VerfÜgung 58,498 VerfÜgung 135 VerfÜgung 2647 VerfÜgung 73 VerfÜgung Urease subunit B VerfÜgung EFX42254 VerfÜgung ureB
5,97
62,967 VerfÜgung 43 VerfÜgung 682 VerfÜgung 41 zu 11 VerfÜgung Flagellin A VerfÜgung EFX41982 VerfÜgung flaA
7,77 VerfÜgung 54,232 VerfÜgung 29 VerfÜgung 756 VerfÜgung 47 zu 12 VerfÜgung Flagellin A VerfÜgung EFX41982 VerfÜgung flaA
7,77 VerfÜgung 54,232 VerfÜgung 57 VerfÜgung 1294 VerfÜgung 62 zu 13
Flagellin A VerfÜgung EFX41982 VerfÜgung flaA
7,77 VerfÜgung 54,232 VerfÜgung 46 VerfÜgung 1085 VerfÜgung 63 VerfÜgung ausléise Faktor VerfÜgung EFX42378 VerfÜgung tig
zu 5,13 VerfÜgung 49,587 VerfÜgung 12 VerfÜgung 343 VerfÜgung 24 zu 14 VerfÜgung Hydrogenase Ausdrock /Opstellung FAQ VerfÜgung EFX41790 VerfÜgung hypB
5,59
27,617 VerfÜgung 15 VerfÜgung 314 VerfÜgung 35 VerfÜgung Nicotinate-Nukleotid pyrophosphorylase VerfÜgung EFX42191 VerfÜgung nadC
6,46 VerfÜgung 30,591 VerfÜgung 11 VerfÜgung 219
25 VerfÜgung 7-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase VerfÜgung EFX41880 VerfÜgung 6,62 VerfÜgung 28,246 VerfÜgung 6 VerfÜgung 186 VerfÜgung 24 VerfÜgung Conserved hypothetesch secreted FAQ VerfÜgung EFX42511 VerfÜgung hdhA
5,84 VerfÜgung 28,011 VerfÜgung 5 zur VerfÜgung 174 VerfÜgung 19 VerfÜgung hypothetesch FAQ HSUHS5_0308 VerfÜgung EFX42276 VerfÜgung 5,47 VerfÜgung 29,471 VerfÜgung 9 VerfÜgung 171
24 VerfÜgung Peroxiredoxin VerfÜgung EFX42277 VerfÜgung 5,84 VerfÜgung 25,811 VerfÜgung 7 VerfÜgung 107 VerfÜgung 19 zu 15 VerfÜgung Urease Accessoire FAQ VerfÜgung EFX42255 VerfÜgung ureH
6,79 VerfÜgung 30,447 VerfÜgung 4 VerfÜgung 106 VerfÜgung 13 zu 16 VerfÜgung Urease subunit A VerfÜgung EFX42255 VerfÜgung ureA VerfÜgung 7,79
27,389 VerfÜgung 24 VerfÜgung 270 VerfÜgung 55 zu 17 VerfÜgung Urease subunit A VerfÜgung EFX42255 VerfÜgung ureA
7,79 VerfÜgung 27,389 VerfÜgung 28 VerfÜgung 112 VerfÜgung 45 zu 18 VerfÜgung Urease subunit A VerfÜgung EFX42255 VerfÜgung ureA
7,79 VerfÜgung 27,389 VerfÜgung 57 VerfÜgung 418 VerfÜgung 69 zu 19
Urease subunit a VerfÜgung EFX42255 VerfÜgung ureA VerfÜgung 7,79 VerfÜgung 27,389 VerfÜgung 75 VerfÜgung 568
73 VerfÜgung 1 Protein Plaz ze Positioun op gelies an blots entspriechend ( gesinn Dorënner 2) VerfÜgung 2NCBI VerfÜgung:.. National Center fir déi Informatiounen VerfÜgung 3 Theoretesch isoelectric Punkt (PI) a molekulare Gewiicht (MW) VerfÜgung 4 fir Helicobacter VerfÜgung Donnéeën, Maskottchen Fändelen grouss. wéi 40 bedeitendst (≤ 0,05 p VerfÜgung) sinn. VerfÜgung 5% vun der identifizéiert Daach FAQ Haaptrei vun der peptides. VerfÜgung Confirmatioun vun serum ofbaubar géint rUreB VerfÜgung vun der 2D-Analyse, zougedréckt UreB z'ënnerscheedde ofbaubar mat Sera aus lysate-immunized mais, déi net zu Sera aus net-immunized mä Krankheet mais observéiert gouf. Fir dës Donnéeën, eng 1D-PAGE mat rUreB iwwerlaascht ze confirméieren war gesuergt, gefollegt vun immunodetection mat Sera aus lysate-immunized an H. sinn VerfÜgung -infected Mais. 0,01. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Characterization vun der Gentherapie Ausdrock Profiler fir verschidden Zorte vu Mast hinzeginn Zellen aus Maus Mo. subregions duerch eng RNS amplification method
• Clinicopathological Beméien an prognostic Analyse vun Lauren Klassifikatioun vun gastric adenocarcinoma zu China