Imunizacija z imunodominantnim Helicobacter suis ureaze podenote B povzroči delno zaščito pred okužbo s H. suis v mišjem modelu

Imunizacija z imunodominanten Helicobacter suis
ureaze podenote B povzroči delno zaščito pred okužbo s H. suis
v mišjem modelu
Abstract
Helicobacter
(H.
) suis
je prašičjega in človeškega želodca patogen. Prejšnje študije pri miših so pokazali, da je H. suis
okužbe ne pride v zaščitni imunosti, medtem ko imunizacija s H. suis
celotnega celičnega lizata (lizat) ščiti pred kasnejšo eksperimentalno infekcijo. Zato je bila izvedena dvodimenzionalna gelska elektroforeza H. suis
proteinov sledi imunoblotanju z združenih serumov H. suis
- okuženih miši ali miši, cepljenih z lizat. Šibka reaktivnost proti H. suis
beljakovin opazili v serumih po okužbe. Sera od miši-lizat imunizirane, pa je pokazala, radioinkorporacijo zoper skupno 19 beljakovinskih madežev, ki so bile ugotovljene z uporabo LC-MS /MS. H. suis
ureaze podenota B (UreB) je pokazalo najbolj izrazit reaktivnosti proti serumov miši-lizat imuniziranih in ni bila odkrita s serumi okuženih miši. Nobena od združenih serumov zazna H. suis
-nevtrofilcev aktivira protein A (NAPA). Zaščitna učinkovitost cepljenja intranazalno za BALB /c miši s H. suis
UreB in Napa, tako rekombinantno izražene v Escherichia coli
(rUreB in rNapA oz), je bila v primerjavi s H. suis
lizat. Vsa cepiva, ki vsebuje toksin kolere kot dodatek. Imunizacija miši z rUreB in lizat jih povzroča znatno zmanjšanje H. suis
kolonizacijo v primerjavi z necepljene H. suis
okuženimi kontrole, medtem ko je imel rNapA ni pomembno zaščitni učinek. Verjetno kombinacija lokalnih Th1 in Th17 odgovorov, ki jih dopolnjujejo protiteles igrajo vlogo v zaščitne imunosti proti H. suis okužb
.
Uvod
Helicobacter
(H.
) suis
je svetovno širjenje patogenov, predvsem kolonizacije prašiče. Infekcija s tem Gram-negativne bakterije, je bila povezana z razjede želodca ni žleznega sluznici [1, 2] in povzroča gastritis in zmanjšan dnevni telesne mase [3] pri prašičih. H. suis
je tudi najbolj razširjena non-Helicobacter pylori Helicobacter
vrste pri ljudeh, ki trpijo zaradi želodčnih motenj [2], in prašiči lahko služijo kot vir H. suis
okužb za ljudi [2, 4 ]. Nadzor okužb H. suis
s terapijo, ki temelji na antibiotike ni priporočljivo deloma zaradi povečanega tveganja za razvoj pridobil protimikrobne odpornosti v H. suis
sevov in bakterij, ki spadajo v normalno prašičjim mikrobiotu [5]. Cepljenje proti H. suis
lahko zato so dragocena alternativa. Do sedaj pa je nekaj študij so se ukvarjali s cepljenjem proti temu prašiče in zoonoze patogena.
Predhodna študija v mišjem modelu pokazala, da je infekcija
H. suis nima za posledico zaščitne imunosti, ker je cepljenje, ki temelji na homologne (H. suis
) ali heterologen (H. bizzozeronii
ali H. cynogastricus
) cela-celični lizat povzroča zmanjšanje ali celo popolno pred želodca kolonizacije s H. suis
[6]. Vendar pa je uporaba tovrstnega cepiva ima pomanjkljivosti, vključno z težaven in vitro kulture H. suis
, kar ima za posledico težave, da dobimo zadostno antigen. Prav tako se lahko celotna-celični lizati vsebujejo tako zaščitne antigene in antigenov zatirati zaščito [7]. Učinkovito cepivo podenote lahko uporabna alternativa za nadzor H. suis okužb
. Immunoproteomics je ustrezen pristop za hitro identifikacijo proteinov kandidatk za cepljenje, in je bila uporabljena za študij in razvoj cepiv podenote za široko paleto patogenov [8].
To je bil cilj te študije za izbiro H. suis
beljakovine, ki lahko povzročijo zaščitno imunost proti okužbi H. suis
. Zato H. suis
proteine ​​z serumih miši imuniziranih s H. suis priznane
celotnega celičnega lizata in zaščiteni pred okužbo smo identificirali z uporabo dvodimenzionalne (2D) gel elektroforeza čemur sledi imunoblotanju in LC-MS /GOSPA. so bili vključeni tudi okuženih miši, saj okužba ne povzroči zaščito - Serumi H. suis
. Na podlagi te analize je imunoreaktivnega H. suis
ureaze podenota B (UreB) je bil izbran za nadaljnjo vivo testiranje. Kot kontrolo smo vključili H. suis
-nevtrofilcev aktivira protein A (napa), ki je bil prej opisan kot možni dejavnik virulence [9], ampak serumih miši imuniziranih s celotnega celičnega lizata ni bilo priznano. Nato je učinkovitost zaščite proti H. suis
okužba obeh cepiv podenote so ocenili in v primerjavi s tisto H. suis
lizat v standardiziranem modelu miši.
Materiali in metode
bakterijski sev
V vseh poskusih, H. suis
sev 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) je bila uporabljena. Ta sev je bil izoliran iz želodčne sluznice prašiča po metodi, ki jo Baele et al opisan. [10].
Živalski
En teden pred začetkom poskusov, pet tednov starih specifično-patogen -brezplačen samice BALB /c miši so bili pridobljeni pri pooblaščenem rejca (HARLAN, Horst, Nizozemska). Živali so bile nastanjene v sterilizirane oblanci v filter vrh kletke. So bile krmljene z avtoklaviranega komercialno prehrano (TEKLAD 2018S, Harlan) in prejetih sterilizirajo vodo ad libitum
. Vsi poskusi laboratorijskih živalih je odobril odbor za živali Nega in etiko na Fakulteti za veterino, Univerza v Gentu.
Immunoproteomics H. suis
dvodimenzionalna gelska elektroforeza (2D-PAGE)
HS5 smo gojili kot prej [11] opisano. Bakterije požanjemo s centrifugiranjem (5000 g
, 4 ° C 10 minut) in sprali štirikrat z uravnoteženim raztopino Hankovo ​​soli (HBSS). Skupaj beljakovin (tako topne in netopne beljakovine) so bili pridobljeni v dveh korakih z uporabo ReadyPrep ™ zaporedno ekstrakcijo Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Da dobimo dobre rezultate 2D-PAGE, so homogenate obdelamo z ustreznimi aditivi (5 mg zaviralca proteaz koktajl, 1 u.l DNaze 1 u.l RNazo A, 10 inhibitorji ul fosfataze PP2 in PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija) ). Na koncu je bila koncentracijo proteinov s pomočjo RC DC
Beljakovine Vsebnost (Bio-Rad) in proteine ​​smo hranili pri -70 ° C pa do nadaljnje uporabe. Skupaj 100 ig HS5 proteinov smo rehidrirane v 200 u.l rehidracije pufrom (7M ureum, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% nosilec ampholyte pH3-4, 100 mM ditiotreitola (DTT) in Bromophenol modro). Vzorci so bili pasivno absorbira v ReadyStrip (11 cm, Ph3P do PH10, Bio-Rad) in izo-električni poudarkom je bila izvedena v Protean IEF senat (Bio-Rad), kot je opisano zgoraj [12]. Po izo-električni usmerimo, so trakovi uravnotežimo za 15 minut na 1,5% DTT pri uravnoteževalnem pufru (50 mM TrisHCI, pH 8,8 6M urea, 20% glicerola, 2% SDS), čemur sledi druga ravnotežja v 4% jodacetamid pri uravnoteževalnem pufru. Gel elektroforeza je bila izvedena na 10% TrisHCI SDS-PAGE z uporabo 150V za 30 minut, čemur sledi 200V 1 h. Dva geli so potekata vzporedno: eno je obarvali z Sypro® Ruby Protein Gel barvanja (Bio-Rad), medtem ko je bila druga uporabljena za imuno (glej Western blot so opisane spodaj). Pred obarvanje so geli določen v 10% MeOH, 7% ocetne kisline. Po obarvanju so H. suis
proteini vizualizira pomočjo VersaDoc Imaging System (Bio-Rad)
serum bazeni
Trije bazeni miške serumov so bile uporabljene v tej študiji.

Sera iz miši imuniziranih H. suis
celotnega celični lizat (v nadaljnjem besedilu "-lizat imunizirane miši") (n
= 10). Te živali so inokulirali nos dvakrat s po tremi tedni intervalu s 100 ig HS5 lizat + 5 mikrogramov toksin kolere (CT) (Seznam Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, ZDA). HS5 lizat smo pripravili kot smo že prej, vendar brez končno filtriranje supernatanta [6] opisali. Tri tedne po zadnji imunizaciji smo zbrali kri in serum zberemo. Ta imunizacija protokol se je izkazalo, da je (delno) zaščitno proti H. suis
izziv [6] in zaščitni učinek je bil tu potrjena v poprejšnjem poskusu (podatki niso prikazani).

Sera od H. suis
okuženimi miši (v nadaljnjem besedilu "okuženih miši") (n
= 10). Te živali so bile intragastrically inokulirali z 200 xl Brucella juho pri pH 5, ki vsebuje 10 ^{8 sveže pripravljene H. suis
bakterije [11]. Štiri tedne po okužbi, so bili zbrani v krvi in ​​sera smo združili.}

Sera negativnih kontrolnih miših (n
= 10). Te živali prejel HBSS nos dvakrat s po tremi tedni intervalu sledi želodčne inokulacijo s 200 xl Brucella juhe na pH5 (4 tedne po zadnjem navidezni imunizacijo). Po štirih tednih, smo zbrali kri in serum zberemo.
Vse serume smo hranili pri -70 ° C do nadaljnje uporabe.
Western blot
Proteine ​​smo elektrotransferiramo iz gela na nitrocelulozne membrane (Bio-Rad), kot je opisano drugje [12]. Membrane so blokirani (v blokirnem pufru 1/100) pri sobni temperaturi (RT) v 5% posnetega mleka v fosfatnim pufrom (PBS) (blokiranje buffer), inkubiranih čez noč (O) z razredčenim serumih miške, splaknemo v PBS z 0,3% Tween-20 (pranje pufer) in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi s stabilizirano kozjega proti-miš imunoglobulina G (IgG) s hrenovo peroksidazo (HO), označenih s (1/1000 v pufru za blokiranje, Pierce, Rockford, IL, USA). Po koraku pranje v pufrom za spiranje, je detekcija proteinov izvaja okrepljeno odkrivanje kemiluminiscentnim uporabo Supersignal West Dura podaljšanja substrat (Pierce). Vzorci proteinske so skenirani in digitalizirane z VersaDoc Imaging System. Vse poskuse smo izvajali v treh izvodih.
V-gel prebavo beljakovin in identifikacijo z masno spektrometrijo
In-gela je bila izvedena prebavo beljakovin, ki jih Cheung et al. [13]. Pred masne spektrometrije bile izolirane peptide ločimo na tekočem U3000 nano kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z (Dionex, Sunnyvale, Kalifornija, ZDA), kot je opisano predhodno [14].
Identifikacija peptidov smo izvedli z uporabo elektrospreja ionizacija kvadrupolna čas z letom masne spektrometrije (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA), kot je opisano predhodno [14]. Analiza podatkov je bila izvedena proti Helicobacter
beljakovin zbirko podatkov iz NCBI (146 612 vpisov) z in-house iskalnik maskota Daemon (2.3, Matrix Science, London, Velika Britanija). Prišlo toleranten Iskanje je bilo izvedeno s carbamidomethyl (C) kot stalni spremembe. Carbamidomethyl (N-terminal) in oksidacija (M) je bilo določeno kot različno sprememb. Peptid masa strpnost in fragment masa odstop je bil določen na 0,35 Da in 0,45 Da, v tem zaporedju. Največ dve miscleavages bilo dovoljeno. Proteine ​​smo velja samo pravilno zabeležene ko je pomen pod 0,05 (p
< 0,05) in vsaj en peptid opravili zahtevane krepko rdeče kriterije iz Mascot Daemon, kar kaže, da je vsaj en peptid uvrstitev 1 in pomen pod 0,05.
enodimenzionalna gel elektroforeza (1D-PAGE) in western-blot za rUreB
1D-PAGE 10 mikrogramov rekombinantnega H. suis
ureaze podenote B (rUreB) je bila izvedena kot Van Steendam opisano et al., [12]. Priprava Sera in Western Blot je bil analiziran kot je opisano zgoraj.
Zaščitna učinkovitost rekombinantni H. suis
beljakovin na modelu miši
Priprava rekombinantnega UreB
fragment kodira H. suis
UreB zaporedje (GenBank locus tag HSUHS5_0285) smo pomnožili s PCR z uporabo PWO polimerazo z jezikovni dejavnosti (Roche, Mannheim, Nemčija) z DNK HS5 (naprej-premaz: 5'ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 "reverse premaz: 5'-CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC -3") in klonirali v protein izražanje vektorja hišne 24d. RUreB je bila izražena v E. coli
seva BL21 (DE3). Celice liziramo s sonikacijo (5-krat 30 sekund) v pufru, ki vsebuje 50mm Na.PO 4 pH7, 0.5M NaCl, 1M DTT, 1% Triton X-100 in 1mm PMSF. Po centrifugiranju (4 ° C, 20 000 g
30 minut), smo rUreB očistimo iz topne frakcije z uporabo Ni-afinitetne kromatografije v pufru, ki sestoji iz 1M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250mm imidazola in 10% glicerola (Njegov GraviTrap, GE Healthcare Bio-vede AB, Uppsala, Švedska), nato pa gelsko filtracijo na superdeks ™ 200 HR 16/60 stolpec (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Po čiščenju je rUreB analizirali z SDS-PAGE in zahodne analize blot uporabo anti-hexahistidine-tag miške monoklonsko protitelo (Icosagen Cell Factory, Tartu, Estonija). Detergent Triton X-100 je bil odstranjen iz očiščenega rUreB z Pierce detergent za odstranjevanje Spin stolpce (Pierce) po navodilih proizvajalca. koncentracija beljakovin je bila določena z RC DC
beljakovin Vsebnost (Bio-Rad).
Priprava rekombinantnega Napa
je Protein izražena v E. coli
Expression sistema z Gateway® tehnologijo (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), kot sledi. Fragment kodira H. suis
-nevtrofilcev aktivira protein A (NAPA) zaporedje (GenBank locus tag HSUHS5_0014) smo pomnožili s PCR z uporabo PWO polimerazo v jezikovni dejavnosti (Roche) od DNK HS5 (naprej premaz: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 "reverse primer: 5'TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3") in klonirali v pENTR ™ /TEV /D-TOPO® vektorja in prenese v ciljni vektor pDEST17 ™. Izbrani pDEST17-napa plazmid smo pretvorili v BL21-AI ™ E. coli
in nato goji pri 37 ° C do OD 600 od 0.6-1.0 v Luria brozge dopolnjen z 50 ug /ml karbenicilina. Rekombinantni H. suis
Napa (rNapA) izražanja je bila povzročena z dodatkom 0,2% L-arabinozo. Po 4 h inkubacije pri 37 ° C celice zberemo in ponovno suspendirali v liznega pufra: 50 mM TrisHCI, 100mm NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lizocim, 20 ug /ml DNaze 1 mM inhibitorja proteaze (Sigma) in 1 mM MgCl 2. Celice liziramo s ultrazvoka (5-krat za 30 s). Celica razbitin in vključevanje telesa smo izolirali s centrifugiranjem pri 4 ° C (20 000 g
30 min). Inkluzijska telesa smo nato dvakrat spirali, ki temelji na naslednji protokol: pelet ponovno suspendirali v hladnem liznega pufra, sonificiramo 5-krat 30 sekund nato pa centrifugiranjem (4 ° C, 20 000 g
30 min). So sprani Inkluzijska telesa smo raztopili v pufru vezave, pH 8 (6M gvanidin HCI, 20 mM TrisHCI, 0.5M NaCl, 5 mM imidazol, 1 mM β-mercaptomethanol) z rahlim rotacije za 1 uro pri sobni temperaturi. Netopni material smo odstranili s hitrim centrifugiranjem pri 4 ° C (100 000 g
30 min). rNapA čistimo od očiščene supernatanta na Ni-sefaroze (Njegov GraviTrap, GE Healthcare Bio-vede AB), v skladu z navodili proizvajalca. rNapA eluiramo z elucijskim pufrom, pH 8 (8M sečnino, 20 mM TrisHCI, 0,5M NaCl, 0,5M imidazola, in 1 mM beta-merkaptoetanola) in dializirali proti PBS pri 4 ° C. Nato je rNapA analizirati s SDS-PAGE in beljakovin koncentracija pa je bila določena z uporabo RC DC
Protein testu (Bio-Rad).
Imunizacije in okužba eksperimenti
Poskusna zasnova je povzeta na sliki 1. Pet skupin 10 miši nos inokulirali dvakrat s po 3 tedne interval, vsakič z 17,5! Li inokuluma. V skupini 1, 2 in 3 inokulum sestavljalo HBSS s 5 ig CT, ki vsebuje 30 mikrogramov rUreB, 30 mikrogramov rNapA in 100 mikrogramov HS5 lizat, v tem zaporedju. Skupine 4 (-lažno imuniziramo skupino) in 5 (negativna kontrolna skupina) smo inokulirali s HBSS. Tri tedne po drugi intranazalno imunizacijo smo kri zbrali s rep krvavitev iz petih živali na skupino in enega tedna kasneje, vse živali, razen negativni kontrolni skupini je bilo intragastrically cepljenih z 200 u.l Brucella brozge na pH 5, ki vsebuje 10 8 izvedljive H. suis
bakterije [11]. negativna kontrolna skupina smo inokulirali intragastrically z 200 xl Brucella juho na pH5. Štiri tedne po želodčne okužbi, smo miši evtanazirali s cervikalno dislokacijo naslednjo Izofluran anestezije (IsoFlo, Abbott, IL, USA). Iz žrtvovati živali, je kri zbrali s sterilnim srčno punkcijo, centrifugirali (1000 g
, 4 ° C, 10 min) in seruma smo zamrznili pri -70 ° C do nadaljnje uporabe. Želodcev smo izrezali in seciramo vzdolž večje ukrivljenosti. Ena polovica želodcev, vključno antruma in fundusa, se je takoj premestiti v 1 ml RNA Kasneje (Ambion, Austin, TE, ZDA) in shranili pri -70 ° C za nadaljnjo RNA in DNA ekstrakcijo. Vzdolžni trak želodčne tkiva smo razrezali na požiralniku na dvanajstniku vzdolž večje ukrivljenosti za histopatološko preiskavo. Slika 1 Experimental zasnovo študije cepljenja. Na skupino je bilo 10 miši nos imunizirane dvakrat s po 3 tedne interval, vsakič z 30 mikrogramov rUreB + 5 mikrogramov kolera toksin (CT); 30 mikrogramov rNapA + 5 mikrogramov CT in 100 mikrogramov HS5 lizat + 5 mikrogramov CT (skupine 1, 2 in 3, v tem zaporedju). Skupine 4 (-lažno imuniziramo skupino) in 5 (negativna kontrolna skupina) smo intranazalno inokulirali s HBSS. Tri tedne po drugi imunizaciji smo kri zbrali s 5 miši na skupino in enega tedna kasneje smo miši iz skupin 1, 2, 3 in 4 intragastrically inokulirano s 108 izvedljiva H. suis
bakterij. Skupina 5 je intragastrically inokulirali s HBSS. Štiri tedne po želodčne izziv, je bilo žrtvovati miši.
Količinska H. suis
v želodcu
Po odtajanju, so želodčne tkiva homogenizirali (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Nemčija) v 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Nizozemska) in DNA je bila vzeta iz inter- in organsko fazo v skladu z navodili Tri Reagent® RT proizvajalca. Bakterijske obremenitve v želodcu, je bila določena z uporabo prej opisano H. suis
specifično kvantitativno PCR v realnem času (qPCR) [5].
Analiza želodčne citokinov
izražanjem IFN-y, IL-4, IL-10, IL-17 in TNF-α so bile ocenjene z qPCR uporabo cDNA, sintetizirane iz želodca tkiva, kot je prej [15] opisano. mejnih vrednosti cikla (CT) je bila preračunana na aritmetična CT-vrednosti od referenčnih genov, po katerem normalizirale ravni mRNA smo izračunali s pomočjo 2 -ΔΔCt metoda [16].
merjenje protiteles serumskih ga encimsko-imunskim testom (ELISA)
Protein Detector ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA), je bila uporabljena za oceno rUreB-, rNapA- in HS5 lizat specifične IgG v serumu. Na kratko smo 96 in ravnim dnom plošče (Nunc Maxisorp, Nunc Nalge Int., Rochester, NY, ZDA), prevlečene z 2 g /vdolbinico očiščenega rNapA, 1 ug /ter očiščene rUreB ali 1 ug /dobro H. cela suis
beljakovine celic razredčiti v 100 ml premaznega pufra (24 h, 4 ° C). Po blokiranje z 1% goveji serumski albumin v PBS, smo 100 xl od 1/400 razredčenega seruma dodamo v vsako vdolbino. Po nadaljnjem izpiranju, 100 u.l od HO-markirano anti-miš dodamo IgG (H + L), v končni koncentraciji 50 ng na jamico. Pet minut po dodajanju 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonska kislina) (ABTS) rešitev peroksidaza substrat, absorbance smo prebrali na 405nm (OD 405nm).
Histopatološka preiskava
vzdolžne želodčne trakovi tkiva so bile določene v 4% fosfatom zapufrana formaldehida, predelane s standardnimi postopki in vdelali v parafin. Za oceno gastritis, hematoksilinom - eozinom (HE) obarvajo deli 5 um so slepo priigral na podlagi stopnje infiltracije limfocitov, plazma celic in nevtrofilcev, z uporabo vizualne analogne lestvice, podobno Posodobljeno Sydney sistema (na lestvici od 0- 3) [17], z naslednjimi specifikacijami za vsako gastritis točk: 0 = ne infiltracijo mononuklearnih in /ali polimorfonuklearnih celic; 1 = blago difuzno infiltracijo mononuklearnih in /ali polimorfonuklearnih celic; 2 = zmerna difuzna infiltracija mononuklearnimi in /ali polimorfonuklearnih celic in /ali prisotnost enega ali dveh vnetnih agregatov; 3 = označena razpršeno infiltracijo med mononuklearnimi in /ali polimorfonuklearnih celic in /ali prisotnost vsaj treh vnetnih agregatov.
Statistična analiza
normalnosti in variance homogenost podatkov smo analizirali s pomočjo D'Agostino-Pearson in Shapiro- Test Wilk normalnost. Pomembne razlike v H. suis
kolonizacijo in mRNA izražanje citokinov med skupinami so bili ocenjeni z izvajanjem enosmerno ANOVA analizo. Bonferroni je preizkus multiple Primerjava je bila uporabljena kot post-hoc, ko so bile ocenjene enakih varianc. Test post-hoc T3 Dunnettov je bil uporabljen, ko so bile ocenjene ni enakih varianc. OD ravni 405nm iz ELISA in histoloških točk vnetje smo primerjali z analizo Kruskall-Wallis, ki mu sledi Mann-Whitney U.-
test. Za korelacije med različnimi spremenljivkami, je bila izračunana rho koeficient Spearman je (ρ
). GraphPad Prism5 programska oprema (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ZDA) smo uporabili za vse analize. Statistično značilne razlike med skupinami obravnava na str
< 0,05.
Rezultati
Immunoproteomics od H. suis
H. suis
proteine ​​smo ločili na 2D-PAGE (slika 2a). Po 2D-imunoblotanju s združenih serumih-lizata imunizirane (slika 2b) ali H. suis
, so bili izbrani okuženimi živali (slika 2c), skupno 19 imunoreaktivnih beljakovin mestih. Ti madeži so se ujema z proteinskih lis, ki jih je mogoče videti v vzporedno 2D-PAGE (slika 2a). Malo reaktivnost proti H. suis
beljakovin opazili v serumih po okužb v primerjavi z visoko reaktivnostjo proti serumov miši-lizat imunizirane. Ko je bil madež skeniran z bazenom serumov, pridobljenih iz negativne kontrole miši, ni bilo posebnih imunološko proteinske lise zazna (Dodatne datoteka1). Madeži interesa (n
= 19) smo izrezali iz gela, prebavi in ​​identificirati z analizo LC-MS /MS. Podrobni rezultati teh proteinov so povzeti v preglednici 1. Kraji z najvišjo reaktivnosti (promptno od 1 do 5), je bilo ugotovljeno, da UreB. H. suis
šaperonina GroEL, prikazano kot vložki 9 in 10 na sliki 2a, je tudi pokazala močno hibridizacijo s serumom-lizat imunizirane živali. Poleg tega serumov miši, imunizirane lizata pokazali močno reaktivnost proti ureazno dodatne proteina (UreH) in ureazno podenoto A (urea) (dobro videl kako 15 do 19), ki je bila manj izražena v okuženem skupini. Šibka reaktivnost ob glavnem flagelin FlaA (dobro videl kako se 11 do 13) je bila prisotna v obeh blot analiz. Slika 2 H. suis 2D-proteoma profil (A) in Western blots dvojnika 2D-gel reagira z združeni serumih miši-lizat imunizirane (B) ali H. suis okuženimi miši (C). 100 mikrogramov skupnega ekstrakta proteinov H. suis
ločimo s 2D-elektroforezo z linearno Ph3P do 10 preliva v prvi dimenziji in 10% TrisHCI SDS-PAGE v drugi dimenziji. Ločene proteine ​​smo odkrile SYPRO®Ruby Protein barvanjem. Uokvirjen območja kažejo, kjer so imunološko antigeni izrezali iz gela in se na LC-MS /MS. Ugotovljene proteini so označene s pike številke, navedene v tabeli 1. Škatle in številke v rdeči barvi so bili opredeljeni kot UreB. Položaj molekulsko maso (MW) se izračuna na desni strani, in pH je naveden na dnu.
Tabela 1 imunološko beljakovine H. suis označene z LC-MS /MS
Spot no.1

ime Protein
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
No. ujema peptidi
maskota score4
cov. (%) 5
1
ureaze podenota B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
117
1589
72
2
ureaze podenota B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
80
1042
58
treonil-tRNA sintetazo
EFX41598
thrS
6.34
69,315
7
186
60
3
ureaze podenota B
EFX42254
ureB

5.97
62,967
80
903
46
4
ureaze podenota B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
4
103
6
5
ureaze podenota B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
4
103
6
6
30S ribosomske protein S1
EFX42427
rpsA
8.29
64,051
23
625
28
kinon-reaktivni Ni /Fe hidrogenazo, velika podenota
EFX41851
hydB
8.22
64,943
19
520
28
ureaze H. heilmannii
AAA65722
8.86
25,844
8
258
26
7
-metil sprejemanje kemotaksa beljakovin
EFX43528
7.1
48.907
35
905
50
8
Raztezek faktor G
EFX41637
Fusa
5.15
77,242
57
1066
55
9
šaperonina groEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10
šaperonina groEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
135
2647
73
ureaze podenota B
EFX42254
ureB
5.97
62,967
43
682
41
11
flagelina
EFX41982
flaA
7.77
54,232
29
756
47
12
flagelina
EFX41982
flaA
7.77
54,232
57
1294
62
13
flagelina
EFX41982
flaA
7.77
54,232
46
1085
63
Trigger faktor
EFX42378
tig

5.13
49,587
12
343
24
14
hidrogenazo izraz /tvorba beljakovin
EFX41790
hypB
5,59
27,617
15
314
35
nikotinat-nukleotidov pirofosforilaze
EFX42191
nadC
6.46
30,591
11
219
25
7-alfa-hidroksisteroid-dehidrogenaze
EFX41880
6.62
28.246
6
186
24
Ohranjena hipotetična izločen protein
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
Hipotetični protein HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
Peroxiredoxin
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
ureaze dodatek beljakovin
EFX42255
ureH

6.79
30,447
4
106
13
16
ureaze podenota
EFX42255
sečnine
7,79
27,389
24
270
55
17
ureaze podenota
EFX42255
sečnine
7,79
27.389
28
112
45
18
ureaze podenota
EFX42255
sečnine
7.79
27,389
57
418
69
19
ureaze podenota
EFX42255
sečnine
7.79
27,389
75
568
73
1 Protein točkovno ustreza položaj na gel in blot analiz ( glej sliko 2)
2NCBI
:.. Nacionalni center za biotehnologijo informacije
3 Teoretični izoelektrična točka (pI) in molekulsko maso (MW)
4 Helicobacter
podatkov, maskota mnogo več. kot so 40 pomembne (p
≤ 0,05).
5% zaporedja proteina s peptidi identificirani.
Potrditev serumu reaktivnosti proti rUreB
iz 2D-analiza zajema, UreB pokazala izrazito reaktivnost s serumom-lizat imunizirane miši, ki ni bilo opaziti v serumu niso imuniziranih vendar okuženih miših. Da bi potrdili te podatke, je izvedla 1D-PAGE naložen z rUreB, sledi imunodetekcijo s serumom-lizat imuniziranih in H. suis
okuženimi miši. 0.01. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Karakterizacija genske ekspresije profilov za različne vrste mastocitov zbranih z miško na želodcu podobmočij, ki RNA ojačanje method
• Clinicopathological značilnosti in napovedni analiza razvrstitve Lauren v adenokarcinomom želodca na Kitajskem