A imunização com a subunidade de urease imunodominante Helicobacter suis B induz protecção parcial contra a infecção por H. suis em um rato model

imunização com a imunodominante Helicobacter suis
urease subunidade B induz proteção parcial contra H. suis
infecção em um modelo de rato
Abstract
Helicobacter
(H.
) suis
é um suína e patógeno gástrico humano. Estudos anteriores em ratos demonstraram que uma H. ​​suis
infecção não resulta em imunidade protectora, enquanto que a imunização com H. suis
lisado de células inteiras (lisado) protege contra uma infecção experimental subsequente. Portanto, a electroforese bidimensional em gel de proteínas
H. suis foi realizado seguido por immunoblotting com soros reunidos a partir de H. suis
- infectou camundongos ou ratos imunizados com ligado. fraca reactividade contra as proteínas
H. suis foi observada em soros de pós-infecção. Os soros de ratinhos imunizados com lisado, no entanto, mostraram imunoreactividade contra um total de 19 pontos de proteínas que foram identificadas utilizando LC-MS /MS. A H. suis subunidade
urease B (UreB) mostrou reatividade mais pronunciado contra soros de ratinhos imunizados com lisado e não foi detectado com soros de camundongos infectados. Nenhum dos soros reunidos detectado H. suis
ativador de neutrófilos proteína A (NAPA). A eficácia protectora da vacinação intranasal de ratinhos BALB /c com H. suis
UreB e NaPA, ambos expressos de forma recombinante em Escherichia coli
(rUreB e rNapA, respectivamente), foi comparada com a de H. suis
lisado. Todas as vacinas continham choleratoxin como adjuvante. A imunização de camundongos com rUreB e lisado induziu uma redução significativa de H. suis
colonização em comparação com não-vacinados H. suis
infectados controles, enquanto rNapA não teve nenhum efeito protetor significativo. Provavelmente, uma combinação de respostas locais Th1 e Th17, complementadas por respostas de anticorpos desempenham um papel na imunidade protetora contra infecções
H. suis.
Introdução
Helicobacter
(H.
) suis
é um agente patogénico disseminação mundial, principalmente colonizar porcos. Uma infecção com esta bactéria Gram-negativa tem sido associado a úlceras da mucosa gástrica não glandular [1, 2] e provoca gastrite e diminuiu o ganho de peso diário [3] em suínos. H. suis
é também o não-Helicobacter pylori Helicobacter
espécies mais prevalentes em seres humanos que sofrem de distúrbios gástricos [2] e os porcos podem servir como uma fonte de H. suis
infecções para os seres humanos [2, 4 ]. Controlo de H. suis
infecções por terapia à base de antibiótico não é recomendado em parte devido a um risco aumentado de desenvolvimento de resistência antimicrobiana adquirida em H. suis
estirpes e em bactérias pertencentes ao microbiota porcina normal, [5]. A imunização contra H. suis
pode, portanto, representam uma alternativa valiosa. Até agora, no entanto, poucos estudos têm lidado com a vacinação contra esta suína e patógeno zoonótico.
Estudos anteriores em um rato modelo mostrou que um
infecção por H. suis não resulta em imunidade protetora, enquanto que a vacinação com base em homóloga (H. suis
) ou heteróloga (H. bizzozeronii
ou H. cynogastricus
) lisado de células inteiras induziu uma redução ou mesmo a eliminação completa da colonização gástrica com H. suis
[6]. No entanto, a utilização deste tipo de vacinas tem desvantagens, incluindo o laborioso em cultura in vitro de H. suis
, o que resulta em dificuldades para produzir de antigénio suficiente. Além disso, os lisados ​​de células inteiras pode conter ambos os antigénios protectores e antigénios supressores protecção [7]. Uma vacina de subunidade eficaz pode ser uma alternativa útil para o controle de infecções
H. suis. Imunoproteômica é uma abordagem adequada para a rápida identificação de proteínas candidatas para a vacinação e foi aplicada ao estudo e desenvolvimento de vacinas de subunidades para uma ampla gama de agentes patogénicos [8].
Foi o objectivo do presente estudo para seleccionar H. suis
proteínas que possam induzir imunidade protectora contra a H. suis
infecção. Portanto, H. suis
proteínas reconhecidas por soros de ratinhos imunizados com H. suis
lisado de células inteiras e protegidos contra a infecção foram identificados através de electroforese bidimensional (2D) em gel seguida de imunotransferência e de LC-MS /SENHORA. Os soros de
suis H. - ratinhos infectados foram também incluídas, uma vez que uma infecção não resultar na protecção. Com base nesta análise, o imunorreativo H. suis
subunidade urease B (UreB) foi selecionado para mais testes in vivo. Como um controlo que incluiu a H. suis
proteína de activação de neutrófilos A (napa), o qual foi previamente descrito como um possível factor de virulência [9], mas não foi reconhecido por soros de ratinhos imunizados com lisado de células inteiras. Subsequentemente, a eficácia protectora contra uma infecção por H. suis
de ambas as vacinas de subunidade foi avaliada e comparada com aquela de H. suis
lisado num modelo de rato normalizado.
Materiais e métodos
Estirpe bacteriana
Em todos os experimentos, H. suis
estirpe 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) foi utilizado. Esta estirpe foi isolada a partir da mucosa gástrica de um porco de acordo com o método descrito por Baele et ai. [10].
Animais
Uma semana antes do início das experiências, específico do patogénio com cinco semanas de idade -livre fêmea BALB /c foram obtidos a partir de um criador autorizado (Harlan, Horst, Holanda). Os animais foram alojados em aparas de madeira esterilizadas em top filtro de gaiolas. Eles foram alimentados com uma dieta comercial autoclavado (Teklad 2018S, HARLAN) e recebeu água ad libitum
autoclavado. Todos os experimentos com animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê Cuidados e Ética Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Ghent.
Imunoproteômica de H. suis
Bidimensional eletroforese em gel (2D-PAGE)
HS5 foi cultivada como descrito anteriormente [11]. As bactérias foram recolhidas por centrifugação (5000 g
, 4 ° C durante 10 min) e lavadas quatro vezes com solução salina equilibrada de Hank (HBSS). Total de proteínas (proteínas ambos solúveis e insolúveis) foram extraídos em duas etapas usando o Kit ™ ReadyPrep Extracção sequencial (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A fim de obter bons resultados 2D-PAGE, os homogenatos foram tratados com aditivos adequados (5 mg de cocktail inibidor de protease, 1 mL de DNAse I, 1 uL de RNAse A, 10 inibidores de fosfatase uL PP2 e PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) ). Finalmente, a concentração de proteína foi determinada utilizando o RC DC
Protein Assay (Bio-Rad) e as proteínas foram armazenadas a -70 ° C até posterior utilização. Um total de 100 ug de proteínas HS5 foram re-hidratadas em 200 ul de tampão de reidratação (7M ureum, 2M thioureum, CHAPS a 2%, 0,2% anfotérico transportador pH3-4, 100 mM de ditiotreitol (DTT) e azul de bromofenol). As amostras foram passivamente absorvido num ReadyStrip (11 cm, pH 3 a pH 10, Bio-Rad) e de focagem isoeléctrica foi realizada num IEF Protean Secção (Bio-Rad) como descrito anteriormente [12]. Depois de focagem isoeléctrica, as tiras foram equilibradas durante 15 min em 1,5% de DTT em tampão de equilíbrio (TrisHCl 50 mM, pH 8,8 ureia 6M, glicerol a 20%, SDS a 2%), seguida por outra de equilíbrio em 4% iodoacetamida em tampão de equilíbrio. A electroforese em gel foi realizada em um de TrisHCl 10% de SDS-PAGE utilizando 150V durante 30 min, seguido de 200 V durante 1 h. Dois géis foram corridos em paralelo: um foi corado com coloração Sypro® rubi gel proteico (Bio-Rad), enquanto o outro foi usado para imunotransferência (ver transferência de Western descrito a seguir). Antes da coloração, os géis foram fixados em 10% de MeOH, 7% de ácido acético. Após a coloração, H. suis
proteínas foram visualizadas utilizando o sistema VersaDoc tratamento de imagens (Bio-Rad)
pools
Três misturas de soros de ratinho foram usados ​​neste estudo:.

Os soros de ratinhos imunizados com H. suis
lisado de células inteiras (doravante referida como "ratos imunizados-lisado") (n =
10). Os animais foram inoculados por via intranasal duas vezes com três semanas de intervalo com 100 ug de lisado HS5 + 5 ug de toxina da cólera (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, EUA). HS5 lisado foi preparado como descrito anteriormente, mas sem filtração final do sobrenadante [6]. Três semanas após a última imunização, o sangue foi recolhido e os soros foram reunidas. Este protocolo de imunização foi mostrado para ser (parcialmente) de protecção contra a H. suis
desafio [6] e o efeito protector aqui foi confirmada em uma experiência preliminar (dados não mostrados).

Sera de H. suis
ratos infectado (doravante referida como "ratos infectados") (n =
10). Os animais foram inoculados por via intragástrica com 200 ul de caldo Brucella a pH 5, contendo 10 ^{8 recentemente preparadas H. suis
bactérias [11]. Quatro semanas após a infecção, foi colhido sangue e os soros foram reunidas.}

Os soros de ratinhos de controlo negativo (n
= 10). Estes animais receberam HBSS por via intranasal duas vezes, com intervalo de três semanas, seguido por inoculação intragástrica com 200 ul de caldo de Brucella em pH 5 (4 semanas após a última imunização simulada). Após quatro semanas, o sangue foi recolhido e os soros foram reunidas.
Todos os soros foram armazenados a -70 ° C até à sua utilização.
Transferência de Western As proteínas foram electrotransferidas
a partir de geles para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad) como descrito noutro local [12]. As membranas foram bloqueadas em 5% de leite desnatado em tampão fosfato salino (PBS) (tampão de bloqueio), incubadas durante a noite (EM) com soros de ratinho diluído (1/100 em tampão de bloqueio) à temperatura ambiente (RT), lavado em PBS com 0,3% Tween-20 (tampão de lavagem) e incubou-se durante 1 h à RT com cabra anti-rato estabilizado imunoglobulina G (IgG) peroxidase de rábano (HRP) -conjugated (1/1000 em tampão de bloqueio, Pierce, Rockford, IL, EUA). Após um passo de lavagem em tampão de lavagem, a imunodetecção das proteínas foi realizada por detecção por quimioluminescência melhorada usando substrato Supersignal Duração Oeste Dura prolongado (Pierce). padrões de proteínas foram escaneados e digitalizados usando o Sistema de Imagem VersaDoc. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.
Em gel e a digestão de proteínas de identificação por espectrometria de massa
em gel digestão de proteínas foi realizada como descrito por Cheung et ai. [13]. Antes da espectrometria de massa dos péptidos isolados foram separados numa cromatografia líquida U3000 nano-alto desempenho (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, EUA) como previamente descrito [14].
Identificação de péptidos foi realizada utilizando um electropulverização ionização quadrupolo espectrometria de massa de tempo-de-voo (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, EUA) como descrito anteriormente [14]. A análise dos dados foi realizada contra a Helicobacter
banco de dados de proteína de NCBI (146 612 entradas) com a in-house motor de busca Mascot Daemon (2.3, Matrix Ciência, London, UK). Uma pesquisa tolerante a erros foi realizada com carbamidomethyl (C) como a modificação fixa. Carbamidomethyl (N-terminal) e de oxidação (M) foram definidas como modificações variáveis. tolerância a tolerância ea massa fragmento de massa do péptido foi fixado em 0,35 Da e 0,45 Da, respectivamente. Máximo de dois miscleavages foram autorizados. As proteínas foram apenas considerados a ser correctamente anotada quando a significância foi abaixo de 0,05 (p
< 0,05) e pelo menos um péptido passou os critérios exigidos a vermelho de Mascot daemon, indicando que, pelo menos, um péptido teve uma classificação e uma significação abaixo de 0,05.
unidimensional electroforese em gel (1D-PAGE) e transferência Western da rUreB
1D-PAGE de 10 ug recombinante de subunidades da urease H. suis
B (rUreB) foi realizada como descrito por Van Steendam et ai. [12]. análises de preparação de soros e Western blot foram realizados como descrito acima.
A eficácia protetora de proteínas
recombinante H. suis em um rato modelo
Preparação de UreB recombinante
Um fragmento que codifica a H. suis
sequência UreB (GenBank locus de marcação HSUHS5_0285) foi amplificado por PCR usando polimerase Pwo com uma actividade correctora (Roche, Mannheim, Alemanha) a partir do DNA de HS5 (iniciador directo: 5'-ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA TAT GAA G -3 '; iniciador inverso: 5'-CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG AGC TTG-3') e clonado no vector de expressão de proteína de pET-24d. O rUreB foi expressa em E. coli
estirpe BL21 (DE3). As células foram lisadas por sonicação (5 vezes durante 30 s) em tampão contendo 50 mM de Na.PO 4 pH 7, NaCl 0,5 M, DTT a 1 M, 1% de Triton X-100 e 1 mM de PMSF. Após a centrifugação (4 ° C, 20 000 g durante 30 min
), rUreB foi purificado a partir da fracção solúvel por cromatografia em Ni-afinidade em tampão que consiste de NaCl 1M, 50 mM de PBS, 1% de Triton X-100, 250 mM de imidazole e 10% de glicerol (Sua GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suécia) seguida por filtração em gel numa coluna Superdex ™ 200 HR 16/60 coluna (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Após purificação, rUreB foi analisada utilizando SDS-PAGE e análise de Western blot utilizando anticorpo anti-hexa-histidina-tag monoclonal de ratinho (Icosagen fábrica celular, Tartu, Estónia). O detergente Triton X-100 foi removido da rUreB purificada utilizando colunas de centrifugação Pierce detergentes remoção (Pierce) seguindo as instruções do fabricante. A concentração de proteína foi determinada com o RC DC
Protein Assay (Bio-Rad).
Preparação de NaPA
recombinante A proteína foi expressa em E. coli
Sistema de Expressão com Gateway® Tecnologia (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) da seguinte forma. Um fragmento que codifica a sequência de H. suis
de activação de neutrófilos proteína A (NaPA) (GenBank locus de marcação HSUHS5_0014) foi amplificado por PCR usando polimerase Pwo com uma actividade correctora (Roche) a partir do DNA de HS5 (iniciador directo: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; iniciador inverso: 5'-TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3') e clonado no ™ /TEV /D-TOPO® vector pENTR e transferido para o vector de destino pDEST17 ™. O plasmídeo seleccionado pDEST17-NaPA foi transformado em BL21-AI ™ de E. coli
e subsequentemente criadas a 37 ° C até um OD 600 de 0,6-1,0 em meio Luria suplementado com 50 ug /ml de carbenicilina. Recombinante H. suis
Napa expressão (rNapA) foi induzida pela adição de 0,2% de arabinose L-. Após 4 h de incubação a 37 ° C, as células foram colhidas e ressuspensas em tampão de lise: 50 mM de TrisHCl, 100 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,2 mg /ml de lisozima, 20 ug /mL DNAse, inibidor de protease a 1 mM (Sigma) , e 1 mM MgCl 2. As células foram lisadas por sonicação (5 vezes durante 30 s). corpos de inclusão e os detritos celulares foram isolados por centrifugação a 4 ° C (20 000 g durante 30 min
). Os corpos de inclusão foram subsequentemente lavadas duas vezes com base no seguinte protocolo: o sedimento foi ressuspenso em tampão de lise frio, sonicadas 5 vezes durante 30 s, seguido de centrifugação (4 ° C, 20 000 g durante 30 min
). Os corpos de inclusão lavados foram solubilizados em tampão de ligação, pH 8 (6 M de guanidina HCl, 20 mM de Tris-HCl, NaCl 0,5 M, imidazolo 5 mM, 1 mM de β-mercaptomethanol) por rotação suave durante 1 h à TA. O material insolúvel foi removido por centrifugação a alta velocidade, a 4 ° C (100 000 g durante 30 min
). rNapA foi purificado a partir do sobrenadante clarificado numa coluna de Ni-Sepharose (Sua GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) de acordo com as instruções do fabricante. rNapA foi eluída com tampão de eluição, pH 8 (8M ureia, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M de NaCl, 0,5 M de imidazol, e 1 mM de β-mercaptoetanol) e EM dialisadas contra PBS a 4 ° C. Depois, rNapA foi analisada utilizando SDS-PAGE e a proteína concentração foi determinada utilizando RC DC
Protein Assay (Bio-Rad).
Experiências de imunização e infecção
A concepção experimental é resumido na Figura 1. Cinco grupos de 10 ratos foram inoculados por via intranasal duas vezes, com intervalo de 3 semanas, a cada vez com 17,5 mL de inoculo. Nos grupos 1, 2 e 3 do inoculo consistiu de HBSS com CT 5 ug, que continha 30 ug rUreB, 30 ug e 100 ug rNapA HS5 lisado, respectivamente. Grupos 4 (grupo falsamente imunizados) e 5 (grupo de controlo negativo) foram inoculadas com HBSS. Três semanas após a segunda imunização intranasal, o sangue foi recolhido por cauda de hemorragias a partir de cinco animais de cada grupo e uma semana mais tarde, todos os animais, excepto o grupo de controlo negativo, foram inoculados por via intragástrica com 200 ul de Brucella caldo a pH 5, contendo 10 8 H. suis
bactérias viáveis ​​[11]. O grupo controle negativo foi inoculado intragastricamente com 200 mL de caldo Brucella em pH5. Quatro semanas após a inoculação intragástrica, os ratinhos foram sacrificados por luxação cervical após anestesia isoflurano (ISOFLO; Abbott, IL, EUA). A partir dos animais sacrificados, o sangue foi colhido por punção cardíaca, estéril, centrifugada (1000 g
, 4 ° C, 10 min) e o soro foi congelado a -70 ° C até à sua utilização. Os estômagos foram removidos e dissecados ao longo da maior curvatura. Metade dos estômagos, incluindo antro e do fundo do olho, colocou-se imediatamente em 1 ml de ARN Mais tarde (Ambion, Austin, TE, EUA) e armazenou-se a -70 ° C para posterior RNA- DNA e de extracção. Uma tira longitudinal do tecido gástrico foi cortada a partir do esófago para o duodeno ao longo da curvatura maior para exame histopatológico. Figura 1 delineamento experimental de estudo de vacinação. Por grupo de 10 ratinhos foram imunizados por via intranasal duas vezes, com intervalo de 3 semanas, a cada vez com 30 ug toxina de cólera rUreB + 5 ug (CT); 30 ug rNapA + 5 ug de CT, e 100 ug HS5 lisado + 5 ug CT (grupos 1, 2 e 3, respectivamente). Grupos 4 (grupo imunizado-sham) e 5 (grupo controle negativo) foram intranasal inoculadas com HBSS. Três semanas após a segunda imunização, foi colhido sangue de 5 ratos por grupo e uma semana mais tarde, os ratos dos grupos 1, 2, 3 e 4 foram intragastricamente inoculados com 108 H. suis viável
bactérias. Grupo 5 foi intragastricamente inoculadas com HBSS. Quatro semanas após o desafio intragástrica, os ratinhos foram sacrificados.
Quantificação de H. suis
no estômago
Após descongelação, os tecidos foram homogeneizados estômago (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Alemanha) em um mililitro de TRI Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdão, Países Baixos) e o ADN foi extraído a partir da fase orgânica inter- e de acordo com as instruções do fabricante Tri Reagent® RT. A carga bacteriana no estômago foi determinada utilizando o anteriormente descrito H. suis
quantitativo em tempo real de PCR específica (qPCR) [5].
Análise da resposta de citocinas estômago
Os níveis de IFN-γ expressão, IL-4, IL-10, IL-17 e TNF-α foram avaliadas por qPCR utilizando ADNc sintetizados a partir de tecido do estômago, tal como descrito anteriormente [15]. O ciclo de limiar de valores (Ct) foram normalizados para a média geométrica dos valores de CT-os genes de referência, após o que os níveis de mRNA normalizados foram calculados utilizando a 2 -ΔΔCt método de [16].
Medição de respostas de anticorpos séricos por ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA)
a proteína Detector ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, EUA) foi utilizado para avaliar rUreB-, rNapA-, e IgG específica HS5 lisado no soro. Em breve, placas de 96 poços de fundo plano (Nunc MaxiSorp, Nunc Nalge Int., Rochester, NY, EUA) foram revestidos com 2? G /poço de rNapA purificada, 1 ug /poço de rUreB purificada, ou 1 ug /poço de H. suis
proteínas celulares totais diluído em 100 ul de tampão de revestimento (24 h, 4 ° C). Depois de bloquear com 1% de albumina de soro bovino em PBS, 100? L de soro diluído 1/400 foi adicionado a cada poço. Após nova lavagem, 100 ul de HRP-anticorpo anti-IgG de ratinho (H + L) numa concentração final de 50 ng por poço foram adicionados. Cinco minutos após a adição de 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) solução de substrato de peroxidase, a absorvância foi lida a 405 nm (OD 405nm). O exame histopatológico

as tiras de tecido longitudinais gástricas foram fixadas em formaldeído a 4% tamponado com fosfato, processados ​​através de procedimentos padrão e embebidos em parafina. Para a avaliação da gastrite, hematoxilina - eosina (HE) secções coradas de 5 um foram cegamente marcados com base no grau de infiltração de linfócitos, células plasmáticas e neutrófilos, utilizando uma escala analógica visual semelhante ao sistema Sydney (numa escala de 0- 3) [17] com as seguintes especificações de cada pontuação gastrite: 0 = sem infiltração de células mononucleares e /ou células polimorfonucleares; 1 infiltração difusa = leve de mononucleares e /ou células polimorfonucleares; 2 = infiltração difusa moderada de mononucleares e /ou células polimorfonucleares e /ou a presença de um ou dois agregados inflamatórias; 3 = marcada infiltração difusa de células mononucleares e /ou células polimorfonucleares e /ou a presença de pelo menos três agregados inflamatórias.
Análise estatística
normalidade e homogeneidade de variância dos dados foram analisados ​​usando D'Agostino-Pearson e Shapiro Wilk teste de normalidade. diferenças significativas em H. suis
colonização e expressão das citocinas mRNA entre os grupos foram avaliadas através da realização de one-way análise de variância. teste de comparação múltipla de Bonferroni foi utilizado como post-hoc quando variâncias iguais foram avaliados. teste post-hoc de Dunnett T3 foi utilizado quando não há variâncias iguais foram avaliados. OD 405nm níveis de ELISA e pontuações histológicas de inflamação foram comparadas por análise de Kruskall-Wallis, seguido por um Mann-Whitney U
teste. Para correlações entre diferentes variáveis, foi calculado o coeficiente rho de Spearman (ρ
). Prism5 GraphPad Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) foi utilizado para todas as análises. As diferenças estatisticamente significativas entre os grupos foram consideradas na p Art < 0.05.
Resultados
imunoproteômica de H. suis
proteínas
H. suis foram separados em 2D-PAGE (Figura 2A). Após 2D-immunoblotting com soros reunidos a partir imunizados-lisado (Figura 2b) ou H. suis
animais infectados (Figura 2C), foram selecionados um total de 19 spots de proteínas imunorreactivas. Estes pontos foram combinados com os spots de proteínas que podem ser vistos no paralelo 2D-PAGE (Figura 2a). Pouco reactividade contra as proteínas
H. suis foi observada em soros de pós-infecção, em comparação com a elevada reactividade contra soros de ratinhos imunizados com lisado. Quando a mancha foi sondada com uma mistura de soros obtida a partir de ratinhos de controlo negativo, sem manchas proteicas imunorreactivas específicos foram detectados (arq1 adicionais). Pontos de interesse (n
= 19) foram cortadas do gel, digeridas e identificada por meio de análise por LC-MS /MS. Os resultados detalhados destas proteínas estão resumidos na Tabela 1. Spots com a reactividade mais elevada (ponto 1 a 5) foram identificadas como UreB. H. suis
chaperonina GroEL, ilustrado como pontos 9 e 10 na Figura 2a, também mostrou forte hibridação com soros de animais imunizados-lisado. Além disso, os soros de ratinhos imunizados com lisado mostrou forte reactividade contra a proteína de urease acessório (UreH) e a subunidade urease A (ureia) (manchas 15 e 19), a qual foi menos pronunciado no grupo infectado. reatividade fraca contra o grande FlaA flagelina (manchas 11 a 13) esteve presente em ambos os borrões. Figura 2 H. suis perfil 2D-proteoma (A) e Western blot de um 2D-gel duplicado reagiram com soros reunidos de ratinhos imunizados-lisado (B) ou de H. suis ratos infectado (C). 100 ug de extracto de proteína total de H. suis
foi separado por eletroforese 2D usando pH3 linear a 10 gradiente na primeira dimensão e 10% TrisHCl SDS-PAGE na segunda dimensão. As proteínas separadas foram detectadas por coloração da proteína SYPRO®Ruby. As áreas dentro de caixas indicam onde antigénios imunoreactivos foram excisadas a partir do gel e sujeitas a LC-MS /MS. proteínas identificadas são indicados pelos números de ponto dadas na Tabela 1. Caixas e números no vermelho foram identificados como UreB. A posição do peso molecular (MW) é dada na direita e o pH é dada na parte inferior.
Tabela 1 imunorreactiva proteínas de H. suis identificado por LC-MS /MS
natural No.1

nome Protein
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
No. peptídeos combinados
Mascot score4
Cov. (%) 5
1 | urease subunidade B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
117
1589
72
2
urease subunidade B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
80
1042
58
treonilo-tRNA sintetase
EFX41598
THRS
6,34
69,315
7
186
60 Sims 3
urease subunidade B
EFX42254
ureB

5,97
62,967
80
903
46 4
subunidade de urease B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
4
103
6
5
urease subunidade B
EFX42254
ureB
5,97
62,967 4
103
6
6
30S proteína ribossômica S1
EFX42427
RPSA
8,29
64,051
23
625
28
quinona-reativa Ni /Fe hidrogenase, subunidade grande
EFX41851
hydB
8,22
64,943
19
520
28
urease de H. heilmannii
AAA65722
8,86
25,844
8
258
26
7
proteína quimiotaxia aceitar metil
EFX43528
7,1
48,907
35
905
50
8
factor de alongamento G
EFX41637
Fusa
5,15
77,242
57
1066
55
9
Chaperonina GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10
Chaperonina GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
135
2647
73
urease subunidade B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
43
682
41
11
Flagelina A
EFX41982
flaA
7,77
54,232
29
756
47
12
Flagelina A
EFX41982
flaA
7,77
54,232
57
1294
62
13
Flagelina A
EFX41982
flaA
7,77
54,232
46
1085
63
fator desencadeante
EFX42378
tig

5,13
49,587
12
343
24
14
Hidrogenase expressão /proteína formação
EFX41790
HYPB
5,59
27,617
15
314
35
Nicotinate-nucleotide pirofosforilase
EFX42191
NADC
6,46
30,591
11
219
25 desidrogenase
7-alfa-hidroxiesteróide
EFX41880
6,62
28,246
6
186
24
conservado proteína secretada hipotética
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
proteína hipotética HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
Peroxirredoxina
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
urease proteína acessória
EFX42255
ureH
6,79
30,447 4
106
13
16
urease subunidade A
EFX42255
ureA
7,79
27,389
24
270
55
17
urease subunidade A
EFX42255
ureA
7,79
27,389
28
112
45
18
urease subunidade A
EFX42255
ureA
7,79
27,389
57
418
69
19
a urease subunidade a
EFX42255
ureA
7,79
27,389
75
568
73
1 spot proteína correspondente à posição em gel e borrões ( veja a Figura 2)
2NCBI
:.. Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia Sims 3 teórica ponto isoeléctrico (pi) e peso molecular (MW) página 4 para o Helicobacter
dados, pontuações Mascote maiores. do que 40 são significativas (p
≤ 0,05).
5% da sequência da proteína abrangida pelos péptidos identificados.
confirmação da reactividade do soro contra rUreB
do 2D-análise, mostraram reactividade distinta UreB com soros provenientes de murganhos imunizados com lisado, que não foi observada em soros de ratinhos não imunizados, mas infectadas. A fim de confirmar estes dados, um 1D-PAGE carregado com rUreB foi realizada, seguido por imunodetecção com os soros de ratinhos imunizados com lisado e H. suis
infectados. 0,01. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• Caracterização da expressão do gene perfis para diferentes tipos de mastócitos agrupados de sub-regiões do estômago de rato por um método de amplificação de ARN
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