Immunisatie met de immunodominante Helicobacter suis urease subunit B induceert gedeeltelijke bescherming tegen H. suis infectie in een muismodel

Immunisatie met de immunodominante Helicobacter suis
urease subunit B induceert gedeeltelijke bescherming tegen H. suis
infectie in een muismodel
De abstracte Helicobacter
(H.
) suis
is een varken en humane maag pathogeen. Eerdere studies bij muizen bleek dat een H. suis
infectie niet tot beschermende immuniteit, terwijl immunisatie met H. suis
gehele cellysaat (lysaat) bescherming tegen een volgende experimentele infectie. Daarom tweedimensionale gelelektroforese van H. suis
eiwitten werd uitgevoerd gevolgd door immunoblotting met samengevoegde sera van H. suis Catawiki - geïnfecteerde muizen of muizen geïmmuniseerd met lysaat. Zwakke reactiviteit tegen H. suis
eiwitten werd waargenomen in post-infectie sera. Sera uit geïmmuniseerde muizen-lysaat toonde echter immunoreactiviteit tegen totaal 19 eiwit spots die werden geïdentificeerd met behulp van LC-MS /MS. De H. suis
urease subunit B (UreB) toonde meest uitgesproken reactiviteit tegen sera van-lysaat geïmmuniseerde muizen en werd niet gedetecteerd met sera van geïnfecteerde muizen. Geen van de samengevoegde sera gedetecteerd H. suis
neutrofiel activerend eiwit A (NAPA). De beschermende werkzaamheid van intranasale vaccinatie van BALB /c muizen met H. suis
UreB en Napa, zowel recombinant tot expressie gebracht in Escherichia coli
(rUreB en rNapA, respectievelijk), werd vergeleken met die van H. suis
lysaat. Alle vaccins bevatten choleratoxin als adjuvans. Immunisatie van muizen met rUreB en lysaat wekte een duidelijke vermindering van H. suis
kolonisatie vergelijking met niet-gevaccineerde H. suis
geïnfecteerde controles, terwijl rNapA geen significant beschermend effect had. Waarschijnlijk een combinatie van lokale Th1 en Th17 reacties, aangevuld met antilichaam reacties spelen een rol bij de beschermende immuniteit tegen H. suis
infecties.
Introductie
Helicobacter
(H.
) suis
is een wereldwijd verspreid pathogeen, vooral koloniseren varkens. Een infectie met deze Gram-negatieve bacterie is geassocieerd met zweren van de maag niet-glandulaire mucosa [1, 2] en veroorzaakt gastritis en verminderde dagelijkse gewichtstoename [3] bij varkens. H. suis
is de meest voorkomende niet-Helicobacter pylori Helicobacter
species bij mensen die lijden aan maagaandoeningen [2] en varkens kunnen dienen als bron van H. suis
infecties voor mens [2, 4 ]. Controle van H. suis
infecties door antibiotica-gebaseerde therapie is niet mede aanbevolen vanwege een verhoogd risico op het ontwikkelen van verworven antimicrobiële resistentie in H. suis
stammen en in bacteriën die behoren tot de normale varkens microbiota [5]. Immunisatie tegen H. suis
kunnen derhalve een waardevol alternatief. Tot nu toe echter weinig studies behandeld tegen deze varkens en zoönotische pathogenen.
Eerdere studies in een muismodel bleek dat een H. suis
infectie niet tot beschermende immuniteit, terwijl vaccinatie op basis van homologe (H. suis
) of heteroloog (H. bizzozeronii golfreizen of H. cynogastricus
) whole-cellysaat leidde tot een vermindering of zelfs volledige klaring van maag kolonisatie met H. suis
[6]. Het gebruik van dit soort vaccin heeft nadelen, waaronder de moeizame in vitro kweek van H. suis
, waardoor moeilijkheden om voldoende antigeen. Ook kunnen hele cellysaten beschermend antigenen en antigenen onderdrukken bescherming bieden [7]. Een effectieve subunit vaccin zou een bruikbaar alternatief voor de controle van H. suis
infecties. Immunoproteomics een geschikte aanpak voor de snelle identificatie van kandidaat-eiwitten voor vaccinatie en is toegepast om te studeren en te ontwikkelen subunit vaccins voor een breed scala van pathogenen [8].
Het was het doel van deze studie om H. suis selecteert u
eiwitten die de immuniteit tegen H. suis
infectie kan veroorzaken. Daarom H. suis
eiwitten herkend door sera van muizen geïmmuniseerd met H. suis
hele cellysaat en beschermd tegen infectie werden geïdentificeerd met behulp van tweedimensionale (2D) gelelektroforese gevolgd door immunoblotting en LC-MS /MEVR. Sera van H. suis Catawiki - geïnfecteerde muizen werden ook opgenomen, omdat een infectie niet tot bescherming. Op basis van deze analyse heeft de immunoreactieve H. suis
urease subunit B (UreB) werd geselecteerd voor verder in vivo testen. Als een controle we onder de H. suis
neutrofiel activerend eiwit A (NAPA), die eerder is beschreven als een mogelijke virulentiefactor [9], maar niet door sera van muizen geïmmuniseerd met gehele-cellysaat herkend. Vervolgens de beschermende werkzaamheid tegen een H. suis
infectie van zowel subunit vaccins werd geëvalueerd en vergeleken met die van H. suis
lysaat gestandaardiseerde muismodel.
Materialen en werkwijzen Bacteriestam

In alle experimenten, H. suis stam
5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) gebruikt. Deze stam werd geïsoleerd uit het maagslijmvlies van een varken volgens de werkwijze beschreven door Baele et al methode. [10].
Dieren
Eén week voor het begin van de experimenten, vijf weken oude specifiek pathogeen -gratis vrouwelijke BALB /c muizen werden verkregen van een erkende fokker (HARLAN, Horst, Nederland). De dieren werden gehuisvest op gesteriliseerd houtkrullen in filter top kooien. Ze werden gevoed met een autoclaaf behandeld commerciële dieet (Teklad 2018S, HARLAN) en behaalde een autoclaaf water ad libitum
. Alle laboratorium dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care en de ethische commissie van de Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent.
Immunoproteomics van H. suis
twee-dimensionale gelelektroforese (2D-PAGE)
HS5 werd gekweekt zoals eerder [11] beschreven. Bacteriën werden geoogst door centrifugatie (5000 g
, 4 ° C gedurende 10 min) en vier keer gewassen met Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Totaal eiwitten (zowel oplosbare en onoplosbare eiwitten) werden geëxtraheerd in twee stappen met de ReadyPrep ™ Sequential Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Om goede 2D-PAGE resultaten te verkrijgen, werden de homogenaten behandeld met de juiste additieven (5 mg protease inhibitor cocktail, 1 ul DNAse I, 1 gl RNAse A, 10 pl fosfataseremmers PP2 en PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) ). Tenslotte werd de eiwitconcentratie bepaald met het RC DC
Protein Assay (Bio-Rad) en eiwitten werden opgeslagen bij -70 ° C tot verder gebruik. Een totaal van 100 ug HS5 eiwitten werden gerehydrateerd in 200 pl rehydratatie buffer (7 M ureum, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% carrier amfolyt pH3-4, 100 mM dithiothreïtol (DTT) en broomfenolblauw). Monsters werden passief geabsorbeerd in een ReadyStrip (11 cm, pH 3 tot pH 10, Bio-Rad) en iso-elektrisch focussen werd uitgevoerd in een Protean IEF kamer (Bio-Rad) worden uitgevoerd zoals eerder beschreven [12]. Na iso-elektrisch focussen, werden de stroken geëquilibreerd gedurende 15 min in 1,5% DTT in equilibratiebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,8 6 M ureum, 20% glycerol, 2% SDS), gevolgd door een equilibratie in 4% joodaceetamide in equilibratiebuffer. Gel electroforese werd uitgevoerd op een 10% SDS-PAGE TrisHCl behulp 150V gedurende 30 minuten, gevolgd door 200 V gedurende 1 uur uitgevoerd. Twee gelen werden parallel uitgevoerd: één werd gekleurd met Sypro® Ruby Protein Gel kleuring (Bio-Rad), terwijl de andere werd gebruikt voor immunoblotting (Western blotting zie hieronder). Voorafgaand aan kleuring werden de gelen gefixeerd in 10% MeOH, 7% azijnzuur. Na het kleuren werden H. suis
eiwitten zichtbaar gemaakt met de VersaDoc Imaging System (Bio-Rad)
Serum zwembaden
Drie pools van muizensera werden bij dit onderzoek:.

Sera van muizen geïmmuniseerd met H. suis
gehele cellysaat (hierna "-lysaat geïmmuniseerde muizen") (n = 10
). Deze dieren werden intranasaal geënt met tweemaal drie weken interval 100 ug HS5 lysaat + 5 ug choleratoxine (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lysaat werd bereid zoals hiervoor maar zonder definitieve filtratie van de bovenstaande vloeistof [6] is beschreven. Drie weken na de laatste immunisatie werd bloed afgenomen en sera werden samengevoegd. Dit immunisatieprotocol aangetoond (gedeeltelijk) bescherming biedt tegen H. suis
uitdaging om [6] en het beschermende effect werd hier bevestigd in een eerste experiment (gegevens niet getoond).

Sera van H. suis
geïnfecteerde muizen (hierna "geïnfecteerde muizen") (n = 10
). Deze dieren werden intragastrisch geïnoculeerd met 200 pL Brucella bouillon bij pH 5, met 10 ^{8 versbereide H. suis
bacteriën [11]. Vier weken na infectie werd bloed afgenomen en sera werden samengevoegd.}

Sera van negatieve controlemuizen (n = 10
). Deze dieren kregen HBSS intranasaal tweemaal met een interval van drie weken, gevolgd door intragastrische inoculatie met 200 pi Brucella bouillon bij pH 5 (4 weken na de laatste sham immunisatie). Na vier weken werd bloed afgenomen en sera werden samengevoegd.
Alle sera werden bewaard bij -70 ° C tot verder gebruik.
Western blotting
Eiwitten werden elektro-van gels op nitrocellulose membranen (Bio-Rad) zoals elders [12] beschreven. Membranen werden geblokkeerd in 5% magere melk in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (blokkerende buffer), gedurende de nacht (ON) met verdunde muizensera (1/100 in blokkerende buffer) bij kamertemperatuur (KT), gespoeld in PBS met 0,3% Tween-20 (wasbuffer) en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gestabiliseerd met geit anti-muis immunoglobuline G (IgG) mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd (1/1000 in blokkeerbuffer, Pierce, Rockford, IL, USA). Na een wasstap in wasbuffer, werd immunodetectie van eiwitten uitgevoerd door versterkte chemiluminescentie detectie met behulp van SuperSignal West Dura Extended Duur Substrate (Pierce). Eiwitpatronen werden gescand en gedigitaliseerd met de VersaDoc Imaging System. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.
In-gel eiwitvertering en identificatie door massaspectrometrie
in-gel digestie van eiwitten werd uitgevoerd zoals beschreven door Cheung et al. [13]. Voorafgaand aan massaspectrometrie de geïsoleerde peptiden werden gescheiden op een U3000 nano-High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) zoals eerder beschreven [14].
Identificatie van de peptiden werd uitgevoerd met een elektrospray ionisatie quadrupool time-of-flight massaspectrometrie (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA) zoals eerder beschreven [14]. Data-analyse werd uitgevoerd tegen de Helicobacter
eiwit databank van NCBI (146 612 inschrijvingen) met behulp van de in-house search engine Mascot Daemon (2.3, Matrix Science, Londen, UK). Er is een fout tolerant zoeken werd uitgevoerd met carbamidomethyl (C) als vaste modificatie. Carbamidomethyl (N-terminale) en oxidatie (M) werden als variabele wijzigingen. Peptide massa tolerantie en fragment massa tolerantie werd vastgesteld op 0,35 en 0,45 Da Da, respectievelijk. Maximaal twee miscleavages mochten. Eiwitten werden alleen beschouwd te kunnen worden geannoteerd als de betekenis was beneden 0,05 (p
< 0,05) en ten minste één peptide gaf de gewenste vette rode criteria van Mascot Daemon, wat aangeeft dat tenminste één peptide had rank 1 en betekenis onder 0,05.
eendimensionale gelelektroforese (1D-PAGE) en Western blotting van rUreB
1D-PAGE van 10 ug recombinant H. suis
urease-subeenheid B (rUreB) werd uitgevoerd zoals beschreven door van Steendam et al. [12]. Sera voorbereiding en Western blot analyse werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven.
Beschermende werkzaamheid van recombinant H. suis
eiwitten in een muizenmodel
Bereiding van recombinante UreB
Een fragment coderend voor het H. suis
UreB sequentie (GenBank locus tag HSUHS5_0285) werd geamplificeerd met PCR met gebruik van een Pwo polymerase met proofreading activiteit (Roche, Mannheim, Duitsland) vanaf het DNA van HS5 (voorwaartse primer: 5'-ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 "; omgekeerde primer: 5'-CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC-3 ') en gekloond in het eiwit expressievector pET-24d. De rUreB werd tot expressie gebracht in E. coli stam BL21
(DE3). De cellen werden gelyseerd door sonicatie (5 maal gedurende 30 s) in buffer die 50 mM Na.PO 4 pH 7, 0,5 M NaCl, 1 M DTT, 1% Triton X-100 en 1 mM PMSF. Na centrifugatie (4 ° C, 20 000 g
gedurende 30 min), werd rUreB gezuiverd uit de oplosbare fractie gebruik van Ni-affiniteitschromatografie in buffer bestaande uit 1 M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mM imidazool en 10% glycerol (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Zweden), gevolgd door gelfiltratie op een Superdex ™ 200 HR 16/60 kolom (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Na zuivering werd rUreB geanalyseerd middels SDS-PAGE en Western blot analyse met anti- hexahistidine tag-monoklonaal antilichaam (Icosagen Cell Factory Tartu, Estland). Het detergens Triton X-100 werd uit het gezuiverde rUreB verwijderd met Pierce Detergent Verwijdering spinkolommen (Pierce) volgens de instructies van de fabrikant. De eiwitconcentratie werd bepaald met de RC DC
proteïne assay (Bio-Rad).
Bereiding van recombinant Napa
Het eiwit werd tot expressie gebracht in de E. coli expressiesysteem
met Gateway® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) als volgt. Een fragment dat de H. suis
neutrofiel activerend eiwit A (NAPA) sequentie (GenBank locus tag HSUHS5_0014) werd geamplificeerd met PCR met gebruik van een Pwo polymerase met proofreading activiteit (Roche) vanaf het DNA van HS5 (voorwaartse primer: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 ', reverse primer: 5'TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3') en gekloneerd in de pENTR ™ /TEV /D-TOPO® vector en overgebracht in de pDEST17 ™ bestemmingsvector. De geselecteerde pDEST17-Napa plasmide werd getransformeerd naar de BL21-AI ™ E. coli Kopen en vervolgens bij 37 ° C gekweekt tot een OD 600 van 0,6-1,0 in Luria bouillon aangevuld met 50 ug /ml carbenicilline. Recombinant H. suis
NAPA (rNapA) expressie werd geïnduceerd door het toevoegen van 0,2% L- arabinose. Na 4 uur incubatie bij 37 ° C werden de cellen geoogst en geresuspendeerd in lysisbuffer: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lysozym, 20 ug /ml DNAse, 1 mM protease remmer (Sigma) en 1 mM MgCl 2. De cellen werden gelyseerd door sonicatie (5 maal gedurende 30 s). Celafval en insluitingslichamen werden geïsoleerd door centrifugeren bij 4 ° C (20 000 g
gedurende 30 min). De inclusielichamen werden vervolgens tweemaal op basis van het volgende protocol gewassen: de pellet in koude lysisbuffer gesuspendeerd, gesonificeerd 5 keer gedurende 30 s gevolgd door centrifugatie (4 ° C, 20 000 g
gedurende 30 min). De gewassen inclusielichamen werden opgelost in bindingsbuffer, pH 8 (6 M guanidine HCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 5 mM imidazool, 1 mM β-mercaptomethanol) door voorzichtig draaien gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Onoplosbaar materiaal werd verwijderd door centrifugeren bij hoge snelheid bij 4 ° C (100 000 g
gedurende 30 min). rNapA werd gezuiverd uit het geklaarde supernatant op een Ni-Sepharose-kolom (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) volgens de instructies van de fabrikant. rNapA werd geëlueerd met elutiebuffer, pH 8 (8 M ureum, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazool, en 1 mM β-mercaptoethanol) en ON gedialyseerd tegen PBS bij 4 ° C. Daarna rNapA werd geanalyseerd middels SDS-PAGE en eiwitconcentratie werd bepaald onder toepassing RC DC
Protein Assay (Bio-Rad).
Immunisatie en infectie experimenten Ondernemingen De proefopzet is samengevat in Figuur 1. Vijf groepen 10 muizen werden intranasaal geïnoculeerd met tweemaal 3 weken interval, telkens met 17,5 pi inoculum. In groepen 1, 2 en 3 bestaat het inoculum van HBSS met 5 ug CT, bevattende 30 ug rUreB, 30 ug en 100 ug rNapA HS5 lysaat, respectievelijk. Groepen 4 (-sham geïmmuniseerde groep) en 5 (negatieve controle groep) werden ingeënt met HBSS. Drie weken na de tweede intranasale immunisatie werd bloed verzameld door staart bloeden uit vijf dieren per groep en één week later, alle dieren, behalve de negatieve controlegroep werden intragastrisch geïnoculeerd met 200 pL Brucella bouillon bij pH 5 met 10 8 levensvatbare H. suis
bacteriën [11]. De negatieve controlegroep werd intragastrisch geënt met 200 pi Brucella bouillon bij pH5. Vier weken na intragastrische inoculatie werden de muizen gedood door cervicale dislocatie na isofluraan anesthesie (ISOFLO, Abbott, IL, USA). Van de dieren gedood, werd bloed afgenomen door hartpunctie steriele, gecentrifugeerd (1000 g
, 4 ° C, 10 min) en serum werd ingevroren bij -70 ° C tot verder gebruik. Magen uitgesneden en ontleed langs de grote curvatuur. De helft van de maag, met inbegrip antrum en fundus, werd onmiddellijk geplaatst in 1 ml Later RNA (Ambion, Austin, TE, USA) en bewaard bij -70 ° C voor verdere RNA- en DNA-extractie. Een longitudinale strook van de maag weefsel werd gesneden uit de slokdarm naar de twaalfvingerige darm langs de grote curvatuur voor histopathologisch onderzoek. Figuur 1 Experimentele ontwerp van de vaccinatie studie. Per groep 10 muizen werden intranasaal geïmmuniseerd met tweemaal 3 weken interval, telkens met 30 ug rUreB + 5 ug choleratoxine (CT); 30 ug rNapA + 5 ug CT, en 100 ug HS5 lysaat + 5 ug CT (groepen 1, 2 en 3, respectievelijk). Groepen 4 (-sham geïmmuniseerde groep) en 5 (negatieve controle groep) werden intranasaal ingeënt met HBSS. Drie weken na de tweede immunisatie werd bloed verzameld uit 5 muizen per groep en één week later muizen van groepen 1, 2, 3 en 4 werden intragastrisch geïnoculeerd met 108 levensvatbare H. suis
bacteriën. Groep 5 werd intragastrisch geïnoculeerd met HBSS. Vier weken na de maag liggen, werden de muizen gedood.
Kwantificering van H. suis
in de maag
Na ontdooien werden maag weefsels gehomogeniseerd (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Duitsland) in 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Nederland) en DNA werd geëxtraheerd uit de inter- en organische fase volgens instructies Tri Reagent® RT fabrikant. Het aantal bacteriën in de maag werd bepaald met de eerder beschreven H. suis
specifieke kwantitatieve real-time PCR (qPCR) [5].
Analyse van maag cytokinereactie
de expressieniveaus van IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17 en TNF-α werden beoordeeld door qPCR behulp cDNA gesynthetiseerd uit maagweefsel zoals eerder [15] beschreven. De drempelcyclus (Ct) waarden werden genormaliseerd op het geometrische gemiddelde van de Ct-waarden van de referentie genen waarna genormaliseerd mRNA niveaus werden berekend met de 2 -ΔΔCt methode [16]. Meet- serum antilichaamresponsen door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA)
Protein Detector ™ ELISA kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) werd gebruikt om rUreB-, rNapA- en HS5 lysaat specifiek IgG in het serum te evalueren. Kortom, 96 putjes met vlakke bodem (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA) werden bekleed met 2 pg /putje gezuiverd rNapA, 1 ug /putje gezuiverd rUreB of 1 ug /putje H. hele cellen suis
eiwitten verdund in 100 pl bekledingsbuffer (24 uur, 4 ° C). Na het blokkeren met 1% runderserumalbumine in PBS werd 100 ui 1/400 verdunde serum aan elk putje toegevoegd. Na verder wassen, 100 pl HRP-gelabeld anti-muis IgG (H + L) in een eindconcentratie van 50 ng per putje werd toegevoegd. Vijf minuten na het toevoegen van 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) (ABTS) peroxidase substraatoplossing, absorptie werd afgelezen bij 405 nm (OD 405 nm).
Histopathologisch onderzoek
de longitudinale maagweefsel strips werden gefixeerd in 4% fosfaat gebufferde formaline, verwerkt door standaardprocedures en ingebed in paraffine. Voor evaluatie van gastritis, hematoxyline - eosine (HE) gekleurde coupes van 5 urn werden blind gescoord gebaseerd op de mate van infiltrerende lymfocyten, plasmacellen en neutrofielen, met een visueel analoge schaal vergelijkbaar met de bijgewerkte Sydney System (op een schaal van 0- 3) [17] met de volgende specificaties voor elke gastritis score: 0 = geen infiltratie van mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen; 1 = milde diffuse infiltratie van mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen; 2 = matige diffuse infiltratie van mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen en /of de aanwezigheid van een of twee ontstekingen aggregaten; 3 = duidelijk diffuse infiltratie van mononucleaire en /of polymorfonucleaire cellen en /of de aanwezigheid van ten minste drie inflammatoire aggregaten.
Statistische analyse
normaliteit en homogeniteit van variantie gegevens werden geanalyseerd met behulp D'Agostino-Pearson en Shapiro- Wilk normaliteit testen. Significante verschillen in H. suis
kolonisatie en mRNA expressie van cytokine tussen groepen werden bepaald door het uitvoeren van one-way ANOVA analyse. meervoudige vergelijkingstest Bonferroni werd gebruikt als post-hoc bij gelijke varianties werd onderzocht. T3 post-hoc Dunnett werd gebruikt als er geen gelijke afwijkingen werden beoordeeld. OD 405 nm niveaus van ELISA en ontsteking histologische scores werden vergeleken door Kruskall-Wallis analyse, gevolgd door Mann-Whitney U Electronics Test. Voor de correlaties tussen de verschillende variabelen, werd Spearman's rho-coëfficiënt (ρ
) berekend. Prism5 GraphPad software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) werd gebruikt voor alle analyses. Statistisch significante verschillen tussen de groepen werden beschouwd bij p
< 0.05.
Resultaten
Immunoproteomics van H. suis
H. suis
eiwitten werden op 2D-PAGE gescheiden (Figuur 2a). Na 2D-immunoblotting met samengevoegde sera van geïmmuniseerde-lysaat (figuur 2b) of H. suis
geïnfecteerde dieren (figuur 2c), in totaal 19 immunoreactief eiwit spots geselecteerd. Deze plekken werden gekoppeld aan het eiwit spots die te zien in de parallelle 2D-PAGE (Figuur 2a). Weinig reactiviteit tegen H. suis
eiwitten werd waargenomen na infectie sera vergelijking met de hoge reactiviteit tegen sera van geïmmuniseerde muizen-lysaat. Als de vlek werd onderzocht met een pool van sera verkregen van de negatieve controle muizen, werden geen specifieke immuunreactieve eiwit plekken waargenomen (Extra file1). Spots van belang (n
= 19) werden uit de gel gesneden, verteerd en geïdentificeerd door middel van LC-MS /MS analyse. De gedetailleerde resultaten van deze eiwitten zijn samengevat in Tabel 1. Spots met de hoogste reactiviteit (spot 1-5) geïdentificeerd als ureB. H. suis
chaperonine GroEL, geïllustreerd als spots 9 en 10 in figuur 2a, toonde ook sterke hybridisatie met sera van geïmmuniseerde dieren-lysaat. Bovendien sera uit-lysaat geïmmuniseerde muizen vertoonden een sterke reactiviteit tegen urease accessoire eiwit (UreH) en de urease-subeenheid A (ureum) (spots 15-19), die minder uitgesproken in de geïnfecteerde groep. Zwakke reactiviteit tegen grote flagelline Flaa (spots 11-13) was aanwezig in zowel blots. Figuur 2 H. suis 2D-proteoom profiel (A) en Western blots van een duplicaat 2D-gel omgezet met samengevoegde sera van geïmmuniseerde muizen-lysaat (B) of van H. suis geïnfecteerde muizen (C). 100 ug totaal eiwit extract van H. suis
werd gescheiden door 2D-elektroforese met behulp van lineaire pH 3 tot 10 helling in de eerste dimensie en 10% TrisHCl SDS-PAGE in de tweede dimensie. De gescheiden eiwitten werden gedetecteerd door kleuring SYPRO®Ruby Protein. De boxed gebieden aangeven waar immuunreactieve antigenen uit de gel uitgesneden en onderworpen aan LC-MS /MS. Geïdentificeerde eiwitten worden aangeduid met de contante cijfers in Tabel 1. De vakken en nummers in het rood werden geïdentificeerd als ureB. De positie van moleculair gewicht (MW) wordt gegeven aan de rechterkant, en de pH wordt gegeven aan de onderkant.
Tabel 1 Immunoreactieve eiwitten van H. suis geïdentificeerd met LC-MS /MS
Spot no.1

Protein naam
NCBI ID2
Gene
PI3
MW3
No. geëvenaard peptiden
Mascot score4
Cov. (%) 5
1
urease subunit B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
117
1589
72
2
urease subunit B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
80
1042
58
threonyl-tRNA synthetase
EFX41598
GGW
6,34
69,315
7
186
60
3
urease subunit B
EFX42254
UreB

5.97
62,967
80
903
46 verhuur 4
urease subunit B
EFX42254
UreB
5,97
62,967
4
103
6
5
urease subunit B
EFX42254
UreB
5,97
62,967 verhuur 4
103
6
6
30S ribosomale eiwit S1
EFX42427
rpsA
8.29
64,051
23
625
28
Chinon-reactieve Ni /Fe hydrogenase, grote subunit
EFX41851
hydB
8.22
64,943
19
520
28
urease van H. heilmannii
AAA65722
8.86
25,844
8
258
26
7
-Methyl accepteren van chemotaxis eiwit
EFX43528
7.1
48,907
35
905
50
8
rek factor G
EFX41637
Fusa
5.15
77,242
57
1066
55
9
chaperonine GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10

• Karakterisering van genexpressieprofielen voor verschillende typen mestcellen samengebracht uit maag muis deelgebieden door een RNA-amplificatie method
• Klinisch-pathologische kenmerken en prognostische analyse van Lauren indeling in adenocarcinoom in China